Способ прогнозирования неблагоприятного течения антибиотикзависимого дисбактериоза кишечника энтерококковой этиологии у новорожденных детей

 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностическим методам. Способ заключается в следующем: у новорожденных детей исследуют кишечную микрофлору, выделяют чистую культуру энтерококка, определяют вид и информативные признаки - количественные показатели антикомплементарной активности микроорганизма а, антилизоцимной активности b, анти-бета-лизиновой активности f, лизоцимсинтезирующей активности с, степень протеолитической активности микроорганизма е и показатель микробной обсемененности d, на основании которых для выделенного вида энтерококка вычисляют соответствующую дискриминантную функцию: F₁ для штаммов Enterococcus faecalis = 0,121861•а - 0,504115•b + 1,05431•с - 0,474428•d + 1,32988•е + 0,036062•f - 6,87778 или F₂ для штаммов Enterococcus faecium = 1,90725•с + 0,553682•d + 0,0387757•f - 7,01385, и если F₁ больше 0 или F₂ больше 0,394925, прогнозируют неблагоприятное течение, а если F₁ меньше 0 или F₂ меньше 0,394925, прогнозируют благоприятное течение антибиотикзависимого дисбактериоза кишечника у новорожденных детей. Способ позволяет проводить раннюю диагностику с целью подбора оптимальной схемы терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для прогнозирования течения дисбактериоза кишечника у новорожденных детей, этиологическим агентом которого являются представители рода Enterococcus.

Актуальность Внедрение в реанимационные мероприятия искусственной вентиляции легких и инвазивных процедур привело к расширению показаний для включения в схему лечения новорожденных цефалоспориновых антибиотиков второго и третьего поколения. Применение вышеуказанных антибиотиков в лечении новорожденных детей способствует развитию дисбактериоза кишечника с тотальным дефицитом облигатной кишечной микрофлоры, за исключением энтерококков, устойчивых к данному классу антибиотиков.

Среди энтерококков, выделенных из фекалий новорожденных детей с дисбактериозом кишечника на фоне проводимой интенсивной антибиотикотерапии, доминировали два вида: Enterococcus faecium (70%) и Enterococcus faecalis (30%).

При антибиотикзависимом дисбактериозе кишечника создаются оптимальные условия для реализации энтерококками ферментов агрессии и факторов персистенции, что усугубляет течение патологического процесса и приводит к развитию декомпенсированной клинической формы, которая характеризуется транзиторной бактериемией, бактериурией и формированием вторичных очагов энтерококковой инфекции.

В связи с вышеизложенным, ранняя диагностика неблагоприятного течения энтерококкового дисбактериоза кишечника (т.е. развития декомпенсированной клинической формы с формированием бактериемии, бактериурии и вторичных очагов энтерококковой инфекции на фоне проводимой антибиотикотерапии) становится ключевым моментом в определении тактики антибиотикотерапии и профилактики инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных детей.

Уровень техники Аналоги. Из научно-технических и патентных источников известны способы прогнозирования инфекционно-воспалительных заболеваний у новорожденных детей на основе клинико-бактериологических и иммунологических критериев [5, 11, 12, 13]. В предлагаемых способах оценивается общее состояние пациента, уровень его противоинфекционной и колонизационной резистентности. Однако не учитываются изменения вирулентности выделенных штаммов условно-патогенных микроорганизмов.

Прототип. Традиционный подход к проблеме диагностики тяжести течения дисбактериоза кишечника основан на определении показателей микробной обсемененности облигатной микрофлоры в просвете толстого отдела кишечника [7, 8, 9]. В оценке степеней дисбактериоза нет единой точки зрения, поскольку часто применяются разные клинико-лабораторные критерии. Кроме того, такой подход не учитывает фенотипические изменения штаммов облигатной микрофлоры, колонизирующей кишечник. Энтерококки входят в состав облигатной кишечной микрофлоры, но при кишечном дисбактериозе у иммунокомпромиссных лиц эти микроорганизмы могут вызывать инфекционно-воспалительные заболевания и для оценки этиологической значимости энтерококков важен не только показатель микробной обсемененности, но и их вирулентные свойства [15].

Цель изобретения состоит в ранней диагностике (6-7 сутки жизни) неблагоприятного течения энтерококкового дисбактериоза кишечника на фоне проводимой антибиотикотерапии.

Поставленная цель достигается путем определения экспериментально установленной авторами комбинации информативных признаков (антикомплементарной, антилизоцимной, лизоцимсинтезирующей активности, показателя микробной обсемененности микроорганизма, протеолитической и анти-бета-лизиновой активности) у чистой культуры E. faecalis и E. faecium. Экспрессия информативных признаков у энтерококков этих двух видов достоверно (р<0,01) отличается при благоприятном и неблагоприятном течении вышеуказанного дисбактериоза кишечника.

