Вакцина против ящура типа о и способ ее изготовления

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Вакцина против ящура типа О содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа О₁ штамма "Приморский-2000-ДЕП", адъювант и поддерживающую среду в эффективных соотношениях. Штамм депонирован в коллекции ВГНКИ под регистрационным 1734 "Приморский-2000-ДЕП". Вирус репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве инактиванта используют аминоэтилэтиленимин в концентрации 0,025-0,05%. Для очистки суспензии антигена от балластных примесей - полигексаметиленгуанидин в концентрации 0,005-0,007%. Для изготовления адсорбат-вакцины из адъювантов используют гель гидроокиси алюминия и дополнительно сапонин, а эмульсионной вакцины - масляный адъювант. Для изготовления адсорбат и эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 4,0 мкг/мл. Вакцина обладает повышенной иммуногенной активностью, обеспечивает защиту против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока. 2 с. и 18 з.п. ф-лы, 12 табл.

Изобретения относятся к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, и могут быть использованы при изготовлении вакцины против ящура типа О.

Ящур - это острое контагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Болезнь сопровождается большими потерями молока, мяса и других видов животноводческой продукции, затрудняет коммерческие операции и хозяйственную деятельность. Для обеспечения устойчивого благополучия страны по ящуру в Российской Федерации реализуется система мероприятий, приоритетными в которой являются предупреждение заноса вируса ящура на территорию, а в районах высокой степени риска - вакцинопрофилактика. В настоящее время в Российской Федерации и странах СНГ для иммунизации крупного и мелкого рогатого скота против ящура применяют, как правило, инактивированные сорбированные, а для иммунизации свиней - инактивированные эмульсионные вакцины [1] .

Технология изготовления противоящурной вакцины из инактивированного вируса начинается с подбора производственных штаммов на основе эпизоотологического анализа динамики ящура в стране и сопредельных государствах. При создании препаратов для специфической профилактики используют соответствующие типы вируса ящура и подбирают штаммы с широким антигенным спектром внутри типа с выраженной перекрестной иммуногенностью. Штамм с широким спектром иммуногенности и удовлетворяющий требованиям региона выбирают с помощью его испытания в реакции перекрестной защиты или чаще в реакции перекрестной нейтрализации. Как правило, в качестве производственного штамма используется популяция вируса, которая в совокупности с системой и условиями промышленного культивирования обеспечивает гарантированное и высокое накопление 146S и 75S компонентов вируса и получение иммуногенной вакцины. Кроме того, производственному штамму предъявляются требования стабильности вируса в процессе очистки от тканевых компонентов и концентрирования, а также сохранения компонентов вируса при инактивации и длительном его хранении [2].

Хорошо известной особенностью возбудителя ящура является антигенная изменчивость штаммов в пределах одного серотипа, происходящая в различные временные промежутки, на разных территориях, зависящая от видового состава восприимчивого поголовья, его иммунного статуса и множества других факторов. Считается, что основной причиной антигенной изменчивости является изменение аминокислотной последовательности в полипептидах вирусных белков, составляющих капсид вириона. Практически такие антигенные изменения могут выражаться как в незначительных отличиях между штаммами, улавливаемых только с помощью тонких методов молекулярного анализа, так и в появлении совершенно отличающихся штаммов, требующих использования новых средств специфической профилактики болезни, вызываемой этими штаммами [2, 3].

Известны штаммы вируса ящура типа О, которые используются на территории России в течение последних 34-35 лет. К ним относятся следующие штаммы: O₁ 1618 "Чечено-Ингушский", выделенный в 1966 году в Чечено-Ингушской АССР; O₁ 194 "Волгоградский", выделенный в 1967 году в Волгоградской области, и O₁ 1182/83 "Армения", выделенный в 1983 году на территории Армении [4, 5].

Указанные штаммы использовались в качестве производственных при изготовлении диагностических препаратов и противоящурных инактивированных вакцин, применявшихся в различных регионах страны. Однако после ликвидации ящура, вызываемого близкими в антигенном отношении штаммами вируса, они были сняты с производства и в настоящее время поддерживаются лишь в музее штаммов ВНИИ защиты животных [1-5].

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ящура типа О, содержащая авирулентный и очищенный антигенный материал из иммуногенных компонентов вируса ящура O₁ 194, репродуцированного в чувствительной биологической системе, адъювант и поддерживающую среду.

