Инсулиновые препараты, содержащие углеводы

 

Изобретение относится к медицине. Препараты инсулина превосходной физической стабильности включают растворенный и/или осажденный человеческий инсулин, или его аналог, или его производное и водорастворимый восстановленный или невосстанавливающий углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси. Изобретение обеспечивает получение препарата инсулина с повышенной физической стабильностью. 7 с. и 51 з.п.ф-лы. 3 ил., 1 табл.

Данное изобретение относится к водным препаратам инсулина, содержащим человеческий инсулин или его аналог, или производное, и эти препараты имеют превосходную физическую стабильность. Кроме того, данное изобретение относится к парентеральным готовым формам, включающим такие инсулиновые препараты, и к способу повышения физической стабильности инсулиновых препаратов.

Предшествующий уровень техники Диабет является общим термином для нарушений у человека, имеющих чрезмерное мочевыделение как при сахарном диабете, так и несахарном диабете. Сахарный диабет представляет метаболическое нарушение, при котором способность утилизировать глюкозу в большей или меньшей степени утеряна. Около 2% всего населения страдает от сахарного диабета.

С тех пор, как в 1920-х годах стали вводить инсулин, ведутся непрерывные исследования для улучшения лечения сахарного диабета. Для того чтобы помочь избежать экстремальных гликемических уровней, пациенты, страдающие от диабета, часто на практике используют многократную инъекционную терапию, при помощи которой инсулин вводят с каждым приемом пищи.

Для лечения сахарного диабета предложено и используется большое разнообразие препаратов инсулина, таких как регулярный инсулин, Semilente® инсулин, изофан инсулин, инсулин цинк суспензии, протамин цинк инсулин и Ultralente® инсулин. Поскольку пациентов, имеющих диабет, лечат инсулином в течение нескольких десятилетий, то для повышения безопасности и улучшения качества жизни пациентов существует потребность в улучшении инсулиновых препаратов. Некоторые из коммерчески доступных препаратов инсулина характеризуются быстрым началом действия, а другие препараты имеют относительно замедленное (отсроченное) начало (действия), но показывают более или менее пролонгированное действие. Быстродействующие препараты инсулина (препараты короткого действия) обычно представляют собой растворы инсулина, в то время как инсулиновые препараты замедленного действия могут быть суспензиями, содержащими инсулин в кристаллической и/или аморфной форме, осажденной путем добавления только солей цинка или добавлением протамина или комбинацией и того и другого. Кроме того, некоторые пациенты используют препараты, имеющие как быстрое начало действия, так и более пролонгированное действие. Такой препарат может быть раствором инсулина, в котором суспендированы кристаллы протамин-инсулина. Некоторые пациенты сами получают конечный препарат, смешивая раствор инсулина с препаратом в виде суспензии в отношении, требуемом пациенту, о котором идет речь.

Обычно инсулиновые препараты вводят с помощью подкожной инъекции. Для пациента важен профиль действия инсулинового препарата, который представляет собой действие инсулина на метаболизм глюкозы как функция времени от (момента) введения. В этом профиле между прочим время начала (действия), максимальное значение и суммарная (общая) продолжительность действия важны. Для пациентов существует потребность и спрос на целый ряд инсулиновых препаратов с различными профилями действий. Один пациент на протяжении одного дня может использовать препараты инсулина с сильно различающимися профилями действия. Требуемый профиль действия зависит, например, от времени дня и количества и состава пищи, принимаемой пациентом.

Важна также физическая стабильность препаратов инсулина вследствие обилия используемых устройств для инъекции типа ручек, таких как устройства, которые содержат Penfill® картриджи, в которых инсулиновые препараты хранятся до тех пор, пока весь картридж не опустеет. Это может продолжаться, по крайней мере, от 1 до 2 недель для устройств, содержащих картриджи 1,5-3,0 мл.

Предшествующий уровень Первая стабильная нейтральная суспензия инсулина была разработана Scott и Fischer (J. Pharmacol. Exp. Ther. 58 (1936), 78), которыми было обнаружено, что присутствие избытка протамина и соли цинка (2 мкг цинка на ME (IU) (международная Единица) инсулина) может стабилизировать протамин-инсулиновый препарат, описанный Hagedorn et al.: J. Am. Med. Assn. 106 (1936), 177-180.

Протамин-цинк инсулин, сделанный согласно фармакопеям США и Европы (United States или European Pharmacopoeias), содержит аморфный протамин-цинк инсулин, а также кристаллический протамин-цинк инсулин. Свежеприготовленный протамин-цинк инсулин содержит в основном аморфный осадок, который обычно частично трансформируется в кристаллические частицы при хранении, приводя к более замедленному действию.

Модификация полностью кристаллического протамин-цинк инсулина, обозначаемая NPH инсулин или изофан инсулин, была разработана и Rosenberg (см. Rep. Steno Mem. Hosp. Nord. Insulinlab. 1 (1946), 60; и Danish patent 64 708). Они обнаружили, что инсулин и протамин, вносимые вместе в пропорциях изофана при нейтральном значении рН в присутствии небольшого количества цинка и фенола или производных фенола, или предпочтительно м-крезола, будут образовывать аморфный осадок, который при стоянии постепенно, но полностью трансформируется в удлиненные тетрагональные кристаллы, ограниченные по концам пирамидальными гранями. Инсулин и оранжево-розовый протамин совместно кристаллизуются в массовом отношении, отвечающем приблизительно 0,09 мг протамин-сульфата на мг инсулина. Цинк в количестве, по крайней мере, 0,15 мкг на ME, и фенольного соединения в концентрации выше, чем 0,1%, является необходимым для получения тетрагональных кристаллов.

Ранее этот тип кристаллов получали, используя свиной и бычий инсулин из природных источников, но с 80-х годов используют также человеческий инсулин, полученный с помощью генной инженерии или полусинтетическим способом.

Человеческий инсулин состоит из двух полипептидных цепей, так называемых цепей А и В, которые содержат 21 и 30 аминокислот соответственно. Цепи А и В соединены друг с другом двумя цистиновыми дисульфидными мостиками. Инсулин из большинства других разновидностей (источников) имеет сходную структуру, но может не содержать тех же аминокислот в соответствующих положениях в цепях, как в человеческом инсулине.

