Способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа о

 

Изобретение относится к области ветеринарии. Для получения сыворотки используют морских свинок или кроликов. Вирус ящура типа О штамм 1734 /Приморский/2000 для гипериммунизации выращивают в суспензионной культуре клеток ВНК-21. Полученный вирус очищают, концентрируют и инактивируют. Для гипериммунизации животных-доноров используют антиген из штамма О, 1734/Приморский/2000 с активностью в РСК не меньше 1: 16 и адъювант, при этом в качестве адъюванта используют сапонин, его аналоги или масляные адъюванты. Через 10 дней после гипериммунизации животных-доноров обескровливают и получают сыворотку крови. Способ позволяет повысить активность и специфичность препарата. 3 з. п. ф-лы, 2 ил. , 3 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано в производстве диагностических сывороток для определения типовой и штаммоспецифической принадлежности вируса ящура в серологических реакциях.

Известно, что для приготовления сывороток для лабораторной диагностики ящура, дифференциации его от других везикулярных болезней и идентификации типовой принадлежности возбудителя (типирования) в качестве производственных используют штаммы вируса ящура, принятые в России и странах СНГ в качестве вакцинных и являющиеся наиболее изученными представителями вируса 7 иммунологических типов. При изготовлении сывороток для идентификации штаммовой принадлежности вируса ящура в качестве производственных используют оригинальные отечественные штаммы эпизоотического вируса, отличающиеся от вакцинных, а также некоторые актуальные для России и стран СНГ штаммы из сопредельных государств (1-3).

Способы получения диагностических сывороток с использованием разных схем гипериммунизации морских свинок или кроликов ящурным антигеном и применением различных адъювантов известны.

Известен способ получения сыворотки для серодиагностики ящура животных, включающий иммунизацию морских свинок препаратом, содержащим 10-20% суспензию афтозного вируса ящура, с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови морских свинок специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта (1).

Известен способ получения стандартных гипериммунных сывороток для определения типов вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК), включающий гипериммунизацию кроликов препаратом вируса ящура, предварительно адаптированным к 2-3-дневным крольчатам, с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови кроликов специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта (2).

Известен способ получения сыворотки для серодиагностики ящура животных, включающий иммунизацию кроликов препаратом, содержащим суспензию вируса ящура на физиологическом растворе, с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови кроликов специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта (3).

Известен способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О, включающий иммунизацию кроликов препаратом, содержащим высококонцентрированный материал с масляным адъювантом, с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови кроликов специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта (4).

Известен способ получения сывороток для серодиагностики ящура животных, включающий иммунизацию кроликов коммерческой инактивированной эмульсионной вакциной против ящура животных с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови кроликов специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта (1).

Недостатки известных способов получения сывороток для иммунодиагностики ящура состоят в том, что они не позволяют получить сыворотки высокой активности и специфичности по отношению к вирусу ящура типа О, циркулирующего в странах Закавказья, России и др. государств мира.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О, включающий иммунизацию морских свинок препаратом, содержащим антигенный материал с адъювантом, с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови морских свинок специфических антител, последующее обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта (4).

Недостатки способа-прототипа состоят в том, что он также не позволяет получить сыворотку высокой активности и специфичности по отношению к вирусу ящура типа О, выделенного в 2000 году на территории Приморского края РФ и имеющего антигенные отличия от штамма O₁ 194 в РСК и ИФА. Это свидетельствует о несоответствии используемых диагностических сывороток эпизоотическому вирусу, циркулирующему в странах Закавказья, России и др. государств мира.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа получения сыворотки для серодиагностики ящура, обладающей высокой активностью и специфичностью по отношению к эпизоотическому вирусу ящура типа О, циркулирующему в России, странах Закавказья и др. странах мира.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении активности и специфичности сыворотки.

Указанный технический результат достигнут созданием способа получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О, охарактеризованного следующей совокупностью признаков: 1) способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О; 2) иммунизация животных-доноров препаратом, содержащим эффективное количество антигенного материала с адъювантом; 3) в качестве антигенного материала используют штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О; 4) для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не меньше 1:16; 5) животных-доноров иммунизируют препаратом с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови животных специфических антител; 6) в качестве животных-доноров используют морских свинок массой 450-500 г; 7) в качестве животных-доноров используют кроликов массой 2,5-3,5 кг; 8) обескровливание животных-доноров; 9) отделение целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О;
2) иммунизация животных-доноров препаратом, содержащим эффективное количество антигенного материала с адъювантом;
3) в качестве антигенного материала используют штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О;
4) животных-доноров иммунизируют препаратом с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови животных-доноров специфических антител;
5) обескровливание животных-доноров;
6) отделение целевого продукта.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не меньше 1:16;
2) в качестве животных-доноров используют морских свинок массой 450-500 г;
3) в качестве животных-доноров используют кроликов массой 2,5-3,5 кг.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О;
2) иммунизация животных-доноров препаратом, содержащим эффективное количество антигенного материала с адъювантом;
3) препарат вводят в организм животных-доноров с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови животных специфических антител;
4) обескровливание животных-доноров;
5) отделение целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенными отличительными признаками изобретения являются:
1) в качестве антигенного материала используют штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О;
2) штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О берут в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения:
1) для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не меньше 1:16;
2) в качестве животных-доноров используют морских свинок массой 450-500 г;
3) в качестве животных-доноров используют кроликов массой 2,5-3,5 кг.