Достигаемый при осуществлении изобретения технический результат состоит в том, что заявляемый способ решает задачу раннего прогноза (6-7 сутки жизни) неблагоприятного течения антибиотикзависимого дисбактериоза кишечника энтерококковой этиологии, клинические проявления которого наблюдаются на 12-14 день жизни новорожденного. Прогноз возникновения декомпенсированной клинической формы энтерококкового дисбактериоза кишечника позволит определить тактику антибиотикотерапии и предупредить возникновение энтерококковой инфекции у новорожденных детей.

Предложенный способ прогнозирования неблагоприятного течения антибиотикзависимого энтерококкового дисбактериоза кишечника был испытан в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных детей Уральского НИИ охраны материнства и младенчества, г. Екатеринбург.

Эффективность прогнозирования, проведенного в соответствии с заявляемым способом, составила 95,0%.

Сущность изобретения 1. У новорожденного ребенка, получающего с первых суток жизни в связи с тяжелым общим состоянием антибиотикотерапию цефалоспориновыми антибиотиками второго или третьего поколения, на 4-5 сутки жизни исследуют фекалии на кишечный дисбактериоз по общепринятой методике [14] с целью выделения чистой культуры энтерококка и определения показателя его микробной обсемененности.

2. Чистую культуру энтерококка идентифицируют до вида с помощью биохимических тест-систем фирмы "Lachema" (Чехия) и параллельно определяют остальные информативные признаки: антикомплементарную, анти-бета-лизиновую, антилизоцимную, лизоцимсинтезируюшую и протеолитическую активность выделенного штамма энтерококка по авторским методикам [2, 3, 4, 6, 10].

3. На основе полученных показателей информативных признаков определяют значение дискриминантных функций[1] F₁ (для штаммов Enterococcus faecalis) и F₂ (для штаммов Enterococcus faecium) по формулам: F₁= 0,121861•а-0,504115•b+1,05431•с-0,474428•d+1,32988•е+0,036062•f-6,87778, F₂=1,90725•с+0,553682•d+0,0387757•f-7,01385, где а - количественный показатель антикомплементарной активности микроорганизма (анти-СН₅₀), b - количественный показатель антилизоцимной активности микроорганизма (мкг/мл), с - количественный показатель лизоцимсинтезирующей активности микроорганизма (зона лизиса в мм), d - показатель микробной обсемененности микроорганизма (lg кое/г), е - степень протеолитической активности микроорганизма (усл. ед.),
f - количественный показатель анти-бета-лизиновой активности микроорганизма (%),
и если F₁ больше 0 или F₂ больше 0,394925, прогнозируют неблагоприятное течение антибиотикзависимого энтерококкового дисбактериоза кишечника, тогда как если F₁ меньше 0 и F₂ меньше 0,394925, судят о благоприятном прогнозе течения антибиотикзависимого дисбактериоза кишечника у новорожденных детей
Примеры конкретного выполнения
Пример 1. Ребенок от женщины А., беременность которой протекала на фоне хронической внутриматочной уреаплазменной инфекции, осложненной развитием гестоза средней степени тяжести. В родах отмечен длительный (более 20 ч) безводный промежуток и отхождение зеленоватых околоплодных вод. При рождении отмечалось двойное обвитие пуповины вокруг шеи ребенка. Гестационный возраст ребенка 39 недель, масса при рождении 3200 г с оценкой по шкале Апгар 5/7 баллов. В родовом зале ребенку проводилась 2-х минутная вентиляция мешком Амбу и маской. С рождения у ребенка отмечалось состояние средней степени тяжести, обусловленное гипоксическим поражением центральной нервной системы. Учитывая тяжесть заболевания и риск развития инфекции по анамнезу, ребенку с первых суток жизни был назначен цефотаксим.

На 4-е сутки жизни было проведено исследование фекалий новорожденного на дисбактериоз. В монокультуре был выделен и идентифицирован Enterococcus faecalis в количестве 9 lg кое/г (признак "d"). У выделенной культуры энтерококка определили остальные информативные признаки: а= 24 анти-СН₅₀, b=2 мкг/мл, с= 5 мм, е=4 усл. ед., f=36%. Полученные цифровые показатели информативных признаков включили в уравнение для энтерококков соответствующего вида:
F₁= 0,121861•24-0,504115•2+1,05431•5-0,474428•9+1,32988•4+0,036062•36-6,87778=2,658104 (F₁>0).

Вычисленное значение соответствовало неблагоприятному прогнозу, который реализовался по данным ретроспективного анализа истории болезни в виде энтерококкового гастроэнтероколита и бактериурии с выделением однотипного штамма энтерококка.