Штамм O₁ 194 "Волгоградский" выделен 24.02.64 г. на Омском биокомбинате и используется в Российской Федерации в качестве производственного при изготовлении средств специфической профилактики, применяемых на всей территории России и в странах СНГ.

Штамм 194 вируса ящура O₁ имеет характеристики, представленные в таблице 1.

Для очистки вируссодержащей суспензии от балластных примесей используют хлороформ в 2% концентрации и последующее центрифугирование.

В качестве инактиванта используют формальдегид, аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) или бинарный этиленимин (БЭИ). В качестве адъюванта - гидроокись алюминия (ГОА) с сапонином или масляный адъювант [6].

Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она не обеспечивает удовлетворительной защиты против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и на Дальнем Востоке (Япония, Россия, Монголия).

Известны способы изготовления противоящурной ГОА-формолвакцины из афтозного, культурального и лапинизированного вируса типа О [2, 5].

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из афтозного вируса типа О КРС, включающий приготовление вируссодержащей суспензии, очистку, концентрирование, инактивацию и сорбцию вируса на ГОА [7].

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа О, включающий заражение новорожденных крольчат и репродукцию в них вируса, приготовление вируссодержащей суспензии, сорбцию вируса ГОА, инактивацию вируса формалином и теплом, добавление сапонина [8].

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа О, включающий заражение новорожденных крольчат репродукцию в них вируса, получение вируссодержащей суспензии, ее очистку, сорбцию вируса на ГОА и инактивацию вируса формалином [9].

Известен способ приготовления вакцины против ящура типа О, включающий культивирование вируса ящура на переживающей ткани эпителия языка крупного рогатого скота со сменой питательной среды при непрерывной аэрации и перемешивании [10].

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из лапинизированного вируса типа О, включающий культивирование вируса, его очистку, инактивацию и последующее эмульгирование полученного антигена с масляным адъювантом [11].

Известен способ получения противоящурной ГОА-формолвакцины из лапинизированного вируса типа О, включающий заражение новорожденных крольчат и репродукцию в них вируса, приготовление вируссодержащей суспензии на солевом изотоническом растворе Хенкса, Эрла, Тироде или Дульбекко с добавлением 0,5% гидролизата лактальбумина или казеина, очистку вируссодержащей суспензии 5-10% хлороформа, сорбцию вируса на ГОА, инактивацию вируса формальдегидом и последующее добавление сапонина [12].

Известен способ изготовления противоящурной вакцины из культурального вируса типа О, включающий заражение перевиваемой линии клеток свиных почек IB-RS-2 клон 3 и репродукцию в ней вируса, очистку вируссодержащей суспензии центрифугированием или хлороформом или 3-хлорэтиленом, инактивацию вируса формалином и последующее эмульгирование полученного антигена с масляным адъювантом [13].

Основным недостатком известных способов изготовления противоящурных вакцин из вируса типа О является то, что полученные в соответствии с ними вакцины обладают низкой иммуногенной активностью и не обеспечивают удовлетворительной защиты против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления вакцины против вируса, ящура типа О, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной биологической системе, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей, инактивацию вируса, концентрирование полученного антигена и последующее соединение концентрата антигена с адъювантом [6].

Недостатком способа-прототипа является то, что полученная в соответствии с ним вакцина обладает также низкой иммуногенной активностью и не обеспечивает удовлетворительной защиты против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

При возникновении заболевания вакцина из производственного штамма O₁ 194 не обеспечивала удовлетворительной защиты иммунизированных животных. Во ВНИИЗЖ в результате лабораторных исследований афтозного материала, выделенного от больных животных, был установлен вирус типа О, имеющий антигенные отличия от штамма O₁ 194 в реакции связывания комплемента и реакции серонейтрализации вируса. Это свидетельствует о несоответствии используемых средств специфической профилактики ящура типа О, используемых Россией и странами СНГ, эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

В задачу создания настоящих изобретений входила разработка высокоиммуногенной вакцины против вируса типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока, и способа ее изготовления.