Развитие способа, известного как генная инженерия, сделало возможным легко получить большое число соединений инсулина, подобных человеческому инсулину. В этих аналогах инсулина одна или несколько из аминокислот замещены другими аминокислотами, которые могут быть кодированы нуклеотидными последовательностями. Поскольку человеческий инсулин, как указано выше, содержит 51 аминокислотный остаток, то очевидно, что возможно большое число аналогов инсулина, и в самом деле было получено большое число аналогов с интересными свойствами. В растворах человеческого инсулина с концентрацией, представляющей интерес для инъекционного препарата, молекула инсулина присутствует в ассоциированной форме в виде гексамера (Brange et al. Diabetes Care 13, (1990), 923-954). После подкожной инъекции, как полагают, скорость абсорбции кровотоком зависит от размера молекулы, и было обнаружено, что аналоги инсулина с аминокислотными замещениями, которые противодействуют или ингибируют образование этого гексамера, имеют необычно быстрое начало действия (Brange et al.: Ibid). Это представляет большое терапевтическое значение для пациента, имеющего диабет. В кристаллах препаратов протамин инсулина пролонгированного действия, инсулин, как обнаружено, также находится в гексамерной форме (Balschmidt et al.: Acta Chryst. В47, (1991), 975-986).

Фармацевтические препараты, которые основаны на аналогах человеческого инсулина, например, известны из следующих документов: В WO 95/00550 описаны фармацевтические препараты на основе кристаллов инсулина, включающих Asp^B28 инсулин и протамин, которые проявляют быстрое начало действия и пролонгированную активность при введении in vivo. Кроме того, кристаллы могут содержать ионы цинка и фенол и/или м-крезол. В качестве средства изотоничности к препаратам добавляют глицерин.

В US 5 461 031 раскрываются различные фармацевтические готовые формы для парентерального применения, которые включают быстродействующий аналог мономера инсулина, цинк, протамин и фенольное производное. Готовые формы, кроме того, содержат глицерин, который действует как средство изотоничности.

В US 5 474 978 раскрывается быстродействующая готовая форма для парентерального применения, включающая комплекс гексамерного аналога человеческого инсулина, состоящий из шести аналогов мономерного инсулина, ионов цинка и, по крайней мере, трех молекул фенольного производного. Предпочтительным средством изотоничности является глицерин.

К сожалению, инсулин имеет тенденцию к образованию нерастворимых и биологически неактивных фибрилл путем нековалентной полимеризации (сравни, например, Jens Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag, 1987 и ссылки там). Образование фибрилл ускоряется при повышенных температурах, например выше 30^oС, и сопутствующих действиях. Этот процесс фибриллообразования, которого очень трудно избежать, ставит вопрос о верхнем пределе периода времени, в течение которого препарат инсулина может храниться, и, следовательно, об объеме картриджа Penfills®.

Поскольку образование фибрилл обычно требует мономеризации инсулина, аналоги инсулина, которые более-менее подвержены образованию ди- и гексамеров, приводят к препаратам с меньшей физической стабильностью вследствие фибриллообразования.

Таким образом, целью данного изобретения является разработка препарата инсулина, включающего человеческий инсулин или его аналог или производное с повышенной физической стабильностью.

Согласно изобретению, эта цель достигается путем создания водного инсулинового препарата, включающего растворенный и/или осажденный человеческий инсулин или его аналог или его производное, и водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

Краткое описание фиг.1-3: - фиг. 1 представляет микрофотографию (х1000 увеличение) готовой формы данного изобретения, включающего Asp^B28 человеческий инсулин-протамин кристаллы и маннит; - фиг. 2 представляет микрофотографию (х1000 увеличение) готовой формы данного изобретения, включающего человеческий инсулин-протамин кристаллы и маннит; - фиг.3 представляет графическое изображение профиля действия препарата данного изобретения, содержащего как растворенный, так и кристаллический Asp^B28 человеческий инсулин, и препарата, содержащего как растворенный, так и кристаллический человеческий инсулин. Оба препарата, кроме того, содержат маннит. График представляет ответ глюкозы в крови после инъекции у свиней. На фиг. 3 показано, что быстрое начало действия сохраняется для высокостабильного препарата Asp^B28 человеческого инсулина.

Сущность изобретения Определения Используемый здесь термин "аналог человеческого инсулина" означает человеческий инсулин, в котором одна или несколько аминокислот удалены и/или замещены другими аминокислотами, включая некодируемые аминокислоты, или человеческий инсулин, включающий дополнительные аминокислоты, т.е., более чем 51 аминокислоту.

Используемый здесь термин "производное человеческого инсулина" означает человеческий инсулин или его аналог, в котором, по крайней мере, один органический заместитель связан с одной или несколькими аминокислотами.

В данном контексте термин "водорастворимый" соответствует растворимости в воде, по крайней мере, около 10 ммоль/л, предпочтительно, по крайней мере, 50 ммоль/л при температуре 20^oС.

Термины "углевод", "восстановленный углевод", "моносахарид", "дисахарид" и сложноэфирные и эфирные производные таких соединений используют в соответствии с указанием К. A. Jensen in "Grundrids af den organiske kemi", Almen Kemi III, 1. Ed., Jul. Gjellrups forlag, 1969, pp. 299-316.

В данном контексте выражение "невосстанавливающийся углевод" означает углевод, который в основном не способен взаимодействовать с аминогруппами инсулина в препаратах данного изобретения с образованием гликозилированного (glycated) инсулина. Это определение включает углеводы, в которых карбонильная(ые) группа(ы) инактивирована(ы) или блокирована(ы), например, при помощи образования ангидрида или дериватизации.

