Способ получения миелопида
Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных препаратов из костного мозга животных. Способ включает приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, при этом для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала 50-80% раствором этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. Приведен состав предпочтительного варианта питательной среды. Способ позволяет увеличить выход целевого продукта при упрощении технологии производства и сокращении трудозатрат. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.
Изобретение относится к технологии получения иммуномодулирующего препарата из костного мозга животных.
Известен способ получения Миелопида, включающий приготовление суспензии клеток костного мозга в окрашенной 199 среде, их инкубирование в той же среде, отделение супернатанта и выделение из него целевого продукта путем последовательного проведения ультрафильтрации, лиофильной сушки, растворения в стерильной воде, стерильной фильтрации и гель-хроматографического разделения на сефадексе G-25 с использованием фосфатного буфера (RU 2041716 С1, 20.08.1995).Недостатками этого способа являются высокая трудоемкость и сложность технологии, связанные с необходимостью очистки целевого продукта от используемого при суспендировании и инкубировании клеток красителя фенолового красного, входящего в состав 199 среды, и низкий выход целевого продукта, составляющий 250-300 доз из 1·1010 клеток.Техническим результатом изобретения является сокращение трудозатрат, упрощение технологии и увеличение выхода целевого продукта.Этот результат достигается тем, что в способе получения Миелопида, включающем приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, согласно изобретению для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала водным раствором этилового спирта в уксусной кислоте.Предпочтительным вариантом воплощения настоящего изобретения предусмотрено использование для суспендирования и инкубирования среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм3:CaCl2 200Fe(NO3)2·9H2O 0,1KCl 400MgSO4·7Н2O 200NaCl 6800NaHCO3 2200NaH2PO4·H2O 140Аденин 10Натриевая соль аденинтрифосфата 10Адениновая кислота 0,2Холестерол 0,22-деоксирибоза 0,5Глюкоза 1000Глутатион 0,05Гуанин хлорид 0,3Гипоксантин 0,3Рибоза 0,5Ацетат натрия 50Тимин 0,3Твин 80 20Урацил 0,3Ксантин 0,3DL-аланин 50L-аргинин хлорид 70DL-аспарагиновая кислота 50L-цистеин хлорид 0,1L-цистидин 20L-глутамин 100DL-глутаминовая кислота·H2O 150Глицин 50L-гистидин хлорид 20L-гидроксипролин 10DL-изолейцин 40DL-лейцин 120L-лизин хлорид 70DL-фенилаланин 50DL-метионин 50L-пролин 40DL-серин 50DL-треонин 60DL-триптофан 20L-тирозин 40DL-валин 50р-аминобензойная кислота 0,05Аскорбиновая кислота 0,05Биотин 0,01Кальциферол 0,1Холин хлорид 0,5Фолиевая кислота 0,01i-инозитол 0,05Менадион 0,01Никотинамид 0,025Никотиновая кислота 0,025Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,01Пиридоксал хлорид 0,025Пиридоксин хлорид 0,025Рибофлавин 0,01Тиамин хлорид 0,01п-токоферолфосфат натрия 0,01Витамин А 0,1Другим предпочтительным вариантом предусмотрено использование 50-80% раствора этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты.Способ реализуется следующим образом.Клетки костного мозга извлекают из измельченных костей животных путем суспендирования в жидкой неокрашенной среде с последующей фильтрацией, центрифугированием и разбавлением неокрашенной питательной средой, содержащей смесь витаминов, аминокислот и компонентов нуклеиновых кислот в солевом растворе Хенкса, предпочтительно в указанном выше соотношении компонентов. Затем осуществляют инкубирование клеток при традиционных параметрах процесса и отделяют супернатант центрифугированием. Из супернатанта выделяют целевой продукт путем его адсорбции на биоспецифическом сорбенте Адан (ТУ 6-02-98-94) с последующим экстрагированием водным раствором этилового спирта в уксусной кислоте, предпочтительно с концентрацией этилового спирта 50-80% по объему в 0,1% по объему водном растворе уксусной кислоты. Использование названного состава экстрагента позволяет минимизировать его расход, последующие трудо- и энергозатраты на выделение целевого продукта и потери его активных компонентов, что увеличивает выход целевого продукта.