По сравнению с прототипом предлагаемый способ позволяет получить сыворотку, обладающую высокой активностью и специфичностью по отношению к вирусу ящура типа О, циркулирующему в России, странах Закавказья и др. государствах мира.

Экспериментально подтверждена возможность использования предлагаемого способа для получения сыворотки для серодиагностики вируса ящура типа О.

Исходный вирус для получения штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О выделен 13.04.2000 г. от больных свиней в хозяйстве ОПХ "Степное" (село Элитное) Уссурийского района Приморского края РФ. Производственный штамм O₁ 1734/Приморский/2000 получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм O₁ 1734 по данным РСК и результатам секвенирования участков генома значительно отличается от производственных штаммов O₁ 194 и О₁ 1618 (R составило 40-50% соответственно, а степень нуклеотидных различий -10-12%), а также от других штаммов вируса ящура типа О, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ.

Полученный штамм депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (ВГНКИ) 22.03.2000 г. под регистрационным 1734/Приморский/2000/ДЕП. Штамм O₁ 1734/Приморский/2000 обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих иммунохимическую диагностику изолятов вируса ящура типа О, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в России, странах Закавказья (Грузия), а также в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на фиг.1 представлена аминокислотная последовательность белка VP1 штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О; на фиг.2 изображена дендрограмма, отражающая структурное сходство участка гена VP1 штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О с аналогичными фрагментами геномов других штаммов вируса ящура типа О. Штамм 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм O₁ 1734/Приморский/2000 относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу О и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура. Форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм O₁ 1734/Приморский/2000 относится к серотипу О. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА, РН. При вакцинации КРС и свиней вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП и РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным антигеном индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1:100 и в ИФА в разведении 1:3000.

При определении антигенного родства штамма O₁ 1734/Приморский/2000 с производственными штаммами и полевыми изолятами вируса ящура типа О, выделенными в 1966-2000 гг. на территории России, стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1. Сравнительный анализ установленных структур штамма 1734/Приморский/2000 и эпизоотических изолятов, выделенных в последние годы в странах Закавказья и различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию, показал, что он имел наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами O₁/Вьетнам/1999 и O₁/Тайвань/1999. В то же время его гомология с представителями других генетических линий вируса ящура типа О составляла всего лишь 80-90% (фиг.2).

Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три и более десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг.2). Установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от большинства выделенных ранее изолятов, в том числе и от производственных штаммов вируса ящура О₁ 194 и O₁ 1618, куда относятся используемые в настоящее время для изготовления средств диагностики и специфической профилактики производственные штаммы О₁ 194 и O₁ 1618. Антигенное родство вируса ящура O₁ 1734/Приморский/2000 с производственными и ранее выделенными штаммами на территории России, стран Закавказья и др. государства мира изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что штамм O₁ 1734/Приморский /2000, значительно отличается от производственных штаммов O₁ 194 и O₁ 1618 и близко родственен другим изучаемым штаммам.

Биотехнологические характеристики
Штамм O₁ 1734/Приморский/2000 проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины.

Штамм вируса O₁ 1734 репродуцируется в монослойных культурах первичнотрипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 час инкубирования накапливался до 6,5-7,51 lg ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа. После 4-5 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм O₁ 1734/Приморский/2000 является РНК-содержащим вирусом с мол. массой 7х10⁶Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8х10⁸ МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеиновая оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (VP66a) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса (фиг.1). Сравнительный анализ показал, что данный штамм O₁ 1734/Приморский/2000 принадлежит к новой генетической линии вируса ящура типа О. Представителей этой линии выделяли в последние годы в различных регионах азиатского континента, включая Юго-Восточную и Среднюю Азию. Исследуемый вирус ящура 1734 имел наиболее высокий уровень гомологии (98,74%) с изолятами O₁/Вьетнам/1999 и O₁/Тайвань/1999. В то же время его гомология с представителями других генетических линий вируса ящура типа О составляла всего лишь 80-90%.

Физические свойства
Масса вириона 8,4х10^-18г. Коэффициент седиментации - 146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45 г/мл.

Устойчивость к внешним факторам
Вирус штамма O₁ 1734/Приморский/2000 устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при рН 7,2-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, α-облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, крольчат и морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм O₁ 1734/Приморский/2000 по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа О.

Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная лабораторная диагностика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антигенные диагностикумы.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемый способ не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1.

Для получения сыворотки используют морских свинок массой 450-500 г. Морских свинок заражают интраплантарно предварительно адаптированным к ним вирусом ящура типа О, штамм 1734/Приморский/2000. Морские свинки должны переболеть генерализованной формой ящура в течение 72-96 часов. Спустя 30-45 дней после заражения морских свинок подвергают гипериммунизации путем введения в их организм препарата, содержащего антигенный материал из штамма O₁ 1734/Приморский/2000 и адъювант, с периодичностью и количеством доз, достаточных для образования в крови животных-доноров специфических антител. Вирус для гипериммунизации получают в суспензионной культуре клеток ВНК-21. В течение 20-24 часов инкубирования вирус накапливается до 6,5-7,5 lg ТЦД₅₀/мл. В качестве адъюванта используют сапонин, его аналоги или масляные адъюванты типа неполного адъюванта Фрейнда. Полученную вируссодержащую суспензию очищают от балластных примесей добавлением 0,05% полигуанидина, концентрируют в 100 раз добавлением 10% полиэтиленгликоля (ЛЭГ) м.м.6000 и инактивируют аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), который добавляют в суспензию до концентрации 0,01-0,05% (рН 7,8-8,0). Продолжительность инактивации 24 часа. Для гипериммунизации используют антиген с активностью в РСК не ниже 1:16. Инактивированный концентрат антигена в смеси с равным объемом масляного адъюванта вводят морским свинкам в объеме 1 мл внутримышечно в области бедра. Через 21 день иммунизацию повторяют дважды (с интервалом 6-7 дней) и спустя 10 дней животных тотально обескровливают. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при 37-38^oС в течение 40-60 минут, а затем при 2-8^oС в течение 16-18 часов для отделения сгустка крови. Отстоявшуюся сыворотку инактивируют при 56^oС в течение 30 минут, консервируют азидом натрия (1: 5000) и выдерживают при 2-8^oС в течение 25-30 дней. Индивидуальные пробы сыворотки крови проверяют на типовую специфичность и активность в РСК согласно ГОСТу 25384-82. После этого готовят серию путем смешивания типоспецифических индивидуальных проб одинаковой активности. Полученный препарат фасуют в ампулы по 0,5-1 мл.

Штаммовую специфичность серийного препарата определяют в одно- и двухсторонних реакциях с гомо- и гетерологичными антигенами. Полученная сыворотка может быть использована для выделения специфического иммуноглобулина.

Указанным способом было приготовлено 2 серии гипериммунной сыворотки, характеристики которых представлены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение от морских свинок диагностической сыворотки, по специфической активности отвечающей требованиям ГОСТа 25384-82.

Пример 2.

Для получения сыворотки используют кроликов массой 2,5-3,5 кг. Для гипериммунизации используют препарат, содержащий антигенный материал из штамма 1734/Приморский/2000 вируса ящура типа О и адъювант. Указанный препарат получают так, как описано в примере 1. Полученный препарат вводят по 1-2 мл в межпальцевые ткани задних конечностей кроликов (по 0,1-0,2 мл в каждую точку инъекции). Доза 146S антигена на одного донора должна составлять не менее 50 мкг. Через 28 дней кроликов прививают повторно внутримышечно в области бедра двойной дозой исходного препарата 146S антигена в объеме 2-5 мл с добавлением в качестве адъюванта 2,5-5,0 мг сапонина. Спустя 10 дней животных обескровливают и получают сыворотку крови, которая может быть использована для выделения специфического иммуноглобулина.

Указанным способом было приготовлено 2 серии гипериммунной сыворотки, характеристики которых представлены в таблице 3.

Из данных таблицы 3 видно, что предлагаемый способ обеспечивает получение от кроликов диагностической сыворотки, по специфической активности отвечающей требованиям ГОСТа 25384-82.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности и условий:
-способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
-для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
-сыворотка, полученная в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации
1. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А. Сурковой. Под ред. и с предис. канд. вет.наук П.В. Малярца. М.: Колос, 1971, 432 с.

2. Бурдов А. Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. Под ред. А.Н. Бурдова. М.: Агропромиздат, 1990, 320 с.

3. Сюрин В. Н. , Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и др. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 532-548.

4. Авт. свид. СССР 1741802, А 61 К 39/42, 23.06.92.

5. Авт. свид. СССР 127790, А 61 К 23/00, 18.10.60.

6. Ногина В.Т. Получение типоспецифических ящурных сывороток от взрослых кроликов/ Ветеринария. - 1962 - 8. - 62-72.

7. Инструкция по изготовлению и контролю сывороток и иммуноглобулинов ящурных типо- и штаммоспецифических для серологических реакций (РСК, РУСК, РДП, РРИД, РЭМА), используемых в диагностических целях. Утверждена ГУВ МСХ СССР 29.01.91 (прототип).

Формула изобретения

1. Способ получения сыворотки для серодиагностики ящура типа О, включающий иммунизацию животных-доноров препаратом, содержащим антигенный материал с адъювантом, с периодичностью и в количестве, достаточном для образования в крови животных-доноров специфических антител, обескровливание животных-доноров и отделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве антигенного материала используют штамм вируса Aphtae epizooticae, ceм. Picornaviridae, род. Aphtovirus, типа О, коллекция ВГНКИ №1734/Приморский/2000/ДЕП, в эффективном количестве.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для иммунизации животных-доноров используют антиген с титром в РСК не меньше 1:16.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве животных-доноров используют морских свинок массой 450-500 г.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве животных-доноров используют кроликов массой 2,5-3,5 кг.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3