В одном аспекте данное изобретение относится к водному препарату инсулина, включающему: растворенный и/или осажденный человеческий инсулин или его аналог и/или производное, и
от 100 до 400 мМ, предпочтительно от 150 до 250 мМ, более предпочтительно от 180 до 230 мМ водорастворимого восстановленного или невосстанавливающегося углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимого невосстанавливающегося сложноэфирного и/или эфирного производного углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

В другом аспекте данное изобретение относится к водному препарату инсулина, включающему:
растворенный и осажденный человеческий инсулин или его аналог и/или производное, и
водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

В еще одном аспекте воплощения данное изобретение относится к водному препарату аналога инсулина, включающему:
растворенный и/или осажденный аналог человеческого инсулина и водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

Предпочтительные варианты воплощения изобретения
Углевод или производное углевода, используемое в препарате инсулина данного изобретения, преимущественно содержит от 5 до 18 атомов углерода в основной структуре углевода и его предпочтительно выбирают из следующих соединений:
i) моносахариды, выбранные из группы невосстанавливающихся альдоз или кетоз, предпочтительно невосстанавливающихся альдотетроз, кетотетроз, альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз и кетогексоз, более предпочтительны невосстанавливающиеся альдопентозы, кетопентозы, альдогексозы и кетогексозы;
ii) восстановленные моносахариды, т.е. многоатомные спирты, такие как альдитолы, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из восстановленных форм альдотетроз, кетотетроз, альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз и кетогексоз, более предпочтительно из восстановленных форм альдопентоз, кетопентоз, альдогексоз и кетогексоз (т.е. пентитолы и гекситолы);
iii) невосстанавливающиеся дисахариды, предпочтительно выбранные из невосстанавливающихся дигексоз.

Конкретными примерами подходящих восстановленных или невосстанавливающихся углеводов являются: маннит, сорбит, ксилит, инозит, сахароза и трегалоза.

Предпочтительными соединениями от i) до iii) являются маннит и сорбит, причем наиболее предпочтительным является маннит.

Предпочтительными сложноэфирными и эфирными производными являются сложноэфирные производные C₁-C₄ жирных кислот и C₁-C₄ алкильные эфирные производные соответственно.

В конкретном варианте воплощения данного изобретения препарат инсулина дополнительно включает галогенид, предпочтительно хлорид, более предпочтительно хлорид натрия. Было показано, что присутствие галогенида приводит к препаратам, имеющим более высокую физическую стабильность.

Поскольку препараты инсулина, включающие быстродействующие аналоги человеческого инсулина, обычно демонстрируют весьма низкую физическую стабильность, данное изобретение, в частности, имеет преимущества в связи с препаратами, включающими такие аналоги. Таким образом, препарат инсулина, согласно данному изобретению, предпочтительно включает один или несколько быстродействующих аналогов человеческого инсулина, в частности, аналоги, в которых положение В28 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положение В29 представляет Lys или Pro; или дез(В28-В30), или дез(В27) или дез(В30)человеческий инсулин. Инсулиновый аналог предпочтительно выбирают из аналогов человеческого инсулина, в которых положение В28 представляет Asp или Lys, и положение В29 представляет Lys или Pro. Наиболее предпочтительными аналогами являются Аsр^B28 человеческий инсулин или Lys^B28Pro^B28 человеческий инсулин.

В другом варианте воплощения инсулиновый препарат согласно изобретению включает инсулиновое производное, имеющее пролонгированный профиль действия, такие как инсулины, имеющие один или несколько липофильных заместителей. Предпочтительными липофильными инсулинами являются ацилированные инсулины, включая инсулины, описанные в WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S), например, производные человеческого инсулина, в которых ε-аминогруппа Lys^B29 содержит ацильный заместитель, который включает, по крайней мере, 6 углеродных атомов.

Предпочтительными производными инсулина являются следующие:
B29-Nε-миpиcтoил-дeз(В30)-человеческий инсулин, B29-Nε-миристоил человеческий инсулин, B29-Nε-пaльмитoил человеческий инсулин, B28-Nε-миpиcтoил Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин, B28-Nε-пaльмитoил Lys^B28Pro^B29-человеческий инсулин, В30-Nε-миристоил-Thr^B29Lys^B30-человеческий инсулин, В30-Nε-пальмитоил-Тhr^B28Lys^B30-человеческий инсулин, B29-Nε-(N-пальмитоил-γ-глутамил)-дез(В30)-человеческий инсулин, B29-Nε-(N-литохолил-γ-глутамил)-дез(В30)-человеческий инсулин и B29-Nε-(ω-карбоксигептадеканоил)-дез(В30)-человеческий инсулин; причем наиболее предпочтительным является B29-Nε-миpиcтoил-дeз(В30)-человеческий инсулин.

В предпочтительном варианте воплощения препарат инсулина включает как растворенный, так и осажденный, предпочтительно кристаллический инсулин или аналог инсулина, или производное в массовом отношении от 1:99 до 99:1, предпочтительно от 20:80 до 80:20, более предпочтительно от 30:70 до 70:30.

В этом варианте воплощения данного изобретения препарат инсулина преимущественно включает кристаллы, включающие инсулин или аналог инсулина и протамин, и необязательно цинк и/или фенольное соединение, такое как фенол, м-крезол или смесь их. Количество протамина в кристаллах предпочтительно соответствует от 0,20 до 0,40 мг основания протамина/100 ME инсулина или аналога инсулина. Отношение протамина к инсулину в кристаллах более предпочтительно соответствует изофановому отношению. Цинк предпочтительно присутствует в количестве от 10 до 40 мкг Zn/100 ME инсулина, более предпочтительно от 15 до 35 мкг Zn/100 ME инсулина. Фенол и м-крезол соответственно предпочтительно присутствуют в количестве, соответствующем от 0 до 4 мг/мл. Однако смесь от 1,4 до 2,0 мг/мл м-крезола и от 0,6 до 2,0 мг/мл фенола наиболее предпочтительна.

Предпочтительный препарат инсулина согласно изобретению включает:
а) от 60 до 3000 нмоль/мл, предпочтительно от 240 до 1200 нмоль/мл, человеческого инсулина или аналога инсулина и/или производного инсулина;
b) восстановленный или невосстанавливающийся углевод, предпочтительно маннит, в концентрации от 100 до 400 мМ, предпочтительно от 150 до 250 мМ, более предпочтительно от 180 до 230 мМ;
c) хлорид, предпочтительно хлорид натрия, в концентрации от 0 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ, более предпочтительно от 5 до 20 мМ; и
d) физиологически толерантный буфер, предпочтительно фосфатный буфер, такой как динатрий фосфат дигидрат, в количестве от 1 до 4 мг/мл.

