Новые препараты альфа-2,4-дисульфофенил-n-трет-бутилнитрона
Изобретение относится к области медицины, а именно к фармацевтическому препарату, содержащему концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-2,4-дисульфофенил-N-трет-бутилнитрона, отличающемуся тем, что концентрация двунатриевой соли α-2,4-дисульфофенил-N-трет-бутилнитрона в растворе находится в пределах от 100 до 600 мг/мл и рН находится в пределах от 7 до 9,5, и к способу приготовления данного препарата. Полученные растворы двунатриевой соли α-2,4-дисульфофенил-N-трет-бутилнитрона обладают высокой стабильностью и проявляют антимикробные свойства, что позволяет избежать добавления консервантов. 2 н. и 15 з.п. ф-лы, 16 табл.
Область изобретения
Это изобретение относится к новым фармацевтическим препаратам α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона и его фармацевтически приемлемым солям и применению таких препаратов при лечении различных болезней и состояний. Такие соединения альтернативно называют как производные N-оксида 4-[(трет-бутилимино)метил]бензол-1,3-дисульфоновой кислоты.
Предшествующий уровень техники
В патенте США 5488145 описаны α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрон и его фармацевтически приемлемые соли. В патенте США 5475032 описано применение таких соединений при лечении удара и состояний прогрессирующего снижения функций центральной нервной системы. В патенте США 5508305 описано применение таких соединений для улучшения побочных эффектов, вызванных окислительным повреждением в результате противоопухолевого лечения заболеваний. Подобные описания также сделаны в WO 95/17876, являющейся наиболее близким аналогом. В патенте США 5780510 описано применение этих соединений при лечении сотрясения.
Для применения при лечении состояний, таких как удар, сотрясение, травматическое повреждение мозга и травма ЦНС, требуется парентеральное введение фармацевтически приемлемой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона. Особенно предпочтительным является то, что соединение следует вводить внутривенной инфузией. Недостатком стандартных водных препаратов α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона и его фармацевтически приемлемых солей является легкость, с которой они подвергаются разложению. В частности, срок хранения таких препаратов недопустимо короток. Настоящее изобретение описывает некоторые фармацевтические препараты на основе концентрированных водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, которые решают проблемы, связанные с разложением, и которые особенно пригодны для использования при парентеральных введениях.
Описание изобретения
В настоящем изобретении предлагается фармацевтический препарат соединения общей формулы (I)
где М представляет собой фармацевтически приемлемый катион.
Особенно предпочтительным является то, что M+ представляет собой Na+.
Водные растворы двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона подвергаются разложению, по меньшей мере, двумя различными путями. Двунатриевая соль 2,4-дисульфобензальдегида (II) является общим продуктом этих путей.
Не ограничиваясь теорией, очевидно, что один путь разложения подразумевает гидролиз нитронной функциональной группы с образованием альдегида (II) и N-трет-бутилгидроксиламина в качестве продуктов. Второй путь подразумевает процесс самоокисления, возможно, включая в себя разложение, опосредованное свободными радикалами. В этом пути первоначально образуются те же самые два продукта, но впоследствии N-трет-бутилгидроксиламин подвергается дальнейшим превращениям с образованием других продуктов. Известно, что температура, концентрация ионов водорода, следы металлов, следы пероксидов или свет оказывают воздействие на процессы самоокисления [K.Kasraian et al., Pharm. Dev.&Technol., 4(4), 475-480 (1999)]. Например, хорошо известно самоокисление Fenton-типа. Такие процессы самоокисления обычно начинаются взаимодействием металла, особенно железа, и молекулярного кислорода с образованием гидроксильного радикала [В.Halliwell and J.Gutteridge, Biochem. J., 219, 1-14(1984)].
Из-за сложной природы окислительных разложений, а также вследствие того, что в настоящем случае присутствует конкурирующее разложение по причине гидролитического расщепления, неясно, как можно было бы достичь получения стабильных препаратов соединений формулы (I). Специалистами признано, что соединения, которые являются чувствительными к окислительным разложениям, следует приготавливать в виде препаратов при низких (кислых) значениях рН для увеличения их устойчивости к окислению. В частности, признано, что такие разложения обычно минимальны при значениях рН между 3 и 4 (Pharmaceutical Preformulation, ed. J.I.Wells, Ellis Horwood, 1988, p.166). Однако в настоящем случае применение низкого рН приводит к недопустимому ускорению скорости сопутствующего гидролиза.