Пример 2. Ребенок от женщины В., беременность которой протекала на фоне отягощенного соматического анамнеза (анемия, ожирение). С 34-й недели беременности отмечался O-гестоз. Роды осложнились частичной непрогрессирующей отслойкой нормально расположенной плаценты. Гестационный возраст ребенка при рождении 38 недель, масса тела 2800 г, оценка по шкале Апгар 7/8 баллов. Состояние ребенка с рождения оценивалось как средней степени тяжести. Тяжесть была обусловлена гипоксическим поражением центральной нервной системы, морфофункциональной незрелостью. В связи с подозрением на внутриутробное инфицирование, с первых суток жизни ребенок получал цефуроксим. На 5-е сутки жизни было проведено исследование фекалий новорожденного на дисбактериоз. В монокультуре в количестве 7 lg кое/г (признак "d") был выделен и идентифицирован штамм Enterococcus faecalis, который имел следующие информативные признаки: а=12,9 анти-CH₅₀, b=0 мкг/мл, с=3 мм, е=3 усл. ед., f=13%. Полученные цифровые показатели информативных признаков включили в дискриминантную функцию для энтерококка данного вида:
F₁=0,121861•12,9-0,504115•0+1,05431•3-0,474428•7+1,32988•3+0,036062•13-6,87778=-1,0053931 (F₁<0).

Пример 3. Ребенок от женщины С., беременность которой протекала на фоне отягощенного соматического и акушерского анамнеза (ожирение, вегето-сосудистая дистония, два мед.аборта в анамнезе, хроническая внутриматочная инфекция - хламидиоз и уреаплазмоз по результатам ДНК-зондирования). В 25 недель беременности женщина перенесла ОРВИ, в результате которой развилась фето-плацентарная недостаточность и многоводие. С 35 недель беременности был выставлен диагноз ОГ-гестоз средней степени тяжести. Во втором периоде родов была зарегистрирована брадикардия у плода. Ребенок родился в сроке гестации 40 недель с массой тела 3500 г с оценкой по шкале Апгар 3 балла на первой минуте жизни. В связи с неэффективностью спонтанного дыхания, ребенку с рождения проводилась искусственная вентиляция легких и стартовая терапия в виде комбинации цефтазидима с амикацином. Проведенный на 4-е сутки жизни новорожденного количественный бактериологический анализ кишечной микрофлоры установил наличие дисбактериоза кишечника, который характеризовался тотальным дефицитом аутохтонной микрофлоры (бифидобактерий, лактобактерий, эшерихий) и абсолютным преобладанием кокковых форм.

Были выделены и идентифицированы по совокупности признаков культуры Enterococcus faecium и Staphylococcus epidermidis в количестве 8 lg кое/г и 4 lg кое/г соответственно. Чистая культура Enterococcus faecium была протестирована на наличие информативных прогностических признаков: с=4 мм, d=8 lg кое/г, f= 48%. Числовые показатели вышеуказанных признаков были включены в дискриминантную функцию, построенную для данного вида энтерококка:
F₂ = 1,90725•4+0,553682•8+0,0387757•48-7,01385 = 6,905839,
F₂>0,394925,
что соответствовало неблагоприятному прогнозу течения антибиотикзависимого энтерококкового дисбактериоза кишечника, который по данным ретроспективного анализа истории болезни реализовался в виде энтероколита с бактериемией, подтвержденной выделением однотипной гемокультуры.

Пример 4. Ребенок от женщины Д., беременность которой протекала на фоне отягощенного акушерско-гинекологического и соматического анамнеза (хронический аднексит, анемия, миопия 1-й степени). Роды осложнились дискоординацией родовой деятельности с последующим развитием гипоксии плода, что явилось показанием к оперативному родоразрешению. Ребенок родился в сроке гестации 38 недель с массой тела 3200 г, с оценкой по шкале Апгар 6/7 баллов. Состояние ребенка с рождения оценивалось как средней степени тяжести. Тяжесть была обусловлена перенесенной гипоксией на фоне морфо-функциональной незрелости. Учитывая состояние ребенка и длительный безводный период (14 ч), ребенок был отнесен к группе риска по развитию инфекционно-воспалительного заболевания и с первых суток жизни получал терапию цефуроксимом. Количественный бактериологический анализ фекалий, проведенный у пациента на 5-е сутки жизни, выявил дисбактериоз кишечника с тотальным дефицитом облигатной кишечной микрофлоры, за исключением энтерококков, которые были выделены в виде монокультуры в количестве 8 lg кое/г (признак "d") и по совокупности признаков идентифицированы как Enterococcus faecium. Выделенная чистая культура энтерококка была протестирована на наличие и выраженность информативных прогностических признаков: с=0 мм, f=11%. Цифровые показатели признаков были включены в дискриминантную функцию, построенную для данного вида энтерококка:
F₂ = 1,90725•0+0,553682•8+0,0387757•11-7,01385 = -2,1578613,
F₂<0,394925,

Таким образом, с помощью предлагаемого способа прогнозирования неблагоприятного течения антибиотикзависимого энтерококкового дисбактериоза кишечника, основанного на анализе ферментотоксичных и персистентных свойств энтерококков, возможна ранняя (доклиническая) диагностика декомпенсированной клинической формы дисбактериоза кишечника у новорожденных детей с целью подбора оптимальной схемы антибиотикотерапии и профилактики оппортунистической инфекции, обусловленной Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium.