Препарат данного изобретения может, кроме того, содержать одно или несколько соединений, обычно используемых в качестве средств изотоничности, такого как глицерин.

Значение рН препарата инсулина предпочтительно находится в диапазоне от 7,0 до 7,8.

Кроме того, данное изобретение относится к способу получения препарата инсулина, содержащего как растворенный, так и осажденный аналог инсулина, и этот способ включает следующие стадии:
a) получение кислого раствора, включающего аналог человеческого инсулина, цинк, и субизофанового (subisophanic) количества протамина;
b) получение щелочного раствора, включающего вещество, которое действует как буфер при физиологическом рН;
где, по крайней мере, один из вышеупомянутых растворов дополнительно включает фенольное соединение;
c) смешение кислого и щелочного растворов и необязательно доведение рН до значения от 6,5 до 8,0, предпочтительно от 7,0 до 7,8; и
d) выдерживание полученной суспензии для осаждения.

С помощью этого способа препарат инсулина, содержащий как растворенный, так и осажденный аналог инсулина, можно получить очень простым способом. Кроме того, осадок полученной суспензии обычно содержит кристаллы в форме стержней, которые полезны в так называемых PreMix инсулиновых препаратах.

Массовое отношение аналога инсулина к протамину в растворе стадии а) предпочтительно подбирают таким образом, чтобы получить массовое отношение растворенного к осажденному аналогу инсулина в конечном продукте в диапазоне от 1:99 до 99:1, предпочтительно от 20:80 до 80:20, более предпочтительно от 30: 70 до 79:30. В частности, раствор стадии а) предпочтительно включает от 120 до 6000 нмоль/мл аналога инсулина и от 0,01 до 5,0 мг/мл протамина.

Раствор стадии а), кроме того, включает цинк, предпочтительно в количестве, соответствующем 10-40 мкг цинка/100 ME инсулина, более предпочтительно 15-35 мкг цинка/100 ME инсулина.

В предпочтительном варианте воплощения раствор а) и/или раствор b) включает хлорид, предпочтительно хлорид натрия в количестве, соответствующем от 0 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ, более предпочтительно от 5 до 20 мМ в конечном продукте.

Значение рН кислого раствора стадии а) предпочтительно ниже 5, более предпочтительно - от 2 до 3,5.

Аналогом инсулина предпочтительно является человеческий инсулин, в котором положение В28 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положение В29 представляет Lys или Pro; или дез(В28-ВЗ0), дез(В27) или дез(В30)человеческий инсулин, более предпочтительно Asp^B28 человеческий инсулин или Lys^B28Pro^B29 человеческий инсулин, еще более предпочтительно Asp^B28 человеческий инсулин.

Фенольным соединением, используемым в растворе стадии а) и/или стадии b), предпочтительно является фенол, м-крезол или их смесь.

Преимущественно раствор стадии а) и/или стадии b) дополнительно включает водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленный углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

Указанный углевод или производное углевода предпочтительно содержит от 5 до 18 углеродных атомов в основной структуре углевода.

В конкретном предпочтительном варианте воплощения раствор стадии а) и/или стадии b) включает маннит, сорбит, ксилит, инозит, трегалозу, сахарозу или любую их смесь, предпочтительно маннит и/или сорбит, более предпочтителен маннит.

Буферным веществом, используемым в щелочном растворе стадии b), предпочтительно является физиологически толерантный буфер, предпочтительно фосфатный буфер, более предпочтительно динатрий фосфат дигидрат.

Осажденный аналог инсулина находится предпочтительно в форме кристаллов, включающих инсулиновый аналог и протамин.

Полученную суспензию в стадии d) оставляют предпочтительно при температуре в диапазоне от 5 до 40^oС, предпочтительно от 20 до 36^oС, еще более предпочтительно от 30 до 34^oС для осаждения.

Далее это изобретение иллюстрируется нижеследующими примерами, которые, однако, не следует рассматривать как ограничивающие его.

ПРИМЕР I
Препарат 1
Препарат инсулина, содержащий как растворенный, так и кристаллический Asp^B28 человеческий инсулин, получают следующим образом:
Раствор А:
Раствор Asp^B28 человеческого инсулина при концентрации 200 МЕ/мл получают растворением 76,5 мг Asp^B28 человеческого инсулина в воде, добавляя в нее 326 мкл 0,2 н. хлористо-водородной кислоты и 163 мкл раствора хлорида цинка (0,4 мг/мл). Затем 6,35 мг протамин-сульфата в растворе добавляют к раствору инсулина при перемешивании и к этому раствору при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола и 455 мг маннита. рН полученного прозрачного раствора доводят до 2,6-2,9 и добавляют воду до 10 мл. Раствор уравновешивают при 28-32^oС.

Раствор В:
25 мг дигидрата динатрийфосфата растворяют в воде для инъекции. 17,2 мг м-крезола, 15 мг фенола и 455 мг маннита добавляют при перемешивании. рН полученного прозрачного раствора доводят до 9, и добавляют воду до 10 мл. Раствор уравновешивают при 28-32^oС.

Смешение раствора А и В:
Раствор В добавляют к раствору А, и рН повторно доводят до 7,30. Полученную суспензию оставляют при 30^oС в течение 6 дней для кристаллизации.

В полученном препарате массовое отношение осажденного к растворенному инсулину составляет 70:30.

Препарат вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕР II
Препарат 2
Инсулиновый препарат, содержащий как растворенный, так и кристаллический Asp⁸²⁸ человеческий инсулин, получают следующим образом:
i) Кристаллическая фракция
Раствор А:
Раствор Asp⁸²⁸ человеческого инсулина при концентрации 200 МЕ/мл получают растворением 190,3 мг Asp⁸²⁸ человеческого инсулина в воде, добавляя 813 мкл 0,2 н. хлористоводородной кислоты и 410 мкл раствора хлорида цинка (0,4 мг/мл). Затем 16,1 мг протамин-сульфата в растворе добавляют к раствору инсулина при перемешивании, и к этому раствору при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 43,0 мг м-крезола, 37,5 мг фенола и 909 мг маннита, и 14,6 мг хлорида натрия. рН полученного прозрачного раствора доводят до 2,6-2,9 и добавляют воду до 22 мл. Раствор уравновешивают при 32^oС.

Раствор В:
62,4 мг дигидрата динатрийфосфата растворяют в воде. 43,0 мг м-крезола, 37,5 мг фенола и 909 мг маннита и 14,6 мг хлорида натрия добавляют при перемешивании. рН полученного прозрачного раствора доводят до 9 и добавляют воду до 22 мл. Раствор уравновешивают при 32^oС.

Смешение раствора А и В:
Раствор В добавляют к раствору А и рН повторно доводят до 7,30 и добавляют воду до 50 мл. Полученную суспензию оставляют при 32^oС в течение 4 дней для кристаллизации.

В полученном препарате массовое отношение осажденного к растворенному инсулину составляет 70:30.

Препарат вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕРЫ III
Препараты 3-6
Препараты инсулина, содержащие как растворенный, так и кристаллический Asp^B28 человеческий инсулин, получали, как описано в Примере II, за исключением того, что количество маннита, используемого в растворе А и В, составляло 818, 1005, 1047 и 1137 мг соответственно.

Препараты вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕРЫ IV
Препарат 7
Препарат инсулина, содержащий как растворенный, так и кристаллический Lys^B26 Pro^B29 человеческий инсулин, получают следующим образом:
1) Кристаллическая фракция
Раствор А:
Раствор Lys^B28 Pro^B29 человеческого инсулина при концентрации 200 МЕ/мл получают суспендированием 69,7мг Lуs^B28Pro^B29 человеческого инсулина в воде. К этому раствору при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 16,0 мг м-крезола, 6,5 мг фенола и 364 мг маннита и 25,1 мг дигидрата динатрийфосфата. Затем добавляют 50 мкл раствора хлорида цинка (10 мг/мл). рН полученного прозрачного раствора вновь доводят до 7,40 и добавляют воду до 10 мл. Раствор уравновешивают при 15^oС.

Раствор В:
Раствор протамин-сульфата получают растворением 7,61 мг протамин-сульфата и 25,1 мг дигидрата динатрийфосфата в воде. 16,0 мг м-крезола, 6,5 мг фенола и 364 мг маннита добавляют во время смешения. Этот раствор добавляют к раствору протамин-сульфата при перемешивании. рН полученного прозрачного раствора вновь доводят до 7,40 и добавляют воду до 10 мл. Раствор уравновешивают при 15^oС.

Смешение раствора А и В:
Раствор В добавляют к раствору А и рН повторно доводят до 7,30. Полученную суспензию оставляют при 15^oС в течение 3 дней для кристаллизации.

ii) Растворенная фракция
Раствор Lys^B28 Pro^B29 человеческого инсулина получают растворением 34,9 мг Lys^B28Pro^B29 человеческого инсулина в воде, добавляя туда 33 мкл 1 н. хлористоводородной кислоты и 25 мкл раствора хлорида цинка (10 мг/мл). Затем к раствору инсулина при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 26,1 мг дигидрата натрийфосфата, 6,5 мг фенола, 6,0 мг м-крезола и 364 мг маннита. рН полученного прозрачного раствора доводят до 7,3 и добавляют воду до 10 мл.

6 мл растворенной фракции добавляют к 14 мл кристаллической фракции и рН доводят до 7,30.

В полученном препарате массовое отношение осажденного к растворенному инсулину составляло 70:30.

Препарат вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕР V
Препарат 8
Инсулиновый препарат, содержащий как растворенный, так и кристаллический человеческий инсулин, получают следующим образом:
i) Кристаллическая фракция
Раствор А:
Раствор человеческого инсулина получают растворением 69,7 мг человеческого инсулина в воде, добавляя туда 65 мкл 1н. хлористоводородной кислоты и 26 мкл раствора хлорида цинка (10 мг/мл). Затем 6,0 мг протамин-сульфата в растворе добавляют к раствору инсулина при перемешивании и к раствору при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 15,0 мг фенола и 17,2 мг м-крезола. рН полученного прозрачного раствора доводят до 2,7-3,2, и добавляют воду до 10 мл.

Раствор В:
24,9 мг дигидрата натрийфосфата растворяют в воде. 15 мг фенола, 17,2 мг м-крезола, 728 мг маннита и 11,7 мг хлорида натрия добавляют во время смешения. рН полученного прозрачного раствора доводят до 9 и добавляют воду до 10 мл.

Раствор В добавляют к раствору А и рН доводят до 7,30. Полученную суспензию оставляют при 22-24^oС до следующего дня.

ii Растворенная фракция
Раствор человеческого инсулина получают растворением 34,9 мг человеческого инсулина в воде, добавляя 33 мкл 1 н. хлористоводородной кислоты и 13 мкл раствора хлорида цинка (10 мг/мл). Затем к раствору инсулина при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 12,5 мг дигидрата натрийфосфата, 15 мг фенола, 17,2 мг м-крезола и 364 мг маннита и 5,8 мг хлорида натрия. рН полученного прозрачного раствора доводят до 7,3 и добавляют воду до 10 мл.

6 мл растворенной фракции добавляют к 14 мл кристаллической фракции и рН доводят до 7,30.

В полученном препарате массовое отношение осажденного к растворенному инсулину составляло 70:30.

Препарат вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕР VI
Препарат 9
Препарат инсулина, содержащий как растворенный, так и кристаллический Asp^B28 человеческий инсулин, получают следующим образом:
Раствор А:
Раствор Asp^B28 человеческого инсулина при концентрации 200 МЕ/мл получают растворением 189,9 мг Asp^B28 человеческого инсулина в воде, добавляя 163 мкл 1 н. хлористоводородной кислоты и 163,5 мкл раствора хлорида цинка (10 мг/мл). Затем 11,5 мг протамин-сульфата в растворе добавляют к раствору инсулина при перемешивании и к этому раствору при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 44,3 мг м-крезола, 38,6 мг фенола и 1048 мг маннита, и 7,3 мг хлорида натрия. рН полученного прозрачного раствора доводят до 2,6-2,9 и добавляют воду до 25 мл. Раствор уравновешивают при 22-24^oС.