Для того чтобы выяснить, какие факторы имеют значительное влияние на стабильность водных препаратов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, были проведены исследования. Изученные факторы включали в себя рН, уровни кислорода в растворе и над раствором, присутствие следов металлов и добавление антиоксиданта или хелатирующего агента. В первом случае разложение оценивали посредством измерения концентрации двунатриевой соли 2,4-дисульфобензальдегида (II), образовавшейся в растворе.
Анализ следов металла различных партий двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона показал, что присутствие железа, а также, возможно, меди, хрома и алюминия даже в количествах меньше млн. долей может оказывать влияние на стабильность приготовленных впоследствии водных препаратов. Однако добавление двунатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), хорошо известного хелатирующего агента, не улучшило стабильность водного препарата (Таблица 2). Применение хелатной смолы Chelex-100® (Bio-Rad Laboratories) привело к небольшому, но важному уменьшению количества альдегида (II), который образовывался при хранении (Пример 3).
Когда к концентрированным водным препаратам двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона добавили антиоксидант (аскорбат натрия), то образование альдегида (II) при хранении уменьшилось почти наполовину (Таблица 2). Однако растворы стали бесцветными, и произошло выпадение некоторого количества осадка, таким образом, исключая роль аскорбата как средства, уменьшающего уровень разложения. Неожиданно достигли аналогичных уровней уменьшения образования альдегида (II) с помощью простого способа продувки концентрированных водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона газообразным азотом (Таблицы 2 и 3).
Кроме продувки водного концентрата инертным газом также полезно уменьшить объем свободного пространства над концентратом в сосуде и заполнить это пространство инертным газом (Таблицы 4, 5 и 6). Предпочтительно, чтобы объем свободного пространства был менее 30% от общего максимального объема сосуда. Более предпочтительно, чтобы объем свободного пространства был менее 20% от общего максимального объема сосуда. Для стандартного 10 мл фармацевтического сосуда фактический общий максимальный объем составляет 13 мл, и удобно использовать фактический объем заполнения, равный 10,7 мл. Для стандартного 20 мл фармацевтического сосуда фактический общий максимальный объем составляет 25 мл, и удобно использовать фактический объем заполнения, равный 20,7 мл. Применение 20 мл фармацевтического сосуда является предпочтительным.
Наиболее неожиданным являлся тот факт, что стабильность водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона существенно увеличилась с увеличением концентрации двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона в растворе. Эта стабилизация была очевидна как по уменьшению количества образованного альдегида (II), так и по уменьшению количеств дальнейших продуктов, получаемых в результате самоокисления (Таблицы 8, 9 и 10).
Следовательно, конкретный препарат по настоящему изобретению включает в себя концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, где концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона находится в пределах от 50 до 600 мг/мл. Предпочтительными являются такие препараты, где концентрация находится в пределах от 100 до 600 мг/мл. Более предпочтительными являются препараты, где концентрация находится в пределах от 200 до 400 мг/мл. Особенно предпочтительными являются препараты, где концентрация составляет примерно 400 мг/мл. Кроме того, предпочтительным является то, что такие растворы продувают инертным газом и хранят в атмосфере инертного газа. Использование азота в качестве инертного газа является особенно предпочтительным.
Такие концентрированные растворы не требуют буфера для дальнейшей стабилизации. Однако такие препараты перед введением пациентам в виде внутривенной инфузии разбавляют физиологическим раствором. Этот процесс разбавления приводит к снижению рН и, таким образом, ускорению скорости разложения образующегося разбавленного раствора. Для предотвращения этого изменения рН необходим буфер. Очень удобно, если этот буфер включают в концентрированный препарат, а не добавляют на стадии разбавления (Таблицы 11, 12 и 13).