Технический результат от использования предлагаемых изобретений заключается в повышении иммуногенной активности вакцины против ящура типа О, обеспечивающей защиту против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для получения другого.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура типа О, охарактеризованной следующей совокупностью признаков: 1) вакцина против ящура типа О; 2) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП"; 3) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов (146S+75S) вируса ящура типа O₁ штамма 1734 "Приморский-2000-ДЕП" взят в эффективном количестве; 4) из инактивантов АЭЭИ; 5) полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) в качестве средства для очистки суспензии от балластных примесей; 6) из адъювантов гель ГОА; 7) сапонин в качестве дополнительного адъюванта; 8) из адъювантов масляный адъювант; 9) поддерживающая среда;
10) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", адъюванты гель ГОА и сапонин, поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997138,0-998114,0
11) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", масляный адъювант и поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Масляный адъювант - 500000-700000
Поддерживающая среда - 299996,0-499996,0
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) вакцина против ящура типа О;
2) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП";
3) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" взят в эффективном количестве;
4) адъювант;
5) поддерживающая среда.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) из адъювантов вакцина содержит гель ГОА;
2) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин;
3) из адъювантов вакцина содержит масляный адъювант;
4) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура О₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", адъюванты гель ГОА и сапонин, поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997138,0-998114,0
5) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", масляный адъювант и поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Масляный адъювант - 500000-700000
Поддерживающая среда - 299996,0-499996.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) вакцина против ящура типа О;
2) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура гомологичного штамма;
3) адъювант;
4) поддерживающая среда.

По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является то, что из штаммов вакцина содержит штамм 1734 "Приморский-2000-ДЕП" вируса ящура типа O₁, взятого в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) из адъювантов вакцина содержит гель ГОА;
2) из адъювантов вакцина содержит дополнительно сапонин;
3) из адъювантов вакцина содержит масляный адъювант;
4) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", адъюванты гель ГОА и сапонин, поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Гель ГОА - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997138,0-998114,0
5) авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", масляный адъювант и поддерживающая среда взяты в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Масляный адъювант - 500000-700000
Поддерживающая среда - 299996,0-499996,0
Предлагаемая вакцина обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает защиту против ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" является новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О.

Указанный технический результат достигнут также созданием способа изготовления вакцины против ящура типа О, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ изготовления вакцины против ящура типа О;
2) вирусный антиген репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21;
3) в качестве вирусного антигена используют вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП";
4) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 часов при 36-37^oС;
5) для изготовления вакцины используют суспензию вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" с титром не менее 7,0 lg ТЦД₅₀/мл и содержанием 146S+75S компонентов не менее 0,5 мкг/мл;
6) сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" подвергают инактивации;
7) вирус ящура штамма О₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" инактивируют АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05%;
8) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" инактивируют АЭЭИ в течение 12-24 часов при 36-37^oС и рН 7,2-7,6;
9) суспензию антигена очищают от балластных примесей и возможных контаминантов добавлением в нее флокулянта-антисептика ПГМГ в концентрации 0,005-0,007%;
10) балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией;
11) для изготовления вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал в виде эффективного количества иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура ₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП";
12) для изготовления адсорбат-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
13) для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" концентрируют сорбцией на гель ГОА, который добавляют в суспензию антигена в концентрации 2-5%;
14) для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%;
15) для изготовления эмульсионной вакцины антиген концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем;
16) для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
17) для изготовления эмульсионной вакцины концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления вакцины против ящура типа О;
2) вирусный антиген репродуцируют в чувствительной биологической системе;
3) в качестве вирусного антигена используют вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" в эффективном количестве;
4) инактивация вируса;
5) очистка антигена от балластных примесей;
6) концентрирование антигена;
7) соединение концентрата антигена с адъювантом.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 часов при 36-37^oС;
3) сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" подвергают инактивации;
4) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" инактивируют АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05%;
5) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" инактивируют в течение 12-24 часов при 36-37^oС и рН 7,2-7,6;
6) суспензию антигена очищают от балластных примесей добавлением ПГМГ в концентрации 0,005-0,007%;
7) балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией;
8) для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют сорбцией на гель ГОА, который добавляют в суспензию в концентрации 2-5%;
9) для изготовления адсорбат-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
10) для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%;
11) для изготовления эмульсионной вакцины авирулентный и очищенный материал концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем;
12) для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
13) для изготовления эмульсионной вакцины концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления вакцины против ящура типа О;
2) вирусный антиген репродуцируют в чувствительной биологической системе;
3) очистка вируссосодержащей суспензии от балластных примесей;
4) инактивация вируса;
5) концентрирование полученного антигена;
6) соединение концентрата антигена с адъювантом.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) в качестве вирусного антигена используют штамм 1734 "Приморский-2000-ДЕП" вируса ящура типа O₁;
2) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" используют в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21;
2) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 часов при 36-37^oС;
3) сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" подвергают инактивации;
4) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" инактивируют АЭЭИ в концентрации 0,025-0,05%;
5) вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" инактивируют в течение 12-24 часов при 36-37^oС и рН 7,2-7,6;
6) суспензию антигена очищают от балластных примесей добавлением ПГМГ в концентрации 0,005-0,007%;
7) балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией;
8) для изготовления адсорбат-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
9) для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют сорбцией на гель ГОА, который добавляют в суспензию в концентрации 2-5%;
10) для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%;
11) для изготовления эмульсионной вакцины авирулентный и очищенный материал концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем;
12) для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл;
13) для изготовления эмульсионной вакцины концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3:7-1:1.