Источники информации
1. Бродская Л. И., Логинов М.И., Соболев О.Н., Шелементьев Г.С. Анализ данных в пакете SТАТGRАРНIСS. - Екатеринбург, 2000.

2. Брудастов Ю. А. Антикомплементарная активность бактерий. // Персистенция бактерий. / Под ред. О.В.Бухарина. - Куйбышев, 1990. - C.100-107.

3. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. М.: Медицина, Екатеринбург: УрО РАН, 1999. - С.96-98.

4. Бухарин О. В. , Усвяцов Б.Я., Малышкин А.П. и др. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Журн. микробиол., 1984, 2:27-29.

5. Кешишян Е.С. Клиника, лечение, прогнозирование и исходы инфекционных осложнений при продленной искусственной вентиляции легких у новорожденных с дыхательными нарушениями: Автореф.дис....д-pa мед.наук. - М., 1996.

6. Коваленко И.К., Касумова С.О. Лизоцимсинтезирующая активность энтерококков и лактобацилл. Микробиол.журн., Киев, 1996, Т.58, 6:12-17.

7. Красноголовец В.Н. Дисбактериоз кишечника. - М., 1989.

8. Крылов В.П., Кроличенко Т.П., Малышева Т.В. и др. Новый вариант рабочей классификации дисбактериоза микрофлоры в просвете толстого кишечника.Журн.микробиол., 1997, 3:103-104.

9. Куваева И.Б., Ладодо К.С. Микроэкологические и иммунологические нарушения у детей. - М., 1991.

10. Кузнецова Г. Г. Микрометод для экспрессного выявления протеолитической активности микроорганизмов. Лаб.дело., 1989, 1:51-53.

11. Кушнарева М. В. Микробиологическое и иммунологическое обоснование особенностей комплексной антибактериальной терапии у новорожденных детей с высокой степенью незрелости: Автореф.дис....д-pa биол.наук. - М., 2000.

12. Павлова Е.В., Черкасская К.А., Сотникова Н.А. и др. Клинико-бактериологические и иммунологические критерии формирования гнойно-воспалительной патологии у новорожденных детей. Педиатрия, 1990, 4:52-57.

13. Павлова Е.В., Стефани К.А., Сотникова Н.А. А.с. 1291880, 1986. Способ прогнозирования развития инфекционных заболеваний у новорожденных в неонатальном периоде.

14. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями. Диагностика и лечение дисбактериоза кишечника: Сб.трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского. - М., 1986.

15. Седов В. И. Энтерококковая инфекция у детей. Педиатрия, 1992, 7-9: 70-74.

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения антибиотикзависимого энтерококкового дисбактериоза кишечника у новорожденных детей путем микробиологического количественного исследования кишечной микрофлоры, отличающийся тем, что у выделенной чистой культуры энтерококка определяют вид и информативные признаки - антикомплементарную, антилизоцимную, анти-бета-лизиновую, лизоцимсинтезирующую, протеолитическую активность и показатель микробной обсемененности и вычисляют дискриминантные функции для соответствующего вида энтерококка по формулам
F₁ для штаммов Enterococcus faecalis= 0,121861•а-0,504115•b+1,05431•с-0,474428•d+1,32988•е+0,036062•f-6,87778, F₂ для штаммов Enterococcus faecium= 1,90725•с+0,553682•d+0,0387757•f-7,01385,
где а - количественный показатель антикомплементарной активности микроорганизма, анти-СН₅₀;
b - количественный показатель антилизоцимной активности микроорганизма, мкг/мл;
с - количественный показатель лизоцимсинтезирующей активности микроорганизма, зона лизиса в мм;
d - показатель микробной обсемененности микроорганизма, lg кое/г;
е - степень протеолитической активности микроорганизма, усл.ед.;
f - количественный показатель анти-бета-лизиновой активности микроорганизма, %,
и если F₁ больше 0 или F₂ больше 0,394925, прогнозируют неблагоприятное течение антибиотикзависимого энтерококкового дисбактериоза кишечника, тогда как, если F₁ меньше 0 или F₂ меньше 0,394925, судят о благоприятном прогнозе течения антибиотикзависимого дисбактериоза кишечника у новорожденных детей.