Следовательно, в дополнительном предпочтительном аспекте настоящего изобретения предлагается концентрированный водный препарат, где раствор забуферен в пределах рН от 7 до 9,5. Более предпочтительно, если раствор забуферен при рН примерно 8,5. Любой физиологически приемлемый буфер может быть использован. Предпочтительным буфером является фосфатный буфер. Таким образом, к концентрату добавляют гидрофосфат натрия (от 5 до 50 мМ), и устанавливают рН на требуемом уровне путем добавления водного раствора гидроксида натрия или водного раствора соляной кислоты, как подходит.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения новых препаратов фармацевтически приемлемых солей α(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, в особенности, к способу получения новых препаратов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона.
В общих чертах способ включает в себя растворение фармацевтически приемлемой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона в воде или в подходящем водном буфере, а затем, если это необходимо, установление рН раствора в пределах от 7 до 9,5 и впоследствии возможную дегазацию раствора с использованием инертного газа, такого как азот.
Предпочтительно способ включает в себя следующие стадии:
а) растворение подходящего буферного агента, такого как гидрофосфат натрия, в воде для инъекции;
б) растворение двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона в указанном буферном растворе;
в) проверка рН, и затем установление рН в пределах от 7 до 9,5 добавлением подходящего количества водного раствора гидроксида натрия или водного раствора соляной кислоты;
г) добавление дополнительного количества воды для инъекции до требуемой конечной концентрации двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона;
д) дегазация раствора газообразным азотом в течение подходящего периода времени;
е) стерильное фильтрование раствора через 0,22 мкм стерильный фильтр в предварительно стерилизованный сосуд; и
ж) асептический перенос раствора в атмосфере азота в отдельные сосуды с их последующей герметизацией.
Особенно предпочтительным способом является способ, конкретно описанный в Примере 1.
В некоторых случаях особенно удобно, если фармацевтические препараты, предназначенные для парентерального введения, могут быть помещены в контейнер с большим количеством доз. Контейнер с большим количеством доз - это контейнер, который позволяет последовательно отбирать порции содержимого без изменения эффективности действия, качества или чистоты оставшейся порции. Законным требованием (European Pharmacopoeia 2001) является содержание в водных инъекциях с большим количеством доз соответствующего антимикробного консерванта в подходящей концентрации за исключением случая, когда сам препарат обладает достаточными антимикробными свойствами. Специалистами признано, что фармацевтические продукты с асептическим заполнением (т.е., окончательно стерилизованные фильтрованием через 0,22 мкм фильтр) являются особенно чувствительными к микробиологическому заражению во время производственного процесса. Следовательно, как с производственной точки зрения, так по другим причинам, связанным с сохранностью продукта (например, возможного заражения вследствие повреждения, вызванного обращением или хранением продукта в клинике), считается, что лекарственный препарат обладает значительным преимуществом, если сам проявляет антимикробные свойства. Таким образом, если сам фармацевтический препарат удовлетворяет законным требованиям, относящимся к консервантам, то пропадает необходимость в добавлении специального консерванта.
Следовательно, дополнительным преимуществом настоящего изобретения является то, что концентрированные водные препараты, описанные здесь, обладают существенными антимикробными свойствами. Так, оценивали способность препаратов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона ингибировать рост следующих микроорганизмов - Ps.aeruginosa, S.aureus, Bur.cepacia, E.gergovia, E.coli, C.albicans и A.niger. Как показано в Таблице 14, концентрированный водный препарат по настоящему изобретению, включающий в себя двунатриевую соль α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл), обладает значительной антимикробной эффективностью. Так, в пределах 6 часов видны очень значительные уменьшения (≥103 раз) в количестве колониеобразующих единиц на мл (КОЕ/мл) для Ps.aeruginosa, Bur.cepacia и E.gergovia. Аналогичная степень влияния наблюдается для S.aureus и E.coli в пределах 24 часов, и для C.albicans - в пределах 48 часов. Подробные результаты представлены в Таблице 14, а сравнительные результаты для препарата двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (10 мг/мл) и для контрольного буфера показаны в Таблицах 15 и 16 соответственно.
Как показано в Таблице 7, разбавленные водные растворы двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-Т-трет-бутилнитрона (0,9 мг/мл) подвергаются значительному фотостарению, когда выдерживаются при обыкновенном искусственном освещении при комнатной температуре в течение 8 часов. Скорость фотостарения уменьшается, если водный раствор забуферен. Более концентрированные водные растворы (10 мг/мл) подвержены фотостарению в значительно меньшей степени (Таблица 7). При таких же условиях в течение такого же промежутка времени водный концентрированный препарат по одному из аспектов настоящего изобретения (400 мг/мл) фотостарению не подвергался.