Вакцина, полученная предлагаемым способом, обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает защиту животных против вируса ящура типа О, циркулирующего в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм 1734 "Приморский-2000-ДЕП" вируса ящура типа O₁.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается за счет того, что инактивацию вируса АЭЭИ осуществляют сразу по окончании цикла его репродукции, что позволяет значительно снизить трудо- и энергозатраты на изготовление вакцины без снижения качества инактивации вируса.

Дополнительный технический результат от использования предлагаемого способа достигается также за счет использования флокулянта-антисептика ПГМГ для очистки суспензии антигена от балластных примесей и одновременной инактивации возможных контаминантов [14].

Исходный вирус для получения штамма 1734 "Приморский-2000-ДЕП" вируса ящура типа O₁ выделен от больных свиней в хозяйстве села Элитное Уссурийского района Приморского края РФ. Производственный штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм О₁ 1734 по данным РСК, РН и результатам секвенирования участков генома значительно отличается от производственного штамма О₁ 194 (R составило 40-50% соответственно, а степень нуклеотидных различий - 12%), а также от других штаммов вируса ящура типа О, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ. Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 22.03.2001 г. под регистрационным 1734 "Приморский-2000-ДЕП". Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивает получение противоящурной инактивированной вакцины, создающей защиту восприимчивых животных против вируса ящура типа О, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Юго-Восточной Азии и Дальнего Востока.

Штамм 1734 "Приморский-2000-ДЕП" вируса ящура типа O₁ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, виду Aphtae, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующий активности. У переболевших животных в сыворотках крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА, РН. При вакцинации свиней вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП, РН.

При определении антигенного соответствия штамма O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" с производственными штаммами и полевыми изолятами ящура типа О, выделенными на протяжении 1966-2000 гг. на территории стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1.

Биотехнологические характеристики
Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для использования в качестве сырья для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус ₁ 1734 репродуцируется в монослойных культурах первично-трипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30, IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 10-18 часов инкубирования накапливается до 7,0-8,0 lg ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 2-3 часа. После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 lg ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7•10⁶. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,6•10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP_66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Физические свойства
Масса вириона - 8,4•10^-18 г. Коэффициент седиментации - 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам
Вирус O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,0-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, y-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О. Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная вакцинопрофилактика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходима высокоактивная вакцина.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемых изобретений. Определение из перечня выявленных аналогов прототипов, как наиболее близких по совокупности признаков аналогов, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины и способа ее изготовления, изложенных в независимых пунктах формулы.

Следовательно, заявляемые изобретения соответствуют условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемых решений условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемых изобретений), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемых изобретений преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемые вакцина и способ ее изготовления соответствуют условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения.

Пример 1
Для изготовления адсорбат-вакцины вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В качестве поддерживающей среды используют раствор Эрла без сыворотки с добавлением ФГМС, ГБКС и антибиотиков при рН 7,2-7,4. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 0,005-0,1 ТЦД₅₀ на клетку. Культивирование вируса ведут при температуре 36-37^oС. Через 8-10 часов инкубирования проводят подсчет живых и мертвых клеток при окраске трипановым синим. Если количество живых клеток составляет 15-20%, то инкубирование продолжают еще 2-3 часа. При достижении количества мертвых клеток 90-95% культивирование прекращают и вируссодержащую суспензию контролируют на стерильность и содержание 146S+75S компонентов.

