Функциональный агент, напиток и способ приготовления функционального агента
Изобретение относится к функциональному агенту, который устраняет вред от никотина, вызванный курением. Предложен функциональный агент для разложения никотина, напиток и способ приготовления функционального агента. Функциональный агент готовят путем сушки композиции, включающей в себя (в частях по массе): 50-500 - порошок эффективного ингредиента зеленого чая, 7,5-75 - экстракта листьев шелковицы, 3-30 - яблочного сока, 3-30 - экстракта лакричного корня, 1,5-15 - экстракта высушенной апельсиновой кожуры. При этом экстракты листьев шелковицы, лакричного корня и высушенной апельсиновой кожуры готовят путем настаивания на кипящей воде. Функциональный напиток готовят путем смешивания 0,1-5% по массе функционального агента с водой. Способ приготовления функционального агента предусматривает приготовление фильтратов орехов, фруктов и овощей, концентратов корней, кожуры и листьев. После чего готовят порошок путем смешивания вышеуказанных фильтратов и концентратов с порошком эффективного ингредиента зеленого чая. Затем порошок фильтруют и сушат путем распылительной сушки. Изобретение позволяет получить функциональный агент, ингибирующий образование канцерогена, вызванного курением, оказывающий антиоксидантное действие, снижающий скорость развития рака легкого. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 32 ил., 4 табл.
(а) Область изобретения
Настоящее изобретение относится к функциональному агенту для разложения никотина и способу его приготовления, и, более конкретно, к функциональному агенту, который устраняет вред от никотина, вызванный курением, и может ингибировать образование канцерогена, вызванное курением.
(б) Описание родственного уровня техники
Никотин является бесцветной или светло-желтой ядовитой жидкостью, которая попадает в организм путем курения. Никотин настолько ядовит, что он приносит вред клеточной мембране нервного ганглия. В дополнение, известно, что никотин вызывает повышение кровяного давления, конвульсию скелетных мышечных волокон и паралич рта вследствие возбуждения.
Моментальный вред от никотина включает в себя сужение зрачка, помутнение зрения, рвоту, тошноту, боль в желудке, диарею, затруднение контроля мочеиспускания, ожог гортани, затруднение дыхания, увеличение выделения слюны и секреции в органах дыхания, цианоз и уменьшение частоты пульса. При продолжительном курении никотин накапливается в организме, вследствие чего он может вызывать рак, гипертензию, заболевание полости рта, различные желудочно-кишечные расстройства из-за избыточной бродильной диспепсии, а также различные болезни, протекающие с расстройством кровообращения, такие как артериосклероз. Кроме того, никотин является важным фактором, способствующим старению, и в тяжелых случаях он вызывает спазмы, конвульсии, паралич дыхания, мышечные конвульсии и излишнюю гипертензию (Damaj, М.I., Welch, S. P. and Martin, В.R. (1996) J.Pharmacol. Exp. Thr., 277 454-461).
Никотин действует как очень сильный канцероген посредством производного никотина - нитрозамина. Каждый год сотни миллионов пациентов по всему миру страдают от рака легкого и заболеваний легких, вызванных курением. В 1956 году Маgее и Barnes доказали, что N'-нитрозодиметиламин (НДМА) является очень сильным, вызывающим рак печени у крыс веществом (Маgее, Р.N. and Barnes, J.M. (1956) Br. J.Cancer, 10, 114-122), и впоследствии было подтверждено, что свыше 30 классов N-нитрозаминовых соединений обладают канцерогенной активностью (Druckrey, H., Preussmann, R., Ivankovic, S. and Schmahl, D. (1967) Z. Krebsforsch., 69, 103-201; Preussmann, R., and Stewart, B.W. (1984) N-nitroso carcinogens. In Chemical Carcinogenesis, (Searle, C.E., Ed.) pp.643-828, American Chemical Society, Washington, DC.; Lijinsky, W. (1992) Chemistry and Biology of N-nitroso Compounds, Cambridge University Press, Cambridge, England.; Bogovski, P., and Bogovski, S. (1981) Int. J. Cancer, 27, 471-474).
В 1962 Druckrey и Preussmann предположили, что нитрозамин, который был получен из алкалоида табака, присутствует в табачном дыму (Druckrey, H., and Preussmann, R. (1962) Die Natur., 49, 488-499). В 1964 Boyland et al. подтвердили, что ННН (N'-нитрозонорникотин) вызывает рак легких у мышей, а НАБ (N'-нитрозоанабазин) вызывает рак пищевода у крыс (Boyland, E., Roe, F. J.C., and Gorrod, J.W. (1964) Nature, 202, 1126; Boyland, E., Roe, F.J. C., and Gorrod, J.W., and Mitchley, B.C.V. (1964) Br. J.Cancer, 18, 265-270).
Smith et al. в своем классическом исследовании, основанном на нитрозировании третичного амина через ион иминия (Klus, H., and Kuhn, H. (1975) Fachliche MittAustria Tabakwerke, 16, 307-317; Hecht, S.S., Chen, С.В., Dong, M., Ornaf, R.M., Hoffmann, D., and Tso, T.C. (1977) Beitr. Tabakforsch., 9, 1-6), доказали, что из никотина образуются различные нитрозамины (Smith, P.А.S., and Loeppky, R.N. (1967) J. Am. Chem. Soc., 89, 1148-1152). Hecht et al. подтвердили, что 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанон (ННК), 4-(метилнитрозамино)-4-(3-пиридил)-бутаналь (ННА), ННН и другие нитросоединения образуются из никотина, и обнаружили ННК в табаке (Hecht, S.S., Chen, С.В., and Hoffmann, D. (1976) Tetrahedron Lett., 8, 593-596; Hecht, S.S., Chen, С.В., Ornaf, R.M., Jacobs, E., Adams, J.D., and Hoffmann, D. (1978) J. Org. Chem., 43, 72-76; Hecht, S. S., Chen, С.В., Hirota, N., Ornaf, R.M., Tso, T.C, and Hoffmann, D. (1978) J. Natl. Cancer Inst., 60, 819-824).
На Фиг. 1 показаны различные нитрозамины, являющиеся продуктами метаболизма никотина.
К настоящему времени в продуктах табака были идентифицированы семь специфических для табака нитрозаминов, таких как ННН, ННК, ННАЛ (NNAL), HAT (NAT), НАБ, изо-ННАН (iso-NNAN) и изо-ННАК (iso-NNAC), причем ННН, ННК и HAT были обнаружены в большем количестве, чем остальные. В частности, уже было подтверждено, что ННН, ННК и ННАЛ являются очень сильными канцерогенами.
Никотин метаболизируется до котинина двумя способами, и в метаболизм вовлечены цитохром Р450 (далее CYP) и альдегид-оксигеназа цитозоля. Никотин метаболизируется до котинина с участием различных CYP, причем CYP 2A6 играет важную роль (Cashman, J.R., Park, S.В., Yang, Z.С., Wrighton, S.A., Jacob. P III., and Benowitz, N.L. (1992) Chem. Res. Toxicol., 5, 639-646).
На Фиг. 2 показан метаболизм никотина до котинина.
От 70 до 80% никотина превращается в котинин, и от 10 до 15% котинина выводится в виде мочи, а оставшееся количество метаболизируется до кетокислоты. 85% кетокислоты метаболизируется до оксикислоты и выводится в виде мочи. 4% никотина, которые не метаболизируются до котинина, превращаются в никотин-1-N-оксид с участием флавинсодержащей монооксигеназы (ФМО) и большая часть выводится в виде мочи (Benowitz, N.L., Jacob. P. III., and Fong, I. (1994) J. Pharmacol. Exp. Ther., 268, 296-301). Следовательно, от 80 до 90% никотина выводится в виде мочи посредством метаболизма (Kyerematen, G.A., Morgan, М.L., Chattopadhyay, В., deBethizy, J.D., and Vessel, E.S. (1990) Clin. Pharmacol. Ther., 48, 641-651; Caldwell, W.S., Greene, J.М., Byrd, G.D., Chang, K-M, Uhrig, М.S., deBethizy, J.D., Crooks, P.A., Bhatti, B.S., and Riggs, R.М., (1992) Chem. Res. Toxicol., 5, 280-285; Byrd, G.D., Chang, K-M., Greene, J.М., deBethizy, J.D., (1992) Drug. Metab. Dispos., 20, 192-197; Jacob. P.III., Benowitz, N.L., and Shulgin, A.J. (1998) Pharmacol. Biochem. Behav., 30, 249-253).
Как изображено на Фиг. 3, ННК представляет собой проканцероген для лабораторных животных, и в основном метаболизируется в печени и в легких с участием фермента CYP. Основная стадия активации ННК представляет собой α-гидроксилирование, опосредованное CYP, и в процессе реакции ННК превращается в метил-диазогидроксид, который представляет собой неустойчивый метаболит, и он предоставляет метильную группу для ДНК и образует О6-метилгуанин (O6MeG). O6MeG использовали в качестве промутагенного биологического показателя для канцерогена, являющегося производным ННК.
Сообщалось, что CYP связан с α-гидроксилированием ННК и ННН у мышей A/J, вызывает метилирование ДНК и образует О6-метилгуанин (O6MeG), так что возникает ошибочное спаривание в результате транзиции GC→AT, и это активирует протоонкоген K-ras (Brown, В.G., Chingjey, G.С, Paul, H.A., Chin, К.L., and David, J.D., (1999) Toxicol Scien., 47, 33-39).
Следовательно, предположили, что рак легких, вызываемый ННК с участием CYP, можно эффективно ингибировать путем использования конкурентного ингибитора субстрата фермента CYP, такого как никотин или котинин, in vitro или in vivo, поскольку он ингибирует активацию метаболизма ННК (α-гидроксилирование) (Brunnemann, К.D., et al. (1991) Crit Rev Toxicol., 21(4), 235-40). На Фиг. 4 продемонстрировано структурное сходство между ННН, никотином и ННК, которые связаны с метаболизмом с участием цитохрома Р450 2А6.
Котинин, который представляет собой основной метаболит никотина, и кетокислота, и оксикислота, которые метаболизируются впоследствии, быстро метаболизируются и выводятся в виде мочи. Этот метаболизм у людей варьирует. Котинин, кетокислота и оксикислота представляют собой единственные факторы, не являющиеся канцерогенами, на которые влияет курение. Кроме того, они действуют как конкурентные ингибиторы превращения специфического для табака нитрозамина в канцероген с участием CYP, присутствующего в печени. Поэтому никотин, который быстро метаболизируется до котинина, может уменьшать вред от курения и ингибировать рак эффективнее, чем никотин, который превращается в производные, такие как ННК, ННА и ННН.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача настоящего изобретения заключается в предложении функционального агента для быстрого разложения вредных химических соединений, образующихся при курении.
Задачей настоящего изобретения является также предложение функционального агента, который может ингибировать образование канцерогена, такого как никотин и производные никотина.
Для того чтобы решить указанную задачу, согласно настоящему изобретению предложен функциональный агент для разложения никотина, приготовленный путем сушки композиции, включающей в себя:
(а) от 50 до 500 частей по массе порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагируемого из листьев зеленого чая,
(б) от 7,5 до 75 частей по массе экстракта листьев шелковицы, настоянного на кипящей воде,
(в) от 3 до 30 частей по массе яблочного сока,
(г) от 3 до 30 частей по массе экстракта лакричного корня, настоянного на кипящей воде, и
(д) от 1,5 до 15 частей по массе экстракта высушенной апельсиновой кожуры, настоянного на кипящей воде.
Согласно настоящему изобретению также предложен функциональный напиток для разложения никотина, приготовленный путем смешивания от 0,1 до 5% по массе функционального агента с водой.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ приготовления функционального агента, при котором:
(а) готовят фильтраты орехов, фруктов и овощей путем экстрагирования и фильтрования ореха гинкго, сельдерея, яблока и лимона,
(б) готовят концентраты корней, кожуры и листьев путем экстрагирования лакричного корня и высушенной апельсиновой кожуры при 100°С, смешивания листьев шелковицы и их экстрагирования и фильтрования и
(в) готовят порошок путем смешивания фильтратов орехов, фруктов и овощей (а), концентратов корней, кожуры и листьев (б) и порошка зеленого чая, их фильтрования и распылительной сушки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг.1 показан нитрозамин, образующийся из никотина.
На Фиг.2 продемонстрирован метаболизм никотина в котинин.
На Фиг.3 изображен механизм метаболизма 4-(метилнитрозамино)-1-(3-пиридил)-1-бутанона (ННК).
На Фиг.4 проиллюстрировано структурное сходство между ННН (N'-нитрозонорникотином), никотином и ННК, которые связаны с метаболизмом с участием цитохрома Р450 2А6.
На Фиг.5 представлен график, демонстрирующий способность функционального агента по настоящему изобретению к разложению никотина с использованием способа прямого смешивания.
На Фиг.6 представлен график, демонстрирующий способность функционального агента по настоящему изобретению к разложению никотина путем измерения с использованием клеточного штамма FLCFR5.
На Фиг.7 представлен график, демонстрирующий способность функционального агента по настоящему изобретению к разложению никотина в клетках, уже абсорбировавших функциональный агент.
На Фиг.8 представлен график, демонстрирующий способность функционального агента по настоящему изобретению к разложению никотина при совместном введении функционального агента и никотина в ооцит zenopus.
На Фиг.9 представлена диаграмма, демонстрирующая способ клинического теста для тестирования способности функционального агента по настоящему изобретению к разложению никотина.
На Фиг.10 представлен график, демонстрирующий концентрацию котинина в моче курильщиков, принявших внутрь функциональный агент по настоящему изобретению (Б), и курильщиков, принявших внутрь воду в качестве контроля (А).
На Фиг.11 представлен график, демонстрирующий среднюю концентрацию котинина в моче курильщиков, принявших внутрь функциональный агент по настоящему изобретению, и курильщиков, принявших внутрь воду в качестве контроля.
На Фиг.12 представлен график, являющийся средней величиной котинина, содержащегося в моче курильщиков после приема субъектом внутрь функционального агента или воды.
На Фиг.13 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента, порошкообразного зеленого чая, эпигаллокатехин-3-галлата (ЭГКГ), кверцетина, витамина С и катехина в отношении образования нитрозоморфолина.
На Фиг.14 представлена диаграмма, демонстрирующая метаболизм никотина.
На Фиг.15 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента, кверцетина, катехина и порошкообразного зеленого чая в отношении ферментативной активности CYP.
На Фиг.16 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента, кверцетина, катехина и порошкообразного зеленого чая в отношении ферментативной активности CYP 1A2.
На Фиг.17 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента, ЭГКГ, кверцетина, катехина и порошкообразного зеленого чая в отношении ферментативной активности очищенного CYP 1A2 при высокой концентрации (А) и низкой концентрации (Б).
На Фиг.18 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента, кверцетина, катехина и порошкообразного зеленого чая в отношении мутагенности ННК.
На Фиг.19 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента, кверцетина, катехина и порошкообразного зеленого чая в отношении мутагенности, вызываемой бензопиреном.
На Фиг.20 представлен график, демонстрирующий действие функционального агента, порошкообразного зеленого чая, кверцетина и катехина в отношении захвата свободных радикалов.
На Фиг.21 представлен график, демонстрирующий действие функционального агента, порошкообразного зеленого чая, кверцетина и катехина в отношении захвата О2 - при использовании набора для определения супероксид-дисмутазы (СОД).
На Фиг.22 представлен профиль высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), демонстрирующий количество кверцетина, содержащегося в растворе функционального агента.
На Фиг.23 представлен график, демонстрирующий массу мышей A/J в тесте на ингибирование рака легких, вызванного ННК, с использованием функционального агента.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ И ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫЕ ВОПЛОЩЕНИЯ
В процессе исследования улучшения способности к разложению никотина в организме авторы настоящего изобретения выяснили, что когда натуральные пищевые продукты добавляют в зеленый чай, содержащий значительное количество катехина и ЭГКГ, и яблочный экстракт, содержащий кверцетин, они становятся превосходным функциональным агентом для разложения вредного ингредиента табака и ингибирования его образования.
Функциональный агент для разложения никотина по настоящему изобретению готовят путем сушки композиции, включающей в себя: (а) от 50 до 500 частей по массе порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагированного из листьев зеленого чая, (б) от 7,5 до 75 частей по массе экстракта листьев шелковицы, настоянного на кипящей воде, (в) от 3 до 30 частей по массе яблочного сока, (г) от 3 до 30 частей по массе экстракта лакричного корня, настоянного на кипящей воде, и (д) от 1,5 до 15 частей по массе экстракта высушенной апельсиновой кожуры, настоянного на кипящей воде.
Функциональный агент по настоящему изобретению, кроме того, содержит экстракты, приготовленные путем сушки композиции, включающей в себя: (а) от 7,5 до 75 частей по массе эктракта орехов гинкго, (б) от 3 до 30 частей по массе экстракта сельдерея и (в) от 3 до 30 частей по массе экстракта лимона.
Функциональный агент для разложения никотина по настоящему изобретению предпочтительно включает в себя: (а) от 100 до 200 частей по массе порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагированного из листьев зеленого чая, (б) от 15 до 30 частей по массе листьев шелковицы, (в) от 15 до 30 частей по массе ореха гинкго, (г) от 6 до 12 частей по массе сельдерея, (д) от 6 до 12 частей по массе лимона, (е) от 6 до 12 частей по массе яблок, (ж) от 6 до 12 частей по массе лакричного корня и (з) от 3 до 6 частей по массе высушенной апельсиновой кожуры.
Способ сушки функционального агента для разложения никотина по настоящему изобретению может представлять собой обычные способы сушки, предпочтительно способ распылительной сушки.
Функциональный агент может быть использован сам по себе или включен в состав более чем одной фармацевтической композиции. Композиция, включающая в себя функциональный агент, может включать в себя более чем один тип фармацевтического разбавителя, выбранного из группы, состоящей из солевого раствора, забуференного солевого раствора, декстрозы, воды, глицерина и этанола, но ими разбавитель не ограничивается. Подходящие разбавители перечислены в тексте Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Сo. Easton PA).
Функциональный агент или композицию, включающую в себя функциональный агент, можно вводить пероральным или парентеральным путями. Парентеральный путь введения означает введение лекарства путем, отличным от введения через рот, который включает в себя ректальное, внутривенное, внутрибрюшинное и внутримышечное, внутриартериальное, трансдермальное, назальное введение, ингаляцию, глазное и подкожное введение.
Фармацевтические препараты, содержащие функциональный агент, могут быть приготовлены в любой форме, такой как лекарственная форма для перорального введения, раствор для инъекций или препарат для местного введения. Примеры фармацевтических препаратов: пластыри, гранулы, лосьоны, линименты, лимонады, ароматизированные воды, порошки, сиропы, глазные мази, жидкости и растворы, аэрозоли, экстракты, эликсиры, мази, жидкие экстракты, эмульсии, суспензии, лечебные отвары, вливания, таблетки, суппозитории, инъекции, спирты, припарки, капсулы, кремы, пастилки, настойки, пасты и пилюли.
Препарат предпочтительно может быть приготовлен для перорального введения и введения путем инъекций и, наиболее предпочтительно, в форме для перорального введения, такой как таблетка, капсула, мягкая капсула, водное лекарство, пилюля, гранула и тому подобное.
При приготовлении препарата функциональный агент помещают в мягкую капсулу без какого-либо эксципиента или готовят в виде подходящего препарата после смешивания или разбавления носителем. Примеры подходящих носителей представляют собой крахмалы, воду, солевой раствор, раствор Рингера, декстрозу и любые ингредиенты, описанные в предшествующих работах (например, Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co., Easton PA).
Функциональный агент для разложения никотина по настоящему изобретению может быть использован в виде напитков для здоровья или пищевых добавок, и предпочтительно в виде пищи, пищевых добавок, лекарств, напитков или добавок к напиткам. Также предпочтительно смешивать от 0,1 до 5% по массе функционального агента с водой для приготовления функционального напитка.
Функциональный агент или напиток для разложения никотина по настоящему изобретению способствует разложению никотина и ингибирует образование нитрозосоединения, которое является канцерогеном. Кроме того, функциональный агент ингибирует ферментативную активность цитохрома Р450 1А2 таким образом, что предотвращает образование канцерогена с помощью ННК. В дополнение, он оказывает антиоксидантное действие, а также он ингибирует мутагенность ННК и бензопирена и снижает генетически детерминированную скорость развития рака легкого.
Функциональный агент для разложения никотина по настоящему изобретению включает в себя приблизительно 0,32 мг/мг катехина и 56 нг/мг кверцетина.
Функциональный агент готовят путем фильтрации фруктов и овощей, концентрирования корней, кожуры и листьев и их смешивания и сушки.
Фильтраты орехов, фруктов и овощей готовят путем промывания, измельчения, экстрагирования и фильтрования от 7,5 до 75 частей по массе орехов гингко, от 3 до 30 частей по массе сельдерея, от 3 до 30 частей по массе лимона и от 3 до 30 частей по массе яблока. Фильтрация может быть традиционным методом, и более предпочтительно использовать сетку или диатомит. Наиболее предпочтительно фильтровать с использованием сетки и диатомита 100 меш для предотвращения осаждения в водной фазе. Кроме того, на стадии фильтрования предпочтительно добавить умеренное количество воды в осадок после первой экстракции и перемешать, экстрагировать и снова профильтровать для того, чтобы эффективно экстрагировать эффективные ингредиенты. Фильтраты орехов, фруктов и овощей хранят при 0-7°С.
Концентраты корней, кожуры и листьев готовят путем добавления от 400 до 4000 частей по массе воды, от 3 до 30 частей по массе лакричного корня и от 1,5 до 15 частей по массе высушенной апельсиновой кожуры в ванну для экстракции, увеличения температуры до 100°С и их экстракции. И затем, после добавления от 100 до 1000 частей по массе воды в ванну для экстракции, добавляют от 7,5 до 75 частей по массе листьев шелковицы. Экстракцию осуществляют в течение от 10 до 40 минут при 60-95°С. Концентраты корней, кожуры и листьев готовят путем фильтрования и концентрирования экстракта. Приведенный выше способ фильтрования предпочтительно является традиционным способом и, более предпочтительно, могут быть использованы сетка, домашнее фильтрование (housing filtration) или диатомит. Наиболее предпочтительным способом является фильтрация с использованием сетки 100 меш, домашнего фильтра (housing filter) 1 мкм и диатомита. После первой экстракции к оставшемуся осадку дополнительно добавляют от 400 до 4000 частей по массе воды, и концентраты корней, кожуры и листьев могут быть приготовлены путем экстракции и повторного фильтрования.
Стадия смешивания и приготовления порошка включает в себя смешивание от 50 до 500 частей по массе порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагированного из листьев зеленого чая, с описанными выше фильтратами орехов, фруктов и овощей, а также концентратами корней, кожуры и листьев, удаление осадка с помощью высокоскоростного центробежного сепаратора и сушку. Сушка может представлять собой общепринятый способ, предпочтительно распылительную сушку.
Настоящее изобретение далее объясняется более подробно со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры, тем не менее, ни в коем случае не следует расценивать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
ПРИМЕР 1
Функциональный агент для разложения никотина
Стадия приготовления Фильтратов орехов. фруктов и овощей
60 кг очищенных и невысушенных орехов гингко, 24 кг промытого сельдерея, 24 кг яблок и 24 кг лимонов отжимали после измельчения в мельнице. К остатку после отжимания добавляли 100 л воды, перемешивали в течение 30 минут, отжимали повторно и объединяли с жидкостью после первого отжимания. Выжатую жидкость фильтровали через сетку 100 меш и диатомит и хранили при 4°С.
Стадия приготовления концентратов корней, кожуры и листьев
После добавления 0,5 тонн воды в 1,5-тонный бак добавляли 24 кг лакричного корня и 12 кг высушенной апельсиновой кожуры и экстрагировали в течение 2 часов при 100°С. После добавления в бак 0,2 тонны воды добавляли 60 кг листьев шелковицы и первый раз экстрагировали в течение 30 мин при 80°С. Пока первый экстракт хранили отдельно, к остатку добавляли 0,5 тонны воды и второй раз экстрагировали в течение 30 мин при 80°С. Первый и второй экстракты смешивали, фильтровали через сетку 100 меш, 1 мкм домашний фильтр и диатомит и концентрировали.
Стадия смешивания и распылительной сушки
После равномерного смешивания 100 кг порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагированного из листьев зеленого чая, с фильтратами орехов, фруктов и овощей и концентратами корней, кожуры и листьев и удаления осадка с помощью высокоскоростного центробежного сепаратора готовили разлагающий никотин агент путем распылительной сушки.
ПРИМЕР 2
Функциональный напиток для разложения никотина
Функциональный напиток для разложения никотина готовили путем смешивания 100 мл воды с от 0,1 до 5 г функционального агента для разложения никотина из примера 1.
ПРИМЕР 3
Тестирование действия функционального агента для разложения никотина
Для того чтобы подтвердить существование в функциональном агенте, приготовленном в примере 1, вещества, разлагающего никотин, способность никотина к разложению измеряли путем прямого смешивания никотина в воде и функционального агента для разложения никотина соответственно. Воду использовали в качестве контроля.
200 мкл 1 мМ никотина (номер по каталогу №3876, Sigma) и 200 мкл раствора функционального агента (0,3%) равномерно смешивали в пробирке Эппендорфа (1,5 мл). Через 0, 10, 20, 30, 60 и 120 минут количество образовавшегося котинина определяли с использованием количественного способа определения котинина, при этом количество образовавшегося котинина изображено на Фиг.5. Температура в испытании составляла 25°С.
В настоящем тесте был использован модифицированный способ Барлоу (Barlow), который прост и наиболее точен и был разработан в 1987 году (Barlow, R.D., Stone, R.В., Wald, N.J., and Puhakainen, E.J. (1987) Clin. Chim. Act., 165, 45-52). Конкретный способ описан ниже.
200 мкл образца и стандарта добавляли в буферный раствор или дистиллированную воду в полипропиленовой пробирке на 1,5 мл. Для улучшения достоверности результата теста на каждый образец использовали 3 пробирки. 100 мкл 4 М буферного раствора ацетата натрия (рН 4,7), 40 мкл 1,5 М KCN, 40 мкл 0,4 М хлорамина-Т, 200 мкл 78 мМ барбитуровой кислоты, растворенной в 50% по объему ацетонитриле, последовательно добавляли в образец и перемешивали в течение 10 секунд. Реакция в смеси протекала в течение 15 минут при комнатной температуре (25°С), и реакцию останавливали после добавления 40 мкл 1 М метабисульфата натрия. Оптическую плотность измеряли при 490 нм, и образец количественно определяли в сравнении со стандартом котинина.
Кроме того, аналогичный тест осуществляли при 15 и 37°С. Причина проведения теста при различных температурах заключалась в том, чтобы проверить, является ли процесс, связанный с образованием котинина, химической реакцией или реакцией, связанной с биологическим катализатором (таким как фермент). Результат теста при различных температурах был почти таким же, как результат теста при 25°С.
Как показано на Фиг.5, хотя оптическая плотность по котинину функционального агента по настоящему изобретению составляла 3,0, оптическая плотность воды составляла лишь 1,3. Таким образом, это подтверждает то, что в составе функционального агента по настоящему изобретению присутствует вещество, разлагающее никотин. В дополнение, при отсутствии функционального агента время превращения никотина в продукт разложения было очень медленным (приблизительно от 10 до 20 минут). Наоборот, было обнаружено, что в присутствии функционального агента котинин превосходно образуется. Это демонстрирует, что функциональный агент по настоящему изобретению реагирует с никотином в пробирке таким образом, что это способствует разложению никотина.
ПРИМЕР 4
Измерение способности никотина к разложению в клеточной культуре
Клетки обрабатывали никотином и функциональным агентом, и определяли количество котинина, образовавшегося из никотина. Как правило, количество выкуренного измеряют по количеству никотина, котинина, тиоцианата и карбоксигемоглобина курильщика. Однако, поскольку никотин имеет период полувыведения 30 минут, он не такой стабильный, как котинин, период полувыведения которого составляет 24 часа.
Маточные клетки готовили путем выращивания клеток FLCFR5, полученных в течение недели из гепатоцитов человека, и разделения на небольшие количества. Для количественного определения разделенные гепатоциты выращивали в течение одной недели до получения 100% конфлюэнтности. И затем их в течение недели дополнительно выращивали в среде, содержащей никотин (5% сыворотка плода коровы (СПК) с добавлением модифицированной по способу Дульбекко среды Игла (DMEM), 1 мМ никотин). К выращиваемым клеткам добавляли 120 мкл раствора функционального агента (0,3%) и продолжали выращивание, а затем клетки собирали через 10, 20, 30, 60, 120 минут. Собранные клетки три или четыре раза промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР) и собирали скребком. После того как клетки собраны с помощью центробежного сепаратора и добавлены 100 мкл ФБР (4°С), клетки измельчали с помощью ультразвукового разрушителя (Vibra Cell-200; Newton, Conn., США) в течение 30 секунд с промежутками и оптическую плотность измеряли при 490 нм с использованием метода DBA. Кроме того, в качестве контроля использовали воду и ее тестировали тем же способом.
На Фиг. 6 представлен график, который демонстрирует способность функционального агента разлагать никотин, и он показывает, что клетки, в отношении которых применен функциональный агент по настоящему изобретению, продуцируют больше котинина, чем клетки, служащие в качестве контроля.
В дополнение, когда функциональный агент для разложения никотина уже поглощен клеткой, подтверждается способность к разложению вновь введенного никотина.
Клетки FLCFR5 предварительно выращивали в культуральной среде, содержащей функциональный агент (120 мкл функционального агента на 1 мл культуральной среды) в течение 6 часов. После предварительного выращивания клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР) и выращивали в среде, содержащей никотин. Количество котинина в клетках измеряли тем же самым способом.
На Фиг.7 продемонстрирована способность функционального агента разлагать никотин в клетках, которые уже абсорбировали функциональный агент. Клетки, уже абсорбировавшие функциональный агент, образуют гораздо больше котинина, чем клетки, которые не абсорбировали агент. При сравнении с клетками на Фиг.6, к которым функциональный агент был добавлен позже, количество образовавшегося котинина в обоих случаях оказалось одинаковым. Это значит, что не существует значительного различия между длительным поступлением функционального агента и его поступлением непосредственно перед курением.
Результаты разложения никотина на Фиг.6 и 7 имеют тот же вид, что и на Фиг.5, который отражает способ прямого смешивания. Это можно объяснить следующим образом. Ингредиент, обладающий способностью к разложению никотина, легко проходит через клеточную мембрану и сохраняет стабильность в клетке. Стабильность вещества имеет одну и ту же картину независимо от возраста клетки. Когда клетки, одинаково поделившиеся до состояния полной конфлюэнтности, выращивали далее, наблюдали ту же самую картину как та, когда они достигали 60-100% конфлюэнтности. Разложению никотина значительно способствовало наличие функционального агента. Общепринятое мнение о том, что для курильщика, который пьет зеленый чай, облегчение разложения никотина и образование котинина с помощью функционального агента происходит вследствие добавления витамина С и абсорбции никотина катехином, является необоснованным. Это происходит потому, что усиленное превращение никотина в котинин в присутствии экстракта зеленого чая не может быть объяснено этими причинами. Таким образом, авторы настоящего изобретения могут выдвинуть другие предположения: неизвестный ингредиент функционального агента связан с превращением или превращению из никотина в котинин способствует совершенно отличный механизм. Теория осаждения, в соответствии с которой катехин осаждает токсическое вещество, такое как никотин, путем абсорбции, может объяснить уменьшение свободного никотина в клетке. Тем не менее, обнаружено, что в присутствии функционального агента, когда увеличивается время выращивания, количество котинина возрастает. Это значит, что неизвестный ингредиент функционального агента, отличный от катехина, влияет на разложение никотина,
ПРИМЕР 5
Измерение способности к разложению никотина путем использования незрелой яйцеклетки Zenopus
Для того чтобы исключить период времени между временем введения никотина или функционального агента и временем абсорбции клетками, никотин или функциональный агент непосредственно вводили в незрелую яйцеклетку Zenopus (ооцит) и измеряли способность к разложению никотина.
После отделения незрелой яйцеклетки от материнской и отбора стадии IV или V, которая имеет диаметр 1,0-1,2 мм, яйцеклетку выращивали в течение суток при 15°С в растворе OR2 (Byrd, G.D., Chang, K-M., Greene, J.M., deBethizy, J.D. (1992) Drug. Metab. Dispos., 20, 192-197). После выращивания защитную мембрану незрелой яйцеклетки перед использованием непосредственно удаляли с помощью пинцета (часовщика) и приготовление множества незрелых яйцеклеток путем удаления защитных мембран осуществляли с использованием коллагеназы III типа (Sigma) (Lee DH. (1998) J. Biochem. Molecular Biology, 31(2), 196-200).
500 нл перемешанного раствора 1 мМ никотина и 120 мкл раствора функционального агента (0,3%) вводили в незрелую яйцеклетку с использованием микрооператора. После введения незрелые яйцеклетки выращивали при 15°С, 25°С (нормальная температура) и 32°С, соответственно, собирали через 0, 10, 20, 30, 60, 120 секунд и осуществляли гомогенизацию (гомогенизатор Даунса) в растворе OR2. Желток из гомогената удаляли с использованием центробежного сепаратора и раствор супернатанта отбирали для количественного определения котинина. В дополнение, для того чтобы исключить влияние способа введения, способность функционального агента к разложению никотина была подтверждена при концентрациях никотина и функционального агента, используемых в тесте с клеточной культурой для того же самого времени выращивания в культуральной среде OR2.
На Фиг.8 представлен график, демонстрирующий способность функционального агента по настоящему изобретению к разложению никотина, когда функциональный агент и никотин вводят в ооцит Zenopus. Он демонстрирует более высокую способность к разложению никотина, чем на Фиг.6. Кроме того, реактивность ооцита Zenopus измеряли в соответствии с температурой выращивания, но никаких различий не наблюдалось.
ПРИМЕР 6
Измерение способности к разложению никотина с помощью клинического теста
Для подтверждения способности функционального агента к разложению никотина был осуществлен клинический тест. Тестируемыми субъектами в клиническом тесте были двадцать здоровых мужчин (от 17 до 20 людей), которые выкуривали от 15 до 25 сигарет в день, и табак был марки "THIS" (товарный знак, имеющийся в продаже).
Чтобы гарантировать результат теста, тест был повторен несколько раз и результаты усреднили. Тестируемую группу, принимавшую функциональный агент, и контрольную группу, принимавшую воду, тестировали в разные дни. По возможности, состояние организма и время проведения теста были согласованы в течение теста. Тестируемые субъекты курили как обычно, и Фиг.9 показан способ теста.
Первый, второй и третий сбор мочи немедленно переносили для хранения на -20°С. Через 48 часов количественно определяли котинин, который является важным метаболитом никотина в моче. Подробный способ состоит в следующем.
500 мкл мочи или стандартного образца помещали в пробирку на 1,5 мл. Для гарантии достоверности результата теста использовали две пробирки на образец. 250 мкл 4 М натрий-ацетатного буферного раствора (рН 4,7), 100 мкл 1,5 М KCN, 100 мкл 0,4 М хлорамина-Т, 500 мкл 78 мМ барбитуровой кислоты, растворенной в 50% по объему ацетонитрила, последовательно добавляли в образец и перемешивали в течение 10 секунд. Реакция в смеси протекала при 100 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре (25°С) и реакцию останавливали после добавления 100 мкл 1 М метабисульфита натрия. Оптическую плотность измеряли при 490 нм, и образец количественно определяли в сравнении со стандартной кривой.
На Фиг. 10 представлен график, который демонстрирует способность к разложению никотина у курильщиков, принявших функциональный агент для разложения никотина. (А) представляет собой контроль, и после того как тестируемые субъекты выпили воду и покурили, количественно определяли котинин в моче. (Б) представляет собой количественно определенный котинин, содержащийся в моче, после того как тестируемые субъекты выпили функциональный агент и покурили. Первый, второй и третий сбор мочи производили у 37 курильщиков.
На Фиг.11 представлен график, который демонстрирует среднюю концентрацию котинина у курильщиков, принявших функциональный агент по настоящему изобретению. Поскольку группа, принявшая функциональный агент, имела большее количество котинина в моче, чем контрольная группа, подтверждается, что способность функционального агента к разложению никотина высока.
На Фиг.12 представлен график, который демонстрирует среднюю величину котинина на человека, содержащуюся в моче курильщиков, покуривших после приема функционального агента или воды. Величина во втором или третьем сборах мочи, поделенная на величину в первом сборе мочи на человека, усреднена и сравнивает функциональный агент с водой.
Скорость разложения никотина основана на образовании котинина во втором и третьем сборах мочи. После осуществления первого, второго и третьего сбора мочи весь котинин, оставшийся в моче, выводится, таким образом, это подтверждает, что никотин разложился до котинина. Кроме того, скорость разложения никотина (скорость образования котинина) в тестируемой группе приблизительно в два раза больше, чем в контрольной группе. Это демонстрирует, что функциональный агент по настоящему изобретению способствует разложению никотина до котинина в организме.
В дополнение, готовят таблетки, включающие в себя функциональный агент.
Здоровые сорокалетние мужчины (от 20 до 30 человек), которые курили свыше 2 лет, были разделены на две группы и протестированы в течении 2 дней.
Тестируемые субъекты курили каждый час в течение 8 часов и мочу собирали 5 раз. Тестируемым субъектам группы 1 три раза давали по 2 таблетки в данный момент времени. Группе II давали один раз 6 таблеток и собирали мочу.
<Способ теста>
Контроль (группа 1 и группа II): питье воды и курение → первый сбор мочи через 1 час, питье воды и курение → через 1 час второй сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час третий сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час курение → через 1 час четвертый сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час курение → через 1 час курение → через час пятый сбор мочи.
Группа I: прием 2 таблеток, питье воды и курение → через 1 час первый сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час второй сбор мочи и курение → через 1 час третий сбор мочи, прием двух таблеток, питье воды и курение → через 1 час курение → через 1 час четвертый сбор мочи, прием двух таблеток, питье воды и курение → через 1 час курение → через 1 час курение → через 1 час пятый сбор мочи.
Группа II: прием шести таблеток, питье воды и курение → через 1 час первый сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час второй сбор мочи и курение → через 1 час третий сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час курение → через 1 час четвертый сбор мочи, питье воды и курение → через 1 час курение → через 1 час курение → через 1 час пятый сбор мочи.
Собранную мочу немедленно помещали на -20°С. Через 48 часов в моче количественно определяли котинин, который является важным метаболитом никотина.
| (Таблица 1) | ||||||
| 1-й | 2-й | 3-й | 4-й | 5-й | ||
| Контроль | Среднее значение котинина в группе I (мкМ) | 16,46 | 10,84 | 12,59 | 13,84 | 9,98 |
| Среднее значение котинина в группе II (мкМ) | 34,86 | 15,48 | 21,49 | 28,59 | 19,14 | |
| Среднее значение котинина в группе I (мкМ) | 19,29 | 11,95 | 18,51 | 18,88 | 16,32 | |
| Среднее значение котинина в группе II (мкМ) | 42,26 | 31,37 | 32,72 | 36,72 | 25,48 | |
| Увеличение концентрации котинина в группе I (%) | 17,2 | 10,2 | 47,0 | 36,4 | 63,5 | |
| Увеличение концентрации котинина в группе II (%) | 21,2 | 102,6 | 52,3 | 28,4 | 33,1 |
При приеме таблетки величина котинина в моче повышалась на 60-100% по сравнению с приемом одной воды. Моча, собранная в группе I, содержала фиксированную концентрацию котинина в течение периода проведения теста, а концентрация котинина в моче, собранной в группе II, была почти идентичной концентрации в контрольной группе через 10 часов.
ПРИМЕР 7
Ингибирующее действие функционального агента на образование нитрозоморфолина
Настоящий тест относится к тесту in vitro, касающемуся того, ингибирует ли функциональный агент образование вышеуказанного канцерогена, когда нитрозирующие агенты, такие как азотистая кислота, нитритный эфир, тиоэфир, безводная азотистая кислота, нитрозилгалогенид, нитрозилметалл и неорганические металл-нитритные комплексы, вступают в реакцию с амином или соединением, содержащим другой азот, с образованием канцерогена, такого как нитрозамин или N-нитрозосоединение.
Тест основан на патенте США №5087671 (полимеры для захвата нитрозирующих агентов) и осуществляется с помощью метода DBA (метод прямой барбитуровой кислоты), при котором котинин обнаруживается в моче, и метода газовой хроматографии с предварительной обработкой (Joseph, D., Lajos H., Nigel, H., Stanley, I.R., and Timothy, T. (1992) J. Chromatogr., 579, 93-98).
Нитрозаминные побочные продукты главным образом являются результатом реакции амина и нитрозирующего агента. Первый нитрозирующий агент образуется из нитрита, такой как нитрат натрия (NaNO2) или нитрат калия (KNO2), в кислоте, а образующимся продуктом является азотистая кислота (HNO2).
(Химическая формула 1)
ЭГКГ, кверцетин, катехин, витамин С и порошкообразный зеленый чай использовали в качестве контроля. Каждый образец использовали в концентрации 2,5, 5, 10, 15, 20 мг/мл. 200 мМ нитрат натрия, не содержащий морфолин, использовали в качестве отрицательного контроля. Образец, не содержащий нитрозирующий агент NaNO2, использовали в качестве слепого опыта в каждой реакции.
Каждый образец добавляли в 15 мл пробирки corning в соответствии с концентрацией и помечали как слепой опыт, тест, отрицательный контроль. В каждую пробирку добавляли 1 мл ледяной уксусной кислоты и в каждую пробирку за исключением пробирки со слепым опытом добавляли 100 мкл 2 М NaNO2, и добавляли дистиллированную воду для доведения общего объема до 2 мл. После проведения реакции в течение 10 минут при 37°С добавляли 176 мкл морфолина, чтобы его концентрация составляла 2 М, и далее реакцию осуществляли в течение 30 минут при 37°С. Реакцию останавливали путем добавления 3,8 мл 5 н. NaOH для установления рН от 10 до 12. В соответствии с методом DBA образцы оценивали и сравнивали с группой, в которой осуществляли слепой опыт (без добавления NaNO2), и отрицательной контрольной группой (без добавления морфолина и 200 мМ NaNO2). Результат показан на Фиг.13.
Скорость образования нитрозоморфолина (НМОР%) измеряют по указанной ниже расчетной формуле 1.
(Расчетная формула 1)
НМОР% = [(t0-слепой опыт) - ((t30-слепой опыт)]/(t0-слепой опыт)
Слепой опыт обозначает образец, не содержащий нитрозирующий агент NaNO2
t0 обозначает образец, содержащий 200 мМ NaNO2 без морфолина
t30 обозначает образец, нормально вступающий в реакцию при образовании нитрозоморфолина
Как показано на Фиг. 13, функциональный агент для разложения никотина по настоящему изобретению демонстрирует 75% ингибирование образования нитроморфолина из морфолина при концентрации 20 мг/мл, подобно очищенному кверцетину или катехину. Таким образом, функциональный агент по настоящему изобретению ингибирует образование канцерогенного нитрозосоединения.
ПРИМЕР 8
Тестирование ингибирующего действия функционального агента для разложения никотина в отношении активности цитохрома Р450
Цитохром Р450 (далее "CYP") является основным ферментом, который осуществляет детоксикацию в легком или печени. Различные типы CYP осуществляют разные функции в печени и из них CYP 2А6, 2В6, 2С8, 2С9, 2D6, 2Е1, 2F1 связаны с метаболизмом котинина из никотина (Yamazaki, H., Inui, Y., Yun, С.H., Guengerich, F.P., and Shimada, T. (1992) Carcinogenesis, 13, 1789-1794; Code, E., Crespi, С., Penman, В., Gonzalez, F., Chang, Т., and Waxman, D. (1997,) Drug Metab. Dispos., 25, 985-993). HHK является проканцерогеном для лабораторных животных, и он метаболизируется до канцерогена с участием CYP 1A2, 2А6 и 3А4. На Фиг. 14 показан метаболизм никотина.
В настоящем тесте измеряется ингибирующее действие различных тестируемых веществ в отношении CYP, связанное с активацией HHK, после индукции CYP печени крысы (Sprague-Dawley) Aroclor 1254 (Sigma, США) и удаления печени. Подробности способа теста описаны ниже.
Aroclor 1254 в количестве 500 мг/кг вводили в брюшную полость самцов крыс (Sprague-Dawley) в возрасте 7 недель. Через 5 дней печень удаляли в стерильных условиях и гомогенизировали с использованием 0,15 М раствора KCI при 4°С. Супернатант отделяли от гомогената путем центрифугирования в течение 10 мин при 9000 g и использовали в тесте. Активность CYP оценивали путем использования пентоксирезоруфина (Sigma США), который является субстратом для CYP 2B1/2/4, этоксирезоруфина (Sigma США), который является субстратом для CYP 1A1, и метоксирезоруфина (Sigma США), который является субстратом для CYP 1A2. Кроме того, ЭГКГ, кверцетин, катехин и порошкообразный зеленый чай использовали в качестве контрольной группы и сравнивали с функциональным агентом из примера 1. Ингибирующее действие в отношении активности CYP сравнивали, используя вышеописанный реакционный образец (ингибирующее вещество), супернатант, полученный из печени, и специфический субстрат для каждого CYP. Если субстрат разлагается ферментом и проявляет флуоресценцию, активность фермента оценивают с помощью спектрофлуорофотометра (возбуждение при 522 нм и эмиссия при 586 нм). Каждый образец имеет концентрацию 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мг/мл, и количество белка, выделенного из печени, приводят к 500 мкг/мл. Каждый субстрат имел концентрацию в маточном растворе 2,5 мкМ, а в конце становился 25 нМ после добавления 10 мкл. В качестве кофермента использовали 20 мкл 5 мМ восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата (β-НАДФН) (Sigma, США). И затем конечный объем доводили до 1 мл, используя 50 мМ буферный раствор Tris-HCl (рН 7,4). Реакцию осуществляли при 37°С в течение 20 мин, останавливали после добавления 2 мл метанола и реакционную смесь разделяли путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 2 минут. Активность фермента оценивали в супернатанте путем использования спектрофлуорофотометра RF-5301 PC (SHIMADZU, Япония) (возбуждение при 522 нм и эмиссия при 586 нм). На Фиг.15 показан результат.
На Фиг.15 представлен график, который демонстрирует влияние функционального агента для разложения никотина по настоящему изобретению на ферментативную активность CYP. (А) демонстрирует ингибирующее действие кверцетина на CYP, (Б) - показано для катехина, (В) - показано для функционального агента и (Г) - показано для порошкообразного зеленого чая. ПРОД обозначает пентоксирезоруфин-деалкилазу (CYP 2B1/2/4), ЭРОД обозначает этоксирезоруфин-деалкилазу (CYP1A1) и МРОД обозначает метоксирезоруфин деалкилазу (CYP 1A2). Функциональный агент ингибировал все: ПРОД, ЭРОД и МРОД.
На Фиг. 16 продемонстрировано ингибирующее действие функционального агента по настоящему изобретению в отношении активности фермента CYP 1A2. Активность CYP 1A2 ингибировали в следующем порядке: кверцетин >> функциональный агент >> катехин = порошкообразный зеленый чай. Было подтверждено, что 1,0 мг/мл функционального агента полностью ингибирует активность CYP1A2.
В дополнение, ингибирующее действие функционального агента ЭГКГ, кверцетина, катехина и порошкообразного зеленого чая в отношении ферментативной активности оценивали путем использования очищенной RECO® System CYP1A2 (PanVera Co., США).
Состав ферментативной смеси включает в себя 0,5 мкМ CYP 1A2, 0,2 мкМ НАДФН-Р450-редуктазы, 0,5 мкг/мкл 3-[(3-холамидопропил)диметиламмонио]-1-пропансульфоната (ХАПДМПС), 0,1 мкг/мкл липосом (дилауроилфосфатидилхолин, дилеоилфосфатидилхолин, дилауроилфосфатидилхолин (1:1:1)), 3 мМ восстановленный глутатион и 50 мМ HEPES/KOH (рН 7,4). Буферный раствор представляет собой 1 М калия/натрия фосфат. 768 мкл трехкратно дистиллированной воды, 126,7 мкл буферного раствора CYP 1A2 и 5,3 мкл 1 мМ метоксирезоруфина последовательно добавляли для получения 950 мкл раствора и нагревали при 37°С. В 85 мкл буферного раствора и субстратной смеси добавляли 5 мкл вещества, ингибирующего ферментативную активацию, для получения конечной концентрации 0,1, 0,5, 1,0 и 2,0 мг/мл, соответственно. Реакция начиналась при 37°С при добавлении 5 мкл ферментативной смеси CYP1A2 и 5 мкл 50 мМ НАДФН. Реакцию проводили в течение 20 минут и останавливали путем добавления 1 мл метанола. Ферментативную активность оценивали с помощью RF-5301 PC спектрофлуорофотометра (SHIMADZU, Япония).
На Фиг.17 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие функционального агента по настоящему изобретению в отношении активности очищенного фермента CYP 1A2. Активность CYP 1A2 ингибировали в следующем порядке: ЭГКГ >> функциональный агент >> кверцетин >> порошкообразный зеленый чай >> катехин. Было подтверждено, что 0,1 мг/мл функционального агента (
) полностью ингибирует ферментативную активность очищенного CYP 1A2.
ПРИМЕР 9
Антимутационное действие функционального агента для разложения никотина
ННК (4-метилнитрозоамино-1-3-пиридил-1-бутанон) содержится в табаке в определенной концентрации (приблизительно 0,1-0,5 нг) и также образуется, когда никотин метаболизируется в организме. Он является очень токсичным веществом для организма. ННК метаболизируется в организме с участием фермента, такого как Р450, вызывая рак легкого. Кроме того, в табаке в небольших количествах содержится бензопирен и действует как мутаген.
Для того чтобы подтвердить наличие у функционального агента по настоящему изобретению антимутационного действия, которое ингибирует мутацию, вызываемую ННК (Chemsyn. Lab. США) и бензопиреном (Sigma, США), осуществляли тест Амеса (Ames) с использованием Salmonella typhimurium ТА100 и ТА1535, которые представляют собой нуждающиеся в гистидине бактериальные штаммы (Maron, D., Ames, В.N. (1983) Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutation Research, 113, 173-215).
Aroclor 1254 (Sigma, США) вводили в брюшную полость 7-недельных самцов крыс (Sprague-Dawley) в концентрации 500 мг/кг. Через 5 дней печень удаляли в стерильных условиях и гомогенизировали с использованием 0,15 М раствора KCl при 4°С. Супернатант отделяли от гомогената посредством центрифугирования в течение 10 мин при 9000 g с получением раствора смеси S-9 и использовали в тесте. Состав раствора смеси S-9 следующий: 5 мл 0,2 М раствора фосфатного буфера (рН 7,4), 0,4 мл 0,1 М НАДФ (никотинамидадениндинуклеотидфосфат), 0,05 мл 1 М глюкоза-6-фосфата, 0,2 мл 0,4 М MgCl2, 1,65 М KCl, 3,35 мл трижды дистиллированной воды и 1 мл печени на 10 мл раствора смеси S-9. Тестируемые вещества представляли собой ЭГКГ, кверцетин, катехин, порошкообразный зеленый чай и функциональный агент, и их использовали после фильтрации через 0,2 мкм фильтр.
Salmonella typhimurium TA100 и ТА1535 выращивали на питательной культуральной среде (Difco. Lab. США) в течение 12 часов. Смешивали 0,1 мкл 12-часового культурального раствора, 0,1 мл тестируемого вещества, 0,5 мл раствора смеси S-9, 0,1 мл ННК (10 мг/мл) или 0,1 мл бензопирена (20 мкг/мл). Эффективный тестируемый материал обрабатывали таким образом, чтобы его концентрация составляла 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 мкг/чашка. После того как раствор смеси простоял при 37°С в течение 20 мин, добавляли 2 мл поверхностного агара (содержащего 0,05 мМ гистидин, 0,05 мМ биотин) и распределяли на среде чашки His-. Среда чашки имеет 3 пласта на объем. После выращивания при 37°С в течение 48 часов подсчитывали количество колоний, представляющих собой восстановленные мутанты. На антимутационную активность указывало уменьшение уровня восстановленных His+ мутантов. Ингибирующее действие в отношении мутации преобразовывали в соответствии со следующей расчетной формулой 2.
(Расчетная формула 2)
Ингибирующее действие в отношении мутации (%)=100Х[(а-b)/(а-с)]
а обозначает количество колоний, представляющих собой восстановленные His+ мутанты, индуцированные мутагеном;
b обозначает количество колоний, представляющих собой восстановленные His+ мутанты, индуцированные мутагеном и тестируемым веществом;
с обозначает количество колоний, представляющих собой спонтанно восстановленные His+ мутанты.
На Фиг.18 продемонстрирован результат ингибирующего действия функционального агента для разложения никотина по настоящему изобретению в отношении мутагенности ННК. (А) и (Б) демонстрируют ингибирующее действие функционального агента (
), порошкообразного зеленого чая (
), кверцетина (
) и катехина (
) в отношении мутации Salmonella typhimurium TA100. (В) и (Г) демонстрируют ингибирующее действие функционального агента (), порошкообразного зеленого чая (), кверцетина () и катехина () в отношении мутации Salmonella typhimurium ТА1535. Концентрация ННК, содержащегося в среде, составляла 1 мг/чашка.
Количество спонтанно восстановленных мутантов Salmonella typhimurium ТА100, которые были обработаны только ННК, составляло 173±13, а количество спонтанно восстановленных мутантов Salmonella typhimurium ТА1535 составляло 39±12. В противоположность, когда обрабатывали ННК и функциональным агентом 0,5 мг/чашка, колонии Salmonella typhimurium едва формировались. Таким образом, подтверждается существование ингибирующего действия в отношении мутации.
На Фиг. 19 представлен график, демонстрирующий ингибирующее действие в отношении мутации, вызванной бензопиреном, при использовании функционального агента по настоящему изобретению и тестируемого вещества. Он демонстрирует ингибирующее действие функционального агента (), порошкообразного зеленого чая (), кверцетина () и катехина () в отношении мутации Salmonella typhimurium ТА100. Концентрация бензопирена, содержащаяся в каждой среде, составляла 2 мкг/чашка. Количество спонтанно восстановленных мутантов Salmonella typhimurium ТА100, которые были обработаны бензопиреном, составляло 128±9. В противоположность, функциональный агент по настоящему изобретению эффективно ингибировал возникновение мутаций, вызванных бензопиреном.
ПРИМЕР 10 Антиоксидантное действие функционального агента для разложения никотина
Хотя причины многих заболеваний остаются до сих пор неясными, известно, что токсические свободные радикалы опосредуют множество типов заболеваний, таких как артериосклероз (Palinski, W., Rosenfeld, M.E., Yla, H.S., Gurtner, G.С., Socher, S.S., Butler, S. W., Carew, Т.E., Steinberg, D., and Witztum, J.L. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci., 86, 1372-1376), местная анемия вследствие сужения кровеносного сосуда (Hammond, В., Kontos, H.A., and Hess, M.L. (1985) Can. J. Physiol. Pharmacol., 63, 173-187), воспаление (Cheeseman, К.H., and Forni, L.G. (1988) Biochem. Pharmacol., 37, 4225-4233), рак (Weitzman, S.A., Weitberg, А.В., Clark, E.P., and Stossel, T.P. (1985) Science, 227, 1231-1233) и суставной ревматизм (Fantone, J.С., and Ward, P.A. (1985) Human Pathol., 16, 973-978). Таким образом, можно ожидать, что вещество, захватывающее свободные радикалы, будет являться эффективным лечением путем снижения уровня свободных радикалов. Таким образом, была изучена разработка безопасного и эффективного антиоксиданта.
В настоящем тесте исследовали действие функционального агента, порошкообразного зеленого чая, кверцетина и катехина в отношении захвата О2 - с помощью наборов для определения 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (ДФПГ) и супероксид-дисмутазы (СОД) (Wako, Япония).
ДФПГ растворяли в растворителе, представляющем собой смесь этанола и воды в отношении 2:1, до конечной концентрации 2×10-4 М. Концентрация функционального агента, порошкообразного зеленого чая, кверцетина и катехина составляла 1/10 или меньше от концентрации ДФПГ. 1,5 мл ДФПГ помещали в кювету и добавляли 1,5 мл раствора антиоксиданта и равномерно перемешивали. Сразу после перемешивания измеряли изменение оптической плотности (523 нм) в зависимости от времени и рассчитывали скорость разложения.
(Расчетная формула 3)
Скорость разложения = (начальная оптическая плотность ДФПГ - оптическая плотность после добавления каждого образца в соответствии со временем)/начальная оптическая плотность ДФПГ × 100
Принцип работы набора СОД заключается в том, что когда ксантиноксидаза воздействует на ксантин, образуется O2 -. Образовавшийся О2 - снижает сосуществующий NO2 - ТВ (нитротетразолиевый синий (nitrobluetetrazolium)) с проявлением цветной реакции. Тем не менее, супероксид-дисмутаза (СОД) или вещество, удаляющее образующийся O2 -, ингибирует цветную реакцию. При использовании этого принципа можно оценить ингибирующее действие в отношении образовавшегося O2 -. Способ, касающийся захвата O2 -, заключается в следующем. 0,4 мМ ксантин, 0,1 М раствор фосфатного буфера (рН 8,0) и 0,1 мл каждого образца добавляли к 1 мл ксантиноксидазы (0,048 единиц/мл). Их равномерно перемешивали и нагревали при 37°С в течение 20 мин. Ферментативную реакцию останавливали путем добавления 2 мл 69 мМ SDS (додецилсульфата натрия) и измеряли оптическую плотность при 560 нм. Воду использовали в качестве контроля. Слепой тест для фермента и реактива осуществляли таким же способом. В таблице 2 показаны подробности.
| Таблица 2 | ||||
| Основной тест | Слепой опыт | |||
| Образец(цы) | Слепой опыт (В1) | Слепой опыт с образцом (S-B1) | Слепой опыт с реактивом (В1-В1) | |
| Образец | 0,1 мл (образец) | 0,1 мл (дистиллированная вода) | 0,1 мл (образец) | 0,1 мл (дистиллированная вода) |
| Формирующий окрашивание раствор | 1 мл | 1 мл | 1 мл | 1 мл |
| Раствор фермента | 1 мл | 1 мл | - | - |
| Раствор для слепого опыта | - | - | 1 мл | 1 мл |
Способ расчета эффективности антиоксиданта заключается в следующем.
(Расчетная формула 4)
Величина активации СОД (уровень ингибирования в %)=(EB1-EB1-B1)-(ES-ЕS-В1)/(ЕB1-ЕB1-B1)×100
На Фиг.20 представлен график, демонстрирующий действие функционального агента, порошкообразного зеленого чая, кверцетина и катехина в отношении захвата свободных радикалов с использованием ДФПГ (1,1-дифенил-2-пикрилгидразил). Действие ЭГКГ в отношении захвата радикала ДФПГ было в 2 раза выше, чем действие функционального агента и катехина. Тем не менее, действие функционального агента в отношении захвата радикала ДФПГ было в четыре раза выше, чем у порошкообразного зеленого чая.
На Фиг.21 представлен график, демонстрирующий результат действия функционального агента, порошкообразного зеленого чая, кверцетина и катехина в отношении захвата О2 - с использованием набора СОД. Хотя кверцетин оказывал самое высокое антиоксидантное действие, функциональный агент продемонстрировал такое же действие, как таковое у очищенного катехина.
ПРИМЕР 11
Количественное определение кверцетина
Кверцетин представляет собой флавоноид, открытый исключительно у фотосинтезирующих растений. Когда проводят нормальную диетическую обработку, предполагают, что потребляется 25 мг кверцетина в сутки.
В дополнение, недавно кверцетин использовали как противораковое лекарство при первичном лечении (Ferry, D.R., Smith, A., Malkhandi, J., Fyfe, D.W, deTakats, P.G, Anderson, D., Baker, J., Kerr, D.J. (1996) Cancer Res. 2(4):659-68). Сообщалось о множестве доказательств того, что кверцетин превосходно действует как противораковое лекарство. Сообщалось, что воспроизводство клеточной линии, такой как линии рака груди (Scambia, G., Ranelletti, F. О., Benedetti, Panici, P., Piantelli, M., Bonanno, G., De Vincenzo, R., Ferrandina, G., Pierelli, L, Capelli, A., Mancuso, S. (1991) Cancer Chemother Pharmacol. 28(4):255-8), лейкемии (Larocca, L.M., Piantelli, M., Leone, G., Sica, S., Teofili, L., Panici, P.В., Scambia, G., Mancuso, S., Capelli, A., Ranelletti, F.O. (1990) Type II oestrogen binding sites in acute lymphoid and myeloid leukaemias: growth inhibitory effect of oestrogen and flavonoids. Br.J Haematol. 75(4):489-95), рака матки (Scambia, G., Ranelletti, F.O., Benedetti, Panici, P., Bonanno, G., De Vincenzo, R., Piantelli, M., Mancuso, S. (1990) Synergistic antiproliferative activity of quercetin and cisplatin on ovarian cancer cell growth. Anticancer Drugs. 1(1):45-8), рака желудка (Yoshida, M., Sakai, Т., Hosokawa, N., Marui, N., Matsumoto, K., Fujioka, A., Nishino, H., Aoike, A. (1990) FEBS Lett. 15;260(1):10-3) и рака толстой кишки (Agullo, G., Gamet, L., Besson, C., Demigne, C., Remesy, C. (1994) Cancer Lett. 25;87(1):55-63) ингибировалось при концентрации кверцетина 10 мкМ.
В настоящем тесте определяли количество кверцетина, содержащегося в функциональном агенте для разложения никотина. Для того чтобы экстрагировать кверцетин, содержащийся в функциональном агенте или порошкообразном зеленом чае, их растворяли в экстрагирующем растворе, представляющем собой смесь метанола и диметилсульфоксида (4:1), и энергично смешивали в течение 30 секунд. Смешанный раствор центрифугировали в течение 10 минут при 9000 об/мин и супернатант отделяли. Смешивали одинаковое количество супернатанта и дистиллированной воды и наносили на обращенно-фазовую колонку (Delta-pak С18, 300 Å, Waters 510). В качестве подвижной фазы использовали 56% 0,1 М ацетата аммония (рН 5,15) и 44% метанола, и скорость потока составила 0,3 мл/мин. Оптическую плотность измеряли при 375 нм с помощью детектора оптической плотности М720 (Yongin, Co. Корея).
На Фиг.22 представлен график, демонстрирующий количество кверцетина, содержащегося в растворе функционального агента для разложения никотина, определенное с помощью ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии), (а) на А Фиг. 22 демонстрирует стандартный пик 60, 120, 160 нг концентрации кверцетина и (б) на Б демонстрирует пик кверцетина (номер 8) для раствора функционального агента, таким образом, функциональный агент содержит 56 нг/мг кверцетина. Тем не менее, как видно из В на Фиг. 22, пик кверцетина не был обнаружен в порошкообразном зеленом чае даже при 5 мг.
ПРИМЕР 12
Противораковая активность функционального агента
Среди канцерогенов, обнаруженных в табачном дыме, ННК демонстрирует высокую специфичность к индуцированию рака легких у различных лабораторных животных (Hoffmann, D., Rivenson, A., Chung, F-L., and Hecht, S.S. (1991) Crit. Rev. Toxicol, 21, 305-311; International Agency for Research on cancer. (1986) Tobacco Smoking, Vol 38. Lyon, France: IARC). Кроме того, ННК является одним из нитрозаминов, который представляет собой сильный канцероген, обнаруженный в табаке. Было множество публикаций, касающихся действия зеленого чая, особенно ЭГКГ, в отношении ингибирования возникновения рака легких (Wang, Z.Y., Hong, J.Y., Huang, М.Т., Reuhl, К.R., Conney, A.H., and Yang, C.S. (1992) Cancer Res. 52, 1943-1947; Xu, Y., Но, С.Т., Amin, S.G., Han, C., and Chung, F.L. (1992) Cancer Res. 52, 3875-3879; Chung, F.L., Wang, Z.Y., Rivenson, A., Latropoulos, М.J., Reinhardt, J.C., Pittman, В., Но, С.Т., and Amin, S.G. (1998) Cancer Res. 58, 4096-4101).
3-Недельные мыши A/J были приобретены в SLC Inc. (Япония). Животных содержали в специальных условиях, свободных от патогенов, и размещали в стандартизованных условиях (пять мышей на клетку; 20±5□, 50 ± 15% и 12 часовые циклы свет-темнота). Маточные растворы ННК готовили в ФБР (5 мг/мл). Действие функционального агента в отношении образования опухоли, вызванного ННК, изучали, используя модель, разработанную Xu et al. (1992).
Когда мыши A/J достигли 6 недельного возраста, 24 самцов разделили на следующие три группы: группа N (5 животных, только вода), группа С (10 животных, обрабатывали ННК и водой) и группа Т (9 животных, обрабатывали ННК и функциональным агентом). В тесте на животных для каждой группы в качестве источника питья использовали воду и 0,6% функциональный агент в течение трех недель перед обработкой ННК. Через три недели группы С и Т, за исключением группы N, обрабатывали три раза в неделю в течение 10 недель. Мышам A/J интраперитонеально вводили разовую дозу ННК (34,95 мг/кг массы тела).
Через шесть недель животных взвешивали и умерщвляли путем ингаляции диоксидом углерода. Мыши имели доступ к пище и воде (или функциональному агенту) без ограничений, а порошковые кормушки чистили и наполняли свежей пищей три раза в течение эксперимента. Массы тела регистрировали один раз в неделю в течение периода обработки и затем один раз в месяц в течение оставшейся части эксперимента.
Всех животных подвергали полному вскрытию в Корейском Научно-исследовательском Институте Химической Технологии (КНИИХТ). Легкие, печень и желудок вынимали, взвешивали и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. После фиксации ткань разрезали, помещали в парафин, делали срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Для расширенной оценки были сделаны серийные срезы легких с интервалами приблизительно 3 мм. Все срезы анализировали с помощью микроскопа. Появление опухоли определяли путем деления числа животных с опухолью на число животных в каждой группе.
Измеряли среднюю массу каждой группы и наносили на график.
На Фиг.23 представлен график, демонстрирующий массу мышей A/J в каждой группе, который указывает на ингибирующее действие функционального агента для разложения никотина в отношении возникновения рака легких, вызванного ННК.
Обследование мышиной колонии указывало на отсутствие вирусной или бактериальной инфекции к концу эксперимента с раком легких. Во время умерщвления в печени, легких и желудке мышей, которых кормили ННК и функциональным агентом, не наблюдали значительного патологического изменения, связанного с токсичностью. Действия обработок функциональным агентом как химиопрофилактическим агентом в отношении развития опухоли в легких показаны в Таблице 3 в экспериментах.
Таблица 3 демонстрирует ингибирующее действие функционального агента в отношении возникновения рака легких.
| (Таблица 3) | ||||||||||||
| Группа N | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |||||||
| Легкие | Н (15) | Н (16) | Н (15) | Н (15) | Н (15) | |||||||
| Печень | Н | Н | Н | Н | Н | |||||||
| Желудок | Н | Н | Н | Н | Н | |||||||
| Группа С | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Сумма | Итого |
| Легкие | (14) | (14) | (14) | (15) | (14) | (16) | (15) | (13) | (14) | (15) | (144) | 144 |
| Аденома | 0/2 | 6/5 | 2/4 | 1/3 | 5/7 | 3/9 | 1/4 | 3/4 | 6/7 | 4/4 | 31/49 | 80 |
| Гиперплазия | 2/5 | 4/4 | 1/6 | 6/7 | 2/8 | 3/6 | 5/6 | 6/6 | 3/7 | 4/9 | 36/64 | 100 |
| Печень | Н | - | Н | Н | - | Н | Н | Н | - | Н | ||
| Микрогранулема | - | + | - | - | +++ | - | - | - | + | - | ||
| Желудок | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | ||
| Группа Т | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Сумма | Итого | |
| Легкие | (14) | (14) | (14) | (14) | (15) | (14) | (14) | (15) | (12) | (126) | 126 | |
| Аденома | 1/5 | 2/5 | 2/8 | 3/4 | 4/2 | 6/1 | 0/3 | 1/2 | 3/3 | 22/23 | 55 | |
| Гиперплазия | 0/5 | 2/11 | 7/5 | 1/2 | 2/6 | 2/5 | 2/1 | 2/3 | 1/2 | 19/40 | 59 | |
| Печень | - | - | Н | - | - | Н | Н | Н | Н | |||
| Микрогранулема | - | - | - | + | +++ | - | - | - | - | |||
| Желудок | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | Н | |||
| Н - нормально, + - минимально, ++ - слабо, +++ - умеренно |
Как и ожидалось, в группе мышей N не наблюдали случаев спонтанного возникновения опухоли. В группе С выявили 55,6% (80/144) мышей, несущих бронхиоло-альвеолярные аденомы, через 10 недель. Когда 0,6% функциональный агент давали в питьевой воде (группа Т), уровень легочных аденом значительно уменьшался (43,6%, 55/126). В дополнение, принимая во внимание бронхиоло-альвеолярную гиперплазию, возникновение опухоли в группе Т было значительно снижено с 69,4% до 46,8%. В дополнение, микрогранулему печени также наблюдали у некоторых мышей группы С (3 мыши) и группы Т (2 мыши). Возникновения опухолей желудка не наблюдали в двух группах. Этот результат демонстрирует ингибирующие действия функционального агента в отношении возникновения опухолевого процесса в легких у мышей, обработанных ННК. Возникновение опухоли в группе Т соответствует снижению возникновения опухоли легких в этих группах по сравнению с группой С на 17%.
В соответствии с тем, как было описано выше, функциональный агент или напиток по настоящему изобретению способствует разложению никотина и ингибирует образование нитрозосоединения, представляющего собой канцероген. В дополнение, функциональный агент ингибирует активность фермента цитохрома P450 1А2, что приводит к ингибированию образования канцерогена с участием ННК, и демонстрирует антиоксидантное действие, а также ингибирует мутацию, вызванную ННК и бензопиреном, так же как и возникновение рака легких.
ПРИМЕР 18
Тест на токсичность
1. Животные
Виды и линии: Специальные крысы Sprague-Dawley, свободные от патогенов (BioGenomics Inc.)
Крысы Sprague-Dawley являются одними из наиболее широко используемых в тестах на токсичность экспериментальных животных. Вследствие легкого доступа к базовой информации о крысах, может быть очень информативным использовать крыс для оценки результатов экспериментов. В дополнение, крыс отбирали посредством spons или для удовлетворения обязательных требований к тестированию токсичности на грызунах.
Использовали двадцать четыре самца крыс в возрасте 4 недель, имеющих массу 72,2-81,3 г, через 7 дней после карантина и акклиматизации в условиях, свободных от патогенных микроорганизмов. Для этого исследования использовали двадцать самцов, масса которых варьировала от 105,7 до 118,7 г в день обработки. Двадцать четыре самки крыс в возрасте 4 недель, имеющих массу 69,1-80,3 г, использовали через 7 дней после карантина и акклиматизации в условия, свободных от патогенных микроорганизмов. Для этого исследования использовали двадцать здоровых самок, масса которых варьировала от 97,7 до 112,4 г в день обработки.
2. Условия содержания
Условия окружающей среды: в комнате для животных (Комната No. 2 на Территории по Уходу за Животными III) поддерживали температуру 23±3°С, относительную влажность 55±15%, вентиляцию воздуха 10-20 раз/час, и интенсивность освещения 150-300 люкс. Использовали 12-часовой цикл свет-темнота. Весь персонал, обслуживающий животных, носил стерильную одежду, мягкие шапки, маски и перчатки, автоклавированные при 121°С в течение 20 мин. Данный эксперимент проводили в условиях, одобренных Американской ассоциацией лиц по уходу за лабораторными животными (ААЛУЛЖ). Все процедуры одобрены национальным Комитетом по содержанию и использованию животных института (КСИЖИ).
Все время периода карантина и наблюдений 5 животных содержали в клетке из проволочной сетки из нержавеющей стали (220Ш×410Д×200 В мм).
3. Питание
Пища в виде гранул для экспериментальных животных была получена из PMJ Nutritional International Inc., облучена гамма-лучами (10,8 кГр), и животные ее получали без ограничений.
Водопроводную воду системы городского водоснабжения, обработанную ультрафиолетом, давали без ограничений.
Воду анализировали в Daejeon Regional Institute of Health and Environment, Корея.
4. Способ введения
Выбор дозы: поскольку предмет теста разрабатывается как пищевая добавка, предполагается, что его токсичность очень низка. Соответственно, 5000 мг/кг выбрали в качестве самой высокой дозы, как лимитирующей дозы теста, и, затем, 2000 и 800 мг/кг выбрали в качестве средней и низкой доз соответственно, используя общее соотношение 2,5. Также была добавлена контрольная группа.
| (Таблица 4) | |||||
| Группа | Пол | Кол-во животных | № животных | Объем (мл/кг) | Доза (мг/кг) |
| Контроль | Самцы | 5 | 1-5 | 10 | 0 |
| Самки | 5 | 21-25 | 10 | 0 | |
| Т1 | Самцы | 5 | 6-10 | 10 | 800 |
| Самки | 5 | 26-30 | 10 | 800 | |
| Т2 | Самцы | 5 | 11-15 | 10 | 2000 |
| Самки | 5 | 31-35 | 10 | 2000 | |
| Т3 | Самцы | 5 | 16-20 | 10 | 5000 |
| Самки | 5 | 36-40 | 10 | 5000 |
Предмет теста; функциональный агент использовали после растворения в стерилизованной дистиллированной воде непосредственно перед обработкой, а растворы для групп с более низкой дозой готовили пошаговым растворением раствора для группы с самой высокой дозой. Крысы, служившие в качестве контроля и получавшие растворитель, получали лишь стерилизованную дистиллированную воду.
Способ и обработка: Крыс не кормили в течение ночи перед введением дозы и предмет теста вводили перорально через зонд. После введения предмета теста крыс не кормили в течение еще 3-4 часов.
Введение: Предмет теста вводили крысам в виде разовой дозы через зонд в объеме 10 мл/кг массы тела. Вводимый объем рассчитывали в соответствии с массой тела после голодания в день обработки.
5. Наблюдение, измерение и проверка
Смертность и клинические наблюдения: Клинические показатели и смертность проверяли каждый час до 6 часов после введения дозы и затем один раз в сутки до 14 дней.
Масса тела: Массу тела отдельных животных измеряли непосредственно перед введением предмета теста и на 1, 3, 7 и 14 день после обработки.
6. Результаты
Смертность и летальная доза: У обоих полов не было обнаружено ни одного животного, которое умерло от обработки предметом теста в течение периода теста. Поэтому установили, что летальными дозами предмета теста считаются дозы, составляющие свыше 5000 мг/кг у обоих полов.
Клинические показатели: Никакие клинические показатели не были обнаружены в какой-либо из дозовых групп при обработке предметом теста.
В целом обнаружено: При вскрытии на 14 день после обработки не было обнаружено никаких связанных с обработкой эффектов в какой-либо дозовой группе.
Для оценки острой токсичности функционального агента при разовой пероральной дозе его вводили через зонд 5 самцам и самкам крыс Sprague-Dawley, соответственно, при уровнях доз 0, 800, 2000 и 5000 мг/кг массы тела. Параметры, измеряемые в течение 14-дневного периода наблюдения, представляли собой смертность, клинические показатели, изменения массы тела и значительные сведения.
У крыс Sprague-Dawley не было обнаружено никаких связанных с обработкой эффектов в отношении смертности, клинических показателей, изменения массы тела и вскрытия трупа. В группе с самой высокой дозой предмет теста вводили в среднем в дозе 5000 мг/кг, принятой в качестве ограничивающей дозы теста, и результаты этого исследования продемонстрировали, что разовая пероральная доза функционального агента, введенная крысам, не оказывает никакого острого токсического действия вплоть до 5000 мг/кг массы тела.
Основываясь на этих результатах, пришли к выводу, что разовая пероральная доза функционального агента 5000 мг/кг или ниже не оказывает никакого токсического действия на крыс Sprague-Dawley, и минимальные летальные дозы составляют выше 5000 мг/кг массы тела для обоих полов.
ПРИМЕР 1-1
Функциональный агент для разложения никотина
Стадия приготовления фильтратов фруктов и овощей
24 кг яблок отжимали после измельчения в мельнице. К остатку после отжимания добавляли 100 л воды, перемешивали в течение 30 минут, отжимали повторно и объединяли с жидкостью после первого отжимания. Выжатую жидкость фильтровали через сетку 100 меш и диатомит и хранили при 4°С.
Стадия приготовления концентратов корней, кожуры и листьев
После добавления 0,5 тонн воды в 1,5-тонный бак добавляли 24 кг лакричного корня и 12 кг высушенной апельсиновой кожуры и экстрагировали в течение 2 часов при 100°С. После добавления в бак 0,2 тонны воды добавляли 60 кг листьев шелковицы и первый раз экстрагировали в течение 30 мин при 80°С. Пока первый экстракт хранили отдельно, к остатку добавляли 0,5 тонны воды и второй раз экстрагировали в течение 30 мин при 80°С. Первый и второй экстракты смешивали, фильтровали через сетку 100 меш, 1 мкм домашний фильтр и диатомит и концентрировали.
Стадия смешивания и распылительной сушки
После равномерного смешивания 100 кг порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагированного из листьев зеленого чая, с фильтратами фруктов и концентратами корней, кожуры и листьев и удаления осадка с помощью высокоскоростного центробежного сепаратора готовили разлагающий никотин агент путем распылительной сушки.
ПРИМЕР 2-1
Функциональный напиток для разложения никотина
Функциональный напиток для разложения никотина готовили путем смешивания 100 мл воды с от 0,1 до 5 г функционального агента для разложения никотина из Примера 1-1.
1. Функциональный агент для разложения никотина, приготовленный путем сушки композиции, включающей в себя
(а) от 50 до 500 частей по массе порошка эффективного ингредиента зеленого чая, экстрагируемого из листьев зеленого чая,
(б) от 7,5 до 75 частей по массе экстракта листьев шелковицы, настоянного на кипящей воде,
(в) от 3 до 30 частей по массе яблочного сока,
(г) от 3 до 30 частей по массе экстракта лакричного корня, настоянного на кипящей воде, и
(д) от 1,5 до 15 частей по массе экстракта высушенной апельсиновой кожуры, настоянного на кипящей воде.
2. Функциональный агент для разложения никотина по п.1, где этот агент дополнительно содержит композицию, включающую в себя
(а) от 7,5 до 75 частей по массе экстракта орехов гинкго,
(б) от 3 до 30 частей по массе экстракта сельдерея и
(в) от 3 до 30 частей по массе экстракта лимона.
3. Функциональный агент для разложения никотина по п.1, где этот агент используют в качестве пищи, пищевых добавок, лекарственных средств, напитков или добавок к напиткам.
4. Функциональный агент для разложения никотина по п.1, где этот агент упакован и находится в форме капсулы.
5. Функциональный напиток для разложения никотина, приготовленный путем смешивания от 0,1 до 5% по массе функционального агента по п.1 с водой.
6. Способ приготовления функционального агента для разложения никотина, при котором
(а) готовят фильтраты орехов, фруктов и овощей путем экстрагирования и фильтрования ореха гинкго, сельдерея, яблока и лимона,
(б) готовят концентраты корней, кожуры и листьев путем экстрагирования лакричного корня и высушенной апельсиновой кожуры при 100°С, смешивания с листьями шелковицы и их экстрагирования и фильтрования и
(в) готовят порошок путем смешивания фильтратов орехов, фруктов и овощей (а), концентратов корней, кожуры и листьев (б) и порошка эффективного ингредиента зеленого чая, их фильтрования и распылительной сушки.