Пример 1.8 кг зачищенных реберных костей свиней измельчают в стерильных условиях. К ним добавляют 3 л стерильной жидкой питательной среды описанного выше состава. Суспензию встряхивают на шейкере при 37С в течение 1 часа для вымывания клеток костного мозга. Клетки отделяют фильтрацией и отмывают центрифугированием в той же питательной среде при 4С. Полученные клетки разбавляют той же средой, доводя их концентрацию до 1·109 клеток/дм3, и инкубируют в течение 18-20 часов при 37С. Далее отделяют супернатант центрифугированием при 5000 об/мин и температуре 4С. Супернатант пропускают через колонку, заполненную биоспецифическим сорбентом Адан. Адсорбированный материал экстрагируют при 6С, используя в качестве экстрагента 50-80% раствор этилового спирта в 0,1% водном растворе уксусной кислоты. При концентрации выше указанной экстракция не происходит. При концентрации ниже указанной резко увеличивается расход экстрагента, что при последующей лиофильной сушке препарата приводит к увеличению времени сушки и энергетических затрат, а также к снижению активности препарата. Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от около 40000 доз препарата при граничных значениях концентрации экстрагента до 50000 при концентрации этилового спирта в экстрагенте 60% по объему.Биологический эффект целевого продукта оценивают по стимуляции антителообразования на пике вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана (Jerne N.K., Nordin A.A.// Science, 1983, v. 140, р. 405), добавляя тестируемый материал в культуру клеток лимфатических узлов, полученных от мышей на четвертые сутки после повторной иммунизации. Коэффициент стимуляции рассчитывают как отношение количества антителообразующих клеток (АОК) в культуре с тестируемым образцом к количеству АОК в контроле. Результаты испытаний приведены в таблице. Таким образом, при упрощенной технологии и сниженных трудозатратах предлагаемый способ позволяет увеличить выход Миелопида.Пример 2.Препарат готовят по примеру 1, но с использованием питательной среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм3:CaCl2 200Fе(NО3)3·9Н2O 0,1KCl 400MgSO4·7H2O 200NaCl 5400NаНСО3 3700NaH2PO4·H2O 124Глюкоза 4600Пируват натрия 110Гептамицин 15L-аргинин хлорид 84L-цистидин 48L-глутамин 780Глицин 30L-гистидин хлорид водный 42L-изолейцин 105L-лейцин 105L-лизин хлорид 146L-метионин 30L-фенилаланин 86L-серин 42L-треонин 85L-триптофан 18L-тирозин 72L-валин 94Холин хлорид 4Фолиевая кислота 4i-инозитол 7,2Никотинамид 4Натриевая соль пантотеновой кислоты 4Пиридоксал хлорид 4Рибофлавин 0,4Тиамин хлорид 4Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от 20000 до 32000 доз препарата при различной концентрации этилового спирта в экстрагенте.Пример 3.Препарат готовят по примеру 1, но с использованием питательной среды, содержащей следующие компоненты, мг/дм3:Са(NО3)2·4Н2O 100KCl 400МgSO4·7Н2O 100NaCl 6000NaHCO3 2000Na2HPO4 801Глюкоза 2000Глутатион 1Гептамицин 15L-аргинин хлорид 342L-аспарагин 50L-аспарагиновая кислота 20L-цистидин 50L-глутамин 500L-глутаминовая кислота 20Глицин 10L-гистидин хлорид 18,2L-гидроксипролин 20L-изолейцин 50L-лейцин 50L-лизин хлорид 50L-метионин 15L-фенилаланин 15L-пролин 20L-серин 30L-треонин 25L-триптофан 5L-тирозин 20L-валин 20р-аминобензойная кислота 1Биотин 0,2Холин хлорид 3фолиевая кислота 1i-инозитол 36Никотинамид 1Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,75Пиридоксал хлорид 1Рибофлавин 0,2Тиамин хлорид 1Витамин B12 0,008Выход продукта с коэффициентом стимуляции 1,8 колеблется от 12000 до 25000 доз препарата при различной концентрации этилового спирта в экстрагенте.Формула изобретения
1. Способ получения Миелопида, включающий приготовление суспензии клеток костного мозга, их инкубирование в питательной среде, отделение супернатанта и последующее выделение из него целевого продукта, отличающийся тем, что для суспендирования и инкубирования клеток используют неокрашенную среду, а выделение целевого продукта осуществляют путем пропускания супернатанта через биоспецифический сорбент Адан и экстрагирования адсорбированного материала 50-80%-ным раствором этилового спирта в 0,1%-ном водном растворе уксусной кислоты.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что для суспендирования и инкубирования клеток костного мозга используют среду, содержащую следующие компоненты, мг/дм3:СаСl2 200Fe(NO3)2·9H2O 0,1КСl 400MgSO4·7H2O 200NaCl 6800NaHCO3 2200NaH2PO4·H2O 140Аденин 10Натриевая соль аденинтрифосфата 10Адениновая кислота 0,2Холестерол 0,22-Деоксирибоза 0,5Глюкоза 1000Глутатион 0,05Гуанин хлорид 0,3Гипоксантин 0,3Рибоза 0,5Ацетат натрия 50Тимин 0,3Твин 80 20Урацил 0,3Ксантин 0,3DL-аланин 50L-аргинин хлорид 70DL-аспарагиновая кислота 50L-цистеин хлорид 0,1L-цистидин 20L-глутамин 100DL-глутаминовая кислота·Н2О 150Глицин 50L-гистидин хлорид 20L-гидроксипролин 10DL-изолейцин 40DL-лейцин 120L-лизин хлорид 70DL-фенилаланин 50DL-метионин 50L-пролин 40DL-серин 50DL-треонин 60DL-триптофан 20L-тирозин 40DL-валин 50р-Аминобензойная кислота 0,05Аскорбиновая кислота 0,05Биотин 0,01Кальциферол 0,1Холин хлорид 0,5Фолиевая кислота 0,01i-Инозитол 0,05Менадион 0,01Никотинамид 0,025Никотиновая кислота 0,025Натриевая соль пантотеновой кислоты 0,01Пиридоксаль хлорид 0,025Пиридоксин хлорид 0,025Рибофлавин 0,01Тиамин хлорид 0,01п-Токоферолфосфат натрия 0,01Витамин А 0,1