Раствор В:
62,3 мг дигидрата динатрийфосфата растворяют в воде. 44,3 мг м-крезола, 38,6 мг фенола и 1048 мг маннита и 7,3 мг хлорида натрия добавляют во время смешения. рН полученного прозрачного раствора доводят до 9 и добавляют воду до 25 мл.

Раствор уравновешивают при 22-24^oС.

Смешение раствора А и В:
Раствор В добавляют к раствору А, и рН повторно доводят до 7,30. Полученную суспензию оставляют при 32^oС в течение 2 дней для кристаллизации.

В полученном препарате массовое отношение осажденного к растворенному инсулину составляет 50:50.

Препарат вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕР VII (сравнительный)
Препарат 10
Препараты инсулина, содержащие как растворенный, так и кристаллический Asp^B28 человеческий инсулин, получают следующим образом:
Раствор Asp^B28 человеческого инсулина при концентрации 200 МЕ/мл получают растворением 76,5 мг Asp^B28 человеческого инсулина в воде, добавляя 326 мкл 0,2 н. хлористоводородной кислоты и 163 мкл раствора хлорида цинка (0,4 мг/мл). Затем 6,35 мг протамин-сульфата в растворе добавляют к раствору инсулина при перемешивании, и к этому раствору при перемешивании добавляют смесь, состоящую из 17,2 мг м-крезола, 15,0 мг фенола и 160 мг глицерина. рН полученного прозрачного раствора доводят до 2,6-2,9 и добавляют воду до 10 мл. Раствор уравновешивают при 28-32^oС.

Раствор В:
25 мг дигидрата динатрийфосфата растворяют в воде для инъекции. 17,2 мг м-крезола, 15,0 мг фенола и 160 мг глицерина добавляют во время смешения. рН полученного прозрачного раствора доводят до 9 и добавляют воду до 10 мл. Раствор уравновешивают при 28-32^oС.

Раствор В добавляют к раствору А и рН повторно доводят до 7,30. Полученную суспензию оставляют при 28-32^oС в течение 2 дней для кристаллизации.

В полученном препарате массовое отношение осажденного к растворенному инсулину составляет 70:30.

Препарат вводят в 1,5 миллилитровые Penfill® картриджи.

ПРИМЕР VIII
ТЕСТЫ НА ФИЗИЧЕСКУЮ НАГРУЗКУ
5 образцов каждого препарата инсулина вводят в Penfill® картриджи и подвергают следующему тесту на физическую нагрузку:
Penfill® картриджи фиксируют на роторе, который помещают в инкубатор, и подвергают вращению вокруг оси (на 360^o) в течение 4 ч в день с частотой 30 об/мин и при постоянной температуре 37±2^oС. Penfill® картриджи хранят при температуре 37±2^oС, когда их не вращают.

Penfill® картриджи проверяют макроскопически 5 раз в неделю и изменения внешнего вида состава отмечают согласно следующим принципам:
i) картриджи, содержащие белую суспензию, которая способна к повторному суспендированию при перемешивании и свободна от комков и гранул, классифицируют как "нефибриллированные";
ii) картриджи, содержащие суспензию с комками и/или гранулами, которые повторно не суспендируются при перемешивании и/или осаждаются на стенке картриджа, называют "фибриллированными". Это подтверждается путем добавления 6 мкл 6 н. НСl в картридж: фибрилированные картриджи визуально не становятся прозрачными после добавления кислоты.

Вращение картриджей проводят до тех пор, пока все образцы не фибриллируются.

Результаты суммированы в таблице.

Формула изобретения

1. Водный препарат инсулина, включающий растворенный и/или осажденный человеческий инсулин, или его аналог, и/или его производное и от 100 до 400 мМ, предпочтительно от 150 до 250 мМ, более предпочтительно от 180 до 230 мМ водорастворимого восстановленного или невосстанавливающегося углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимого невосстанавливающегося сложноэфирного и/или эфирного производного углевода, или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

2. Водный препарат инсулина по п. 1, отличающийся тем, что указанный углевод или производное углевода содержит от 5 до 18 углеродных атомов в основной структуре углевода.

3. Водный препарат инсулина по п. 2, отличающийся тем, что включает маннит, сорбит, ксилит, инозит, трегалозу, сахарозу или любую их смесь, предпочтительно маннит и/или сорбит, более предпочтительно маннит.

4. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что дополнительно включает галогенид, предпочтительно хлорид, более предпочтительно хлорид натрия.

5. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что включает аналог человеческого инсулина, где положение В28 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положение В29 представляет Lys или Pro; или дез (В28-В30), дез (В27) или дез (В30) человеческий инсулин.

6. Водный препарат инсулина по п. 5, отличающийся тем, что включает аналог человеческого инсулина, где положение В28 представляет Asp или Lys и положение В29 представляет Lys или Pro, предпочтительно Asp^В28-человеческий инсулин или Lys^В28Pro^В29-человеческий инсулин.

7. Водный препарат инсулина по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что включает производное человеческого инсулина, имеющее один или несколько липофильных заместителей, предпочтительно ацилированный инсулин.

8. Водный препарат инсулина по п. 7, отличающийся тем, что включает производное человеческого инсулина, выбранное из группы, состоящей из B29-Nε-миpиcтoил-дeз (В30)-человеческого инсулина, B29-Nε-миристоил человеческого инсулина, B29-Nε-пaльмитoил-человеческого инсулина, B28-Nε-миpиcтoил Lys^В28Pro^В29-человеческого инсулина, B28-Nε-пальмитоил Lys^В28Pro^В29-человеческого инсулина, В30-Nε-миристоил-Thr^В29Lys^В30-человеческого инсулина, B30-Nε-пaльмитoил-Thr^В29Lys^В30-человеческого инсулина, B29-Nε-(N-пальмитоил-γ-глутамил)-дез (В30)-человеческого инсулина, B29-Nε-(N-литoxoлил-γ-глyтaмил)-дeз (В30)-человеческого инсулина и B29-Nε-(ω-кapбoкcигeптaдeкaнoил)-дeз (В30)-человеческого инсулина, предпочтительно B29-Nε-миpиcтoил-дeз (В30)-человеческого инсулина.

9. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что включает кристаллы, включающие человеческий инсулин, или его аналог, или его производное и протамин.

10. Водный препарат инсулина по п. 9, отличающийся тем, что кристаллы дополнительно включают цинк и, необязательно, фенольное соединение, предпочтительно фенол, м-крезол или их смесь.

11. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что включает растворенный и осажденный, предпочтительно кристаллический, инсулин или аналог инсулина при массовом отношении от 1: 99 до 99: 1, предпочтительно от 20: 80 до 80: 20, более предпочтительно от 30: 70 до 70: 30.

12. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что включает от 60 до 3000 нмоль/мл, предпочтительно от 240 до 1200 нмоль/мл человеческого инсулина, или аналога инсулина, или производного.

13. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что включает от 0 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ, более предпочтительно от 5 до 20 мМ хлорида, предпочтительно хлорида натрия.

14. Водный препарат инсулина по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что дополнительно включает физиологически толерантный буфер, предпочтительно фосфатный буфер.

15. Водный препарат инсулина, включающий растворенный и осажденный человеческий инсулин, или его аналог, и/или его производное и водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси,
16. Водный препарат инсулина по п. 15, отличающийся тем, что указанный углевод или производное углевода содержит от 5 до 18 углеродных атомов в основной структуре углевода.

17. Водный препарат инсулина по п. 16, отличающийся тем, что включает маннит, сорбит, ксилит, инозит, трегалозу, сахарозу или любую их смесь, предпочтительно маннит и/или сорбит, более предпочтительно маннит.

18. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-17, отличающийся тем, что дополнительно включает галогенид, предпочтительно хлорид, более предпочтительно хлорид натрия.

19. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-18, отличающийся тем, что включает аналог человеческого инсулина, где положение В28 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положение В29 представляет Lys или Pro; или дез (В28-В30), дез (В27) или дез (В30) человеческий инсулин.

20. Водный препарат инсулина по п. 19, отличающийся тем, что включает аналог человеческого инсулина, где положение В28 представляет Asp или Lys и положение В29 представляет Lys или Pro, предпочтительно Asp^В28-человеческий инсулин или Lys^В28Pro^В29-человеческий инсулин.

21. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-18, отличающийся тем, что включает производное человеческого инсулина, имеющее один или несколько липофильных заместителей, предпочтительно ацилированный инсулин.

22. Водный препарат инсулина по п. 21, отличающийся тем, что включает производное человеческого инсулина, выбранное из группы, состоящей из B29-Nε-миpиcтoил-дeз(B30)-чeлoвeчecкoгo инсулина, B29-Nε-миристоил-человеческого инсулина, B29-Nε-пaльмитoил-человеческого инсулина, B28-Nε-миpиcтoил Lys^В28Pro^В29-человеческого инсулина, B28-Nε-пальмитоил Lys^В28Pro^В29-человеческого инсулина, В30-Nε-миристоил-Thr^В29Lys^В30-человеческого инсулина, В30-Nε-пальмитоил-Тhr^В29Lуs^В30-человеческого инсулина, B29-Nε-(N-пaльмитoил-γ-глyтaмил)-дeз(B30)-человеческого инсулина, B29-Nε-(N-литoxoлил-γ-глyтaмил)-дeз(B30)-человеческого инсулина и B29-Nε-(ω-кapбoкcигeптaдeкaнoил)-дeз(B30)-человеческого инсулина, предпочтительно В29-Nε-миристоил-дез(В30)-человеческого инсулина.

23. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-22, отличающийся тем, что включает кристаллы, включающие инсулин, аналог инсулина или производное инсулина, и протамин.

24. Водный препарат инсулина по п. 23, отличающийся тем, что кристаллы дополнительно включают цинк и, необязательно, фенольное соединение, предпочтительно фенол, м-крезол или их смесь.

25. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-24, включающий растворенный и осажденный, предпочтительно кристаллический, инсулин или инсулиновый аналог при массовом отношении от 1: 99 до 99: 1, предпочтительно от 20: 80 до 80: 20, более предпочтительно от 30: 70 до 70: 30.

26. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-25, в котором восстановленный или невосстанавливающийся углевод, предпочтительно маннит, присутствует в количестве от 100 до 400 мМ, предпочтительно от 150 до 250 мМ, более предпочтительно от 180 до 230 мМ.

27. Водный препарат инсулина по любому из пп. 13-26, отличающийся тем, что включает от 60 до 3000 нмоль/мл, предпочтительно от 240 до 1200 нмоль/мл человеческого инсулина, или аналога инсулина, или производного.

28. Водный препарат инсулина по любому из пп. 15-27, отличающийся тем, что включает от 0 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ, более предпочтительно от 5 до 20 мМ хлорида, предпочтительно хлорида натрия.

29. Препарат инсулина по любому из пп. 15-29, отличающийся тем, что дополнительно включает физиологически толерантный буфер, предпочтительно фосфатный буфер.

30. Водный препарат аналога инсулина, включающий растворенный и/или осажденный аналог человеческого инсулина и водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

31. Водный препарат инсулина по п. 30, отличающийся тем, что указанный углевод или производное углевода содержит от 5 до 18 углеродных атомов в основной структуре углевода.

32. Водный препарат инсулина по п. 31, отличающийся тем, что включает маннит, сорбит, ксилит, инозит, трегалозу, сахарозу или любую их смесь, предпочтительно маннит и/или сорбит, более предпочтительно маннит.

33. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-32, отличающийся тем, что дополнительно включает галогенид, предпочтительно хлорид, более предпочтительно хлорид натрия.

34. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-33, отличающийся тем, что аналог человеческого инсулина представляет человеческий инсулин, в котором положение В28 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положение В29 представляет Lys или Pro; или дез (В28-ВЗО), дез (В27) или дез (ВЗО) человеческий инсулин.