В особенно предпочтительном воплощении настоящего изобретения предлагается фармацевтический препарат, включающий в себя концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл) и гидрофосфата натрия (от 5 до 50 мМ) при рН 8,5, который продут азотом и хранится в 20 мл герметичных стеклянных сосудах с небольшим объемом свободного пространства, заполненного азотом. Еще более предпочтительно, когда гидрофосфат натрия присутствует в концентрации примерно 10 мМ. Такой препарат обладает неожиданно длительным сроком хранения, по меньшей мере, 24 месяца при хранении охлажденным (температура приблизительно от 2 до 8°С), и остается в состоянии, пригодном для применения, по меньшей мере, в течение 6 месяцев, даже когда хранится при комнатной температуре.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, но никаким образом не ограничивают его.
Пример 1
Приготовление водного концентрированного препарата двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
Дигидрат гидрофосфата натрия (186 г) добавляли к воде для инъекции (60 кг). До окончания растворения смесь перемешивали со скоростью 300 об/мин (10 минут). После этого рН раствора стал равным 9,3. Затем добавляли двунатриевую соль α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (39,6 кг) и перемешивание продолжали до тех пор, пока этот материал не растворился (20 минут). Затем рН раствора доводили до значения от 5,8 до 8,5, добавляя 2 М водный раствор гидроксида натрия (604 мл). Добавляли дополнительное количество воды для инъекции до окончательного веса 117,1 кг. Используя эти количества, получают концентрат, содержащий 400 мг/мл двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона. Подобным образом, изменяя количество применяемого нитрона, могут быть получены концентраты с концентрациями в пределах от 50 до 600 мг/мл.
Затем раствор дегазировали газообразным азотом в течение 130 минут (Таблица 1).
| Таблица 1 | |
| Время дегазации (минуты) | Растворенный кислород (мг/л) |
| 0 | 7,8 |
| 15 | 8,2 |
| 30 | 0,6 |
| 130 | 1,3 |
Затем раствор стерильно фильтровали в предварительно стерилизованный 400 л сосуд из нержавеющей стали с использованием 0,22 мкм стерильного фильтра. Газообразным азотом в сосуде создавали давление от 10 до 15 кПа. Раствором асептически заполняли стерилизованные сухим теплом 10 мл или 20 мл стеклянные сосуды, используя стерильный газообразный азот, которым продували сосуды как перед, так и после заполнения. Объем заполнения составлял 10,5 мл или 20,7 мл соответственно.
Активный контроль остаточного кислорода в сосудах выполняли с использованием анализатора Toray Oxygen. Содержание остаточного кислорода в свободном пространстве составляло 0,9±0,1% (n=29).
Пример 2
Относительные влияния хелатирующего агента, антиоксиданта, удаления кислорода и рН на стабильность концентрированного водного раствора двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
Влияние нескольких дополнительных факторов исследовали в экспериментах, планируемых с использованием многомерной методики. Водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (100 мг/мл), содержащий менее 0,3% двунатриевой соли 2,4-дисульфобензальдегида (II), помещали в герметичные 10 мл стеклянные сосуды с объемом заполнения 10 мл. Концентрации продуктов разложения, в частности двунатриевой соли 2,4-дисульфобензальдегида (II), измеряли хроматографическим методом после ускоренного испытания при +40°С и относительной влажности 75% в течение 2 месяцев. Результаты показаны в таблице 2.
| Таблица 2 | ||
| Дополнительный фактор | Пределы рН раствора | Конечное количество альдегида (II) (% по площ.) |
| Отсутствует (n=5) | от 7,0 до 8,2 | 2,20±0,11 |
| Аскорбат (n=3) | от 7,0 до 7,3 | 1,32±0,11 (р<0,001) |
| ЭДТА (n=5) | от 7,0 до 8,8 | 2,27±0,12 |
| Продувка азотом (n=3) | от 7,0 до 8,6 | 1,34±0,18 (р<0,001) |
Значения представляют собