Способ моделирования меланомы роговицы

Изобретение относится к офтальмологии, точнее к способам моделирования меланомы роговицы. Производят надрез роговицы и формируют в средних ее слоях карман. В него имплантируют 0,1 мл среды 199, содержащей 5-10 млн опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы. Ушивают карман одним узловым швом. Способ позволяет получить модель злокачественной меланомы роговицы, по клиническим и биологическим характеристикам максимально приближенной к клинико-биологическим характеристикам меланомы роговицы человека. 2 ил.

 

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к экспериментальной офтальмоонкологии, и предназначено для создания экспериментальной модели опухоли роговицы.

Разработка моделей опухолей различного гистогенеза с локализацией в различных органах и тканях организма является одной из актуальных задач экспериментальной онкологии. Модели экспериментальных опухолей на животных активно используются для изучения процесса взаимоотношения опухоли-хозяина, фундаментальных исследований различных этапов канцерогенеза, например ангиогенеза, пролиферации или апоптоза. Соответственно модели опухолей могут быть востребованы для оценки эффективности новых препаратов, относящихся к антиангиогенным средствам, к индукторам апоптоза или к цитостатикам. Кроме того, модели опухолей, созданные на основе генной инженерии, позволяют определить роль различных генных механизмов в канцерогенезе той или иной опухоли.

Формируя модели опухолей в эксперименте, исследователи стремятся воссоздать условия, максимально приближенные к существующим в организме. Оптимальными при этом являются те модели, при которых опухоль развивается под действием специальных точечных генных мутаций, ответственных за злокачественную трансформацию клеток. Например, экспериментально установлено, точечная мутация участка гена H-ras, отвечающего за продукцию тирозиназы - фермента, принимающего участие в синтезе меланина, приводит к развитию ряда опухолей.

Powell et al обнаружили, что мутация указанного гена вызывает гиперпигментацию кожи у мышей, а также гиперплазию пигментного ретинального эпителия. Увеличение количества точечных мутаций в различные сроки эмбрионального развития сопровождается усилением злокачественного фенотипа и появлением опухолей различного генеза, включающих опухоли ретинального пигментного эпителия, карциномы, глазной меланоз (Syed NA, Windle JJ, Darajatmoko SR, et al. Natural history of a transgenic model of intraocular melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 1995; 35 (suppl):S 1131; Klein-Szanto A, Bradi M, Porter S, et al. Melanosis and associated tumors in transgenic mice. Proc Nati Acad Sci USA 1991; 88: 169-173).

Дальнейшие поломки этого гена в последующих поколениях экспериментальных животных приводят к озлокачествлению фенотипа опухоли и развитию меланомы. Такая меланома имеет смешанноклеточный тип и развивается в хориоидее (Bailleui В, Lang J, Wilkie N, et al. A human T24 Ha-ras cassette suitable for expression studies in eukaryotic cells. Nucleic Acids Res 1988; 16: 359). Однако на формирование этой модели уходит практически более 12 месяцев. Требуется не одно поколение крыс, что делает способ не только затяжным во времени, но и весьма дорогостоящим.

Другим способом моделирования является индукция опухолей онкогенными вирусами (Anand R, Ma D, Alizadeh H, et al. Characterization of intraocular tumors arising in transgenic mice. Invest Ophthalmol Vis Sci 1994; 35: 3533-3539; Bradi M, Klein-Szanto A, Porter S, et al. Malignant melanoma in transgenic mice. Proc Nati Acad Sci USA 1991; 88: 164-168; Klein-Szanto A, Bradi M, Porter S, et al. Melanosis and associated tumors in transgenic mice. Proc Nati Acad Sci USA 1991; 88: 169-173). Однако этот способ требует сложнейшего оборудования и соответствующих навыков экспериментатора по генной инженерии (трансфекции онкогенного вектора).

Известен способ создания модели опухоли путем перевивания гибридомных штаммов опухолей-гетеротрансплантатов. Их имплантация в глаз приводит к ускоренному формированию первичного узла в месте имплантации.

К настоящему моменту предложено несколько моделей экспериментальной внутриглазной меланомы на животных (Albert DM, Shadduck JA, Liu HS, et al. Animal models for the study of uveal melanoma. Int Ophthalmol Clin 1980; 20: 143-160). При этом одни авторы используют гибридомный штамм меланомы, другие - перевиваемую линию ОСМ1 увеальной меланомы человека.

В основе указанных моделей лежит точный расчет количества опухолевых клеток, имплантируемых в ткани глаза. С одной стороны, оно должно быть достаточным для развития опухолевого узла, с другой, - не должно приводить к гибели животного вследствие опухолевой интоксикации и индуцированного острого некроза тканей.

Расчет критического количества опухолевых, необходимого для формирования модели той или иной локализации, производили различными путями, но всегда эмпирически. Одни авторы формировали модель внутриглазной опухоли, имплантируя взвесь опухолевых клеток в количестве 5 млн клеток в субхориоидальное пространство трижды. Интервал между введениями составлял 3 дня. Кратность введения определялась клиникой. Необходимость повтора имплантации диктовалась отсутствием растущего узла в глазу, что, в свою очередь, свидетельствовало о дефиците клеток (Albert DM, Wagoner MD, Moazed К, et al. Heterotransplantation of human choroidal melanoma into the athymic "nude" mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci 1980; 19: 555-559; Krohn DL, Brandt R, Morris DA, et al. Subchoroidal transplantation of experimental malignant melanoma. Am J Ophthalmol 1970; 70: 7531)

Другие исследователи вводили сразу 10 млн опухолевых клеток в переднюю камеру и получали модель внутриглазной опухоли, развивающуюся в передней камере (Felberg NT, Michelson JB. Pigmented iris malignant melanoma in New Zealand white rabbits. Ophthalmic Res 1979; 11: 199.).

В качестве экспериментальных животных используют мышей, лабораторных крыс, морских свинок, кроликов.

В качестве опухолевых штаммов - различные гибридомные штаммы различных опухолей, в том числе и ретинобластомы (Gallie BL, Albert DM, Wong JJ, et al. Heterotransplantation of retinoblastoma into the athymic "nude" mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci 1977; 16: 256)

Критерием приживления всех экспериментальных моделей служат: динамика роста опухолевых узлов, их масса в конце эксперимента и образование сети собственных сосудов в опухоли, подтвержденной ангиографически.

Если при создании внутриглазных меланом схема моделирования уже отработана, то экспериментальная меланома роговицы не описана. Между тем, поскольку опухоль такого гистогенеза и локализации существует, для ряда экспериментальных исследований такую модель меланомы необходимо иметь.

Задачей предлагаемого способа является разработка модели меланомы роговицы.

Техническим результатом данного изобретения является получение модели злокачественной меланомы роговицы, по клиническим и биологическим характеристикам максимально приближенной к клинико-биологическим характеристикам меланомы роговицы у человека.

Технический результат достигается за счет имплантации определенного количества опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы в карман, сформированный в средних слоях роговицы.

Проведенные нами исследования позволили разработать режим и способ введения, а также обосновать количество имплантируемых опухолевых клеток, которые обеспечивают получение адекватной модели меланомы роговицы.

Исследования, которые мы провели, состояли из 4-х серий экспериментов. В первой серии мы пытались воспроизвести модель меланомы роговицы на 10 кроликах породы Шиншилла (весом 2,5-3 кг, 20 глаз), имплантируя 5 млн (10 глаз) и 10 млн (10 глаз) опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы В 16 под конъюнктиву паралимбально. Опухоль развивалась в субконъюнктивальном пространстве несколько медленнее при введении 5 млн клеток и быстрее - при введении 10 млн. При этом меланома не распространялась на роговицу, а росла в сторону от лимба к экватору глаза.

Во второй серии (10 кроликов, 20 глаз) через надрез в роговице мы формировали карман в задних слоях роговицы в непосредственной близости к десцеметовой оболочке и имплантировали в этот карман по 5-10 млн (10 глаз) опухолевых клеток. Карман ушивали одним узловым швом. В ходе роста меланомные клетки в течение 1-2 суток прорывали десцеметову оболочку и далее развивались в передней камере глаза. Таким образом, экспериментальную модель меланомы роговицы таким способом получить не удавалось.

В третьей серии, используя уже отработанную технику, мы формировали карман в поверхностных слоях роговицы, куда имплантировали по 5-10 млн (10 глаз) опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы В16. Карман ушивали узловым швом. В ходе роста опухоль прорывала слои роговицы над ней, вымывалась слезой и вылущивалась из ложа при мигательных движениях век. Таким образом, этот подход также следовало считать неудачным при формировании экспериментальной меланомы роговицы.

И только в четвертой серии экспериментов, когда аналогичный карман выкраивали в средних слоях роговицы и имплантировали 5-10 млн клеток меланомы, формировался узел опухоли, который рос и развивался, медленно поднимаясь в верхние слои роговицы без прорыва последних. Таким образом, эмпирически нами была получена искомая модель меланомы роговицы. Медленный характер ее роста и гистоморфологические параметры были максимально близки к клинико-биологическим характеристикам меланомы роговицы у человека. Это давало основание считать ее адекватной моделью меланомы роговицы.

Мы создавали модель меланомы роговицы, имплантируя 0,1 мл среды 199, содержащей 5-10 млн опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы В16 в карман, сформированный в средних слоях роговицы. Гибридомный штамм меланомы В16 доставляли из Банка опухолевых тканей (лаборатория экспериментальной терапии метастазов рака НИИ ЭДиТО, зав. лаб. - д.б.н. Козлов А.М.). Однако можно использовать любой гибридомный штамм меланомных клеток, например, человеческой линии ОСМ1.

В качестве экспериментального животного служили кролики породы Шиншилла. Однако наряду с кроликами можно использовать морских свинок, лабораторных крыс.

Проведенные исследования легли в основу предлагаемого нами способа.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут гибридомный штамм меланомы. Взвешивают на электронных весах. Отбирают 1 грамм. Взвешенную ткань, содержащую опухолевые клетки, помещают в питательную среду 199 и механически разделяют клетки друг от друга. При этом поскольку известно содержание опухолевых клеток в 1 грамме, то для достижения определенного соотношения опухолевых клеток к единице объема жидкости среду 199 добавляют дозированно из расчета содержания 5-10 млн опухолевых клеток в 0,1 мл среды 199

Экспериментальное животное погружают в наркоз, вводя внутривенно 0,05% раствор реланиума (из расчета 0,5 мл/кг), раствор трамала из расчета 1,0 мл/кг веса, раствор кетамина из расчета 0,3 мл/кг.

С помощью круглого ножа производят надрез в роговице на 1/2-1/3 ее окружности и формируют карман в средних слоях роговицы.

В карман имплантируют взвесь опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы в количестве 5-10 млн опухолевых клеток в 0,1 мл среды 199. Карман ушивают узловым швом.

Модель формируется на 5-7-е сутки (Фиг.1 и 2)

Предлагаемый способ позволяет получить адекватную модель меланомы роговицы для последующих исследований.

Способ моделирования меланомы роговицы, заключающийся в том, что через надрез роговицы в ее средних слоях формируют карман, в который имплантируют 5-10 млн опухолевых клеток гибридомного штамма меланомы, находящихся в 0,1 мл среды 199, и ушивают карман одним узловым швом.