35. Водный препарат инсулина по п. 34, отличающийся тем, что аналог человеческого инсулина представляет человеческий инсулин, в котором положение В28 представляет Asp или Lys и положение В29 представляет Lys или Pro, предпочтительно Asp^В28-человеческий инсулин или Lys^В28Pro^В29-человеческий инсулин.

36. Водный препарат инсулина по п. 35, отличающийся тем, что аналогом человеческого инсулина является Asp^В28-человеческий инсулин.

37. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-36, отличающийся тем, что включает кристаллы, включающие аналог инсулина и протамин.

38. Водный препарат инсулина по п. 37, отличающийся тем, что кристаллы дополнительно включают цинк и, необязательно, фенольное соединение, предпочтительно фенол, м-крезол или их смесь.

39. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-38, отличающийся тем, что включает растворенный и осажденный, предпочтительно кристаллический, аналог инсулина при массовом отношении от 1: 99 до 99: 1, предпочтительно от 20: 80 до 80: 20, более предпочтительно от 30: 70 до 70: 30.

40. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-39, отличающийся тем, что включает от 60 до 3000 нмоль/мл, предпочтительно от 240 до 1200 нмоль/мл аналога человеческого инсулина.

41. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-40, отличающийся тем, что включает от 0 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ, более предпочтительно от 5 до 20 мМ хлорида, предпочтительно хлорида натрия.

42. Водный препарат инсулина по любому из пп. 30-41, дополнительно включающий физиологически толерантный буфер, предпочтительно фосфатный буфер.

43. Парентеральная фармацевтическая готовая форма, включающая инсулиновый препарат по любому из предшествующих пунктов.

44. Способ получения препарата инсулина, содержащего как растворенный, так и осажденный аналог инсулина, включающий стадии: a) получение кислого раствора, включающего аналог человеческого инсулина, цинк и суб-изофановое количество протамина; b) получение щелочного раствора, включающего вещество, которое действует как буфер при физиологическом рН; где, по крайней мере, один из вышеупомянутых растворов дополнительно включает фенольное соединение; c) смешение кислого и щелочного растворов и, необязательно доведение рН до значения от 6,5 до 8,0, предпочтительно от 7,0 до 7,8; и d) выдерживание полученной суспензии для осаждения.

45. Способ по п. 44, отличающийся тем, что массовое отношение аналога инсулина к протамину в растворе стадии а) выбирают, чтобы получить в конечном продукте массовое отношение растворенного инсулинового аналога к осажденному инсулиновому аналогу от 1: 99 до 99: 1, предпочтительно от 20: 80 до 80: 20, более предпочтительно от 30: 70 до 70: 30.

46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что раствор стадии а) включает от 120 до 6000 нмоль/мл аналога инсулина и от 0,01 до 5,0 мг/мл протамина.

47. Способ по п. 46, отличающийся тем, что раствор стадии а) дополнительно включает цинк, предпочтительно хлорид цинка в количестве, соответствующем 10-40 мкг цинка/100 ME инсулина, предпочтительно 15-35 мкг цинка/100 ME инсулина.

48. Способ по любому из пп. 44-47, отличающийся тем, что раствор а) и/или раствор b) включает хлорид, предпочтительно хлорид натрия в количестве; соответствующем от 0 до 100 мМ, предпочтительно от 5 до 40 мМ, более предпочтительно от 5 до 20 мМ в конечном продукте.

49. Способ по любому из пп. 44-48, отличающийся тем, что рН кислого раствора стадии а) ниже 5, предпочтительно от 2 до 3,5.

50. Способ по любому из пп. 44-49, отличающийся тем, что инсулиновым аналогом является человеческий инсулин, в котором положение В28 представляет Asp, Lys, Leu, Val или Ala и положение В29 представляет Lys или Pro; или дез (В28-ВЗО), дез(В27) или дез(ВЗО) человеческий инсулин.

51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что инсулиновым аналогом является Asp^В28-человеческий инсулин или Lys^В28Pro^В29-человеческий инсулин, предпочтительно Asp^В28-человеческий инсулин.

52. Способ по любому из пп. 44-51, отличающийся тем, что раствор стадии а) и/или стадии b) дополнительно включает фенольное соединение, предпочтительно фенол, м-крезол или их смесь.

53. Способ по любому из пп. 44-52, отличающийся тем, что раствор стадии а) и/или стадии b) дополнительно включает водорастворимый восстановленный или невосстанавливающийся углевод, содержащий, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или водорастворимое невосстанавливающееся сложноэфирное и/или эфирное производное углевода или восстановленного углевода, содержащего, по крайней мере, 4 углеродных атома в основной структуре углевода, или их смеси.

54. Способ по п. 53, отличающийся тем, что указанный углевод или производное углевода содержит от 5 до 18 углеродных атомов в основной структуре углевода.

55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что раствор стадии а) и/или стадии b) включает маннит, сорбит, ксилит, инозит, трегалозу, сахарозу или любую их смесь, предпочтительно маннит и/или сорбит, более предпочтительно маннит.

56. Способ по любому из пп. 44-55, отличающийся тем, что буферным веществом, используемым в щелочном растворе стадии b), является физиологически толерантный буфер, предпочтительно фосфатный буфер, более предпочтительно дигидрат динатрийфосфата.

57. Способ по любому из пп. 44-56, отличающийся тем, что осажденный аналог инсулина находится в форме кристаллов, включающих инсулиновый аналог и протамин.

58. Способ по любому из пп. 44-57, отличающийся тем, что суспензию, полученную на стадии d), оставляют при температуре 5-40^oС, предпочтительно 20-36^oС, более предпочтительно 30-34^oС, для осаждения.

Приоритеты по пунктам и признакам:
Пункты 1-45, 47-58 имеют приоритет 20.06.1996. Признак "дез(В30)человеческий инсулин" в пп. 4, 8, 34, 50 и рН значение рН в п. 44 ниже 7,0 выше 7.8 приоритет от 19.06.1997. , п. 46 приоритет от 19.06.1997.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4