Количество 146S+75S компонентов в суспензии должно составлять не менее 0,5 мкг/мл. Сразу по окончании цикла репродукции вируса, не прекращая термостатирования, в вируссодержащую суспензию добавляют 15-20%-ный раствор АЭЭИ, подкисленный ледяной уксусной кислотой до рН 8,0-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025-0,05%. Инактивацию инфекционности вируса проводят в течение 12-24 часов при 36-37^oС и рН 7,2-7,6 с перемешиванием через 5-6 часов в течение 3-5 минут. После этого суспензию антигена охлаждают до 4-8^oС. В охлажденную суспензию добавляют 10%-ный раствор ПГМГ до концентрации 0,005-0,007% для флокуляции балластных примесей и инактивации возможных контаминантов. Флокулированные балластные примеси подвергают седиментации с последующей декантацией. Полученный антиген контролируют на авирулентность, содержание вирусспецифического белка и 146S+75S компонентов вируса и стерильность. Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе адсорбированной вакцины получают путем концентрирования антигена гелем ГОА.

Расчетный объем геля ГОА 3% концентрации добавляют в охлажденную суспензию антигена при работающей мешалке. Перемешивание ведут в течение 30 минут. После седиментации геля ГОА сливают расчетный объем оставшейся суспензии. Конечная концентрация ГОА должна быть в пределах 1,62±0,488 Р<0,01 мг/мл n= 10, а концентрации 146S+75S компонентов вируса ящура, по меньшей мере, 4,0 мкг/мл. Затем в суспензию добавляют дополнительно 10%-ный раствор сапонина до конечной концентрации, по меньшей мере, 0,075%. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и проводят контроль стерильности по [15].

Полученная вакцина представляет собой жидкость светло-желтого цвета с рыхлым белым осадком сорбента, который образуется на дне флакона при хранении и легко разбивается в гомогенную взвесь при встряхивании.

Оптимальный компонентный состав полученной адсорбат-вакцины против ящура типа О приведен в таблице 2. В таблицах 3, 4, 5 и 6 приведены результаты культивирования вируса ящура типа O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" и вируса ящура O₁ 194 в культиваторах КС 40 и КМ-2000, из которых следует, что штамм вируса ящура O₁ 1734 имеет более короткий срок репродукции, что обусловило необходимость подбора оптимальной дозы заражения.

Вторым отличием штамма O₁ 1734 является более низкий процент выхода иммуногенных (146S+75S) компонентов на фоне сопоставимых значений вирусспецифического белка (ВСБ).

В таблице 7 приведены результаты исследований по изучению влияния инактивации и очистки антигенного материала с помощью АЭЭИ и ПГМГ на иммуногенные компоненты вируса O₁ 1734 и вируса ящура O₁ 194.

Приведенные в таблице 7 данные свидетельствуют о том, что иммуногенные компоненты нового штамма вируса ящура O₁ 1734 не уступают в устойчивости к инактивации и очистке в условиях производства вируса ящура O₁ 194. Особенно важным является тот факт, что в процессе инактивации и очистки вируса O₁ 1734 не произошло изменений в количестве 146S+75S компонентов, полученных при репродукции вируса (см. табл. 7).

Пример 2
Проведены испытания адсорбат-вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей, мкг/мл:
Авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" - 4,0
Гель ГОА - 1740,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997506,0
Авирулентность и безвредность вакцины проверяют на 5 головах КРС, вводя вакцину сначала под слизистую языка в дозе 2,0 мл, затем подкожно в дозе 10 мл. Наблюдение за клиническим состоянием животных ведут 10 суток. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на иммуногенную активность на КРС или морских свинках.

Результаты проверки полученной вакцины на иммуногенную активность на КРС приведены в таблице 8. Приведенные в таблице 8 результаты показали, что все шесть голов КРС были защищены от генерализации процесса контрольного заражения через 21 день.

Иммунный ответ КРС на введение адсорбат-вакцины из ящурного антигена O₁ 1734 проверили также на 5 головах КРС массой 200-300 кг. Результаты исследований представлены в таблице 9. Приведенные в таблице 9 данные свидетельствуют о том, что противоящурная адсорбат-вакцина из штамма O₁ 1734 индуцирует хороший иммунный ответ, начиная с 21 дня после вакцинации. Уровень вируснейтрализующих антител (ВНА) к 61 дню увеличился на 5,07 лог₂ по сравнению с 21 днем после вакцинации. Таким образом, задача создания адсорбат-вакцины на основе нового штамма вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" решена.

Пример 3
Для изготовления эмульсионной вакцины вирус ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" репродуцируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21, инактивируют, очищают от балластных примесей, контролируют полученный антиген на авирулентность, содержание вирусспецифического белка, 146S+75S компонентов вируса и стерильность так, как описано в примерах 1 и 2.

Необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена проточной ультрафильтрацией. Для этого используют ультрафильтры БТУ 0,5-2. Фильтрование ведут под давлением 1,5 атм.

Полученный концентрат антигена хранят при 4-6^oС до момента использования в вакцине. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена и масляного адъюванта в соотношении 3:7-1:1 соответственно.

В результате получают инактивированную эмульсионную вакцину против ящура типа О, которая представляет собой молокоподобную жидкость, не растворимую в воде. Вакцина имеет жидкую консистенцию, легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов, общей реакции в виде подъема температуры и обладает выраженной иммуногенностью для свиней в дозе 2 мл через 1-21 день после вакцинации, для КРС - в дозе 5 мл через 3-21 день после вакцинации и для овец - в дозе 1 мл через 3-21 день после введения. Вакцину вводят свиньям внутримышечно, а КРС и овцам - подкожно. В прививном объеме должно содержаться не менее 4 мкг 146S+75S компонентов.

Оптимальный компонентный состав полученной эмульсионной вакцины против ящура типа О приведен в таблице 10.

Пример 4
Эмульсионную вакцину против ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" готовят так, как описано в примерах 1, 2, и 3. Отличие состоит в том, что необходимую концентрацию 146S+75S компонентов в прививной дозе эмульсионной вакцины получают путем концентрирования антигена осаждением ПЭГ-115.

Пример 5
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примере 3, и содержащей, мкг/мл:
Авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" - 1,56
Масляный адъювант - 500000,0
Поддерживающая среда - 499998,44
Иммуногенная активность данной вакцины проверена на свиньях массой 35-50 кг. Результаты исследований представлены в таблице 11 (п.4). ИмД₅₀=0,18 мл. В прививном объеме 2 мл содержится 11,2 ИмД₅₀ для свиней. Представленные в таблице 11 данные демонстрируют уровень гуморального иммунитета у подсвинков, привитых вакцинами с разным содержанием иммуногенного компонента.

В таблице 12 показано, что эмульсионная вакцина из вируса ящура типа O₁ штамма 194 индуцирует в организме подсвинков в 2-3 раза меньшее количество ВНА против гетерологичного штамма вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" по сравнению с гомологичным штаммом O₁ 194.

Пример 6
Проведены испытания эмульсионной вакцины против ящура типа О, изготовленной так, как описано в примере 4, и содержащей, мкг/мл:
Авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных (146S+75S) компонентов вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" - 6,0
Масляный адъювант - 500000,0
Поддерживающая среда - 499994,0
Иммуногенная активность данной вакцины проверена на свиньях. Ее ИмД₅₀ равна 0,043 мл, т. е. вакцина содержит 46,50 ИмД₅₀ в дозе вакцины (2 мл). Результаты исследований представлены в таблице 11 (п.5). Объем прививной дозы вакцины должен содержать не менее 7 ИмД₅₀.

Следовательно, задача создания эмульсионной вакцины на основе вируса ящура O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" решена.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании группы предлагаемых изобретений следующей совокупности условий:
- вакцина против ящура типа О и способ ее изготовления, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для группы предлагаемых изобретений в том виде, что они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов,
- при использовании предлагаемых вакцины против ящура типа О и способа ее изготовления достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретений.

Источники информации
1. Сюрин В. Н. и др. Вирусные болезни животных. - М: ВНИТИБП, 1998, с. 544-547.

2. Бурдов А. Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур /Под ред. А.Н. Бурдова. - М: Агропромиздат, 1990, с. 231-250.

3. Ререр X. Ящур /Пер. с нем. Г.А.Сурковой. Под ред. и с предисл. канд. вет. наук П.В. Малярца. - М: Колос, 1971. - 432 с.

4. Кругликов Б. А., Штефан М.К. и Тарасенко Т.Я. Изучение инфекционных свойств штаммов вируса ящура типа О, выделенных в разные периоды эпизоотии. - В кн.: Акт. пробл. вет. вирусолог. Владимир, 1988, ч. 1, 77-78.

5. Авт. свидетельство СССР 1739559, А 61 К 39/135, 10.04.2000.

6. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины моновалентной эмульсионной против ящура типа А, типа О, типа С, типа Азия-1 (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21). Утверждена ГУВ Госкомиссии СМ СССР по продовольствию и закупкам 24.01.91 (прототип).

7. Пат. ФРГ 1138509; 30 h, 6; 16.05.63.

8. Пат. ФРГ 1161387; 30 h, 6; 08.05.69.

9. ТУ 10-09-123-91. Универсальная моно- и поливалентная сорбированная вакцина против ящура типов А, О, С и Азия-1. Утверждены ГУВ МСХ СССР 16.06.91.

10. Пат. СССР 352441, А 61 К 23/00, 21.09.72.

11. Авт. свид. СССР 411131, С 12 К 5/00, 15.01.74.

12. Авт. свид. СССР 561732, С 12 К 5/00, А 61 К 39/26; 15.06.77.

13. Пат. Франции 2088038; А 61 К 27/00, С 12 К 5/00; 07.01.72.

14. Пат. РФ 2054039; С 12 N 7/02, А 61 К 39/135; 10.02.96.

15. ГОСТ 28085-89.

Формула изобретения

1. Вакцина против ящура типа О, содержащая авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа О гомологичного штамма, адъювант и поддерживающую среду, отличающаяся тем, что из штаммов вакцина содержит штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Арhtae, тип O₁, коллекция ВГНКИ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" в эффективном количестве.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит адсорбент гель гидроокиси алюминия.

3. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит дополнительно сапонин.

4. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что из адъювантов она содержит масляный адъювант.

5. Вакцина по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса ящура типа O₁ штамма 1734 "Приморский-2000-ДЕП", гель гидроокиси алюминия, сапонин и поддерживающую среду в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Гель гидроокиси алюминия - 1132,0-2108,0
Сапонин - 750,0
Поддерживающая среда - 997138,0-998114,0
6. Вакцина по п. 1 или 4, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал в виде иммуногенных компонентов вируса типа O₁ штамма 1734 "Приморский-2000-ДЕП", масляный адъювант и поддерживающую среду в соотношении, мкг/мл:
Антигенный материал - ≥4,0
Масляный адъювант - 500000-700000
Поддерживающая среда - 299996,0-499996,0
7. Способ изготовления вакцины против ящура типа О, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной биологической системе, очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей, инактивацию вируса, концентрирование полученного антигена и последующее соединение концентрата антигена с адъювантом, отличающийся тем, что в качестве вирусного антигена используют штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род Aphtovirus, вид Aphtae, тип O₁, коллекция ВГНКИ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" в эффективном количестве.

8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что в качестве чувствительной биологической системы используют суспензионную культуру клеток ВНК-21.

9. Способ по п. 7 или 8, отличающийся тем, что вирус ящура типа O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП" культивируют в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в течение 10-15 ч при 36-37^oС.

10. Способ по любому из пп. 7-9, отличающийся тем, что сразу после окончания цикла репродукции вирус ящура подвергают инактивации.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что для инактивации вируса ящура используют аминоэтилэтиленимин в концентрации 0,025-0,05%.

12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что вирус ящура инактивируют в течение 12-24 ч при 36-37^oС и рН 7,2-7,6.

13. Способ по п. 7, отличающийся тем, что для очистки суспензии антигена от балластных примесей используют полигексаметиленгуанидин в концентрации 0,005-0,007%.

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что балластные примеси отделяют из суспензии антигена седиментацией с последующей декантацией.

15. Способ по любому из пп. 7-14, отличающийся тем, что для изготовления адсорбат-вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют сорбцией на гель гидроокиси алюминия в концентрации 2-5%.

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что для изготовления адсорбат-вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных компонентов вируса ящура штамма O₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4 мкг/мл.

17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что для изготовления адсорбат-вакцины к концентрату антигена добавляют дополнительно адъювант-сапонин в концентрации, по меньшей мере, 0,075%.

18. Способ по любому из пп. 7-14, отличающийся тем, что для изготовления эмульсионной вакцины авирулентный и очищенный антигенный материал концентрируют проточной ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем.

19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что для изготовления эмульсионной вакцины используют авирулентный и очищенный антигенный материал с содержанием иммуногенных компонентов вируса ящура штамма О₁ 1734 "Приморский-2000-ДЕП", по меньшей мере, 4,0 мкг/мл.

20. Способ по п. 7 или 19, отличающийся тем, что для изготовления эмульсионной вакцины против ящура типа О концентрат антигена соединяют с масляным адъювантом в соотношении 3: 7-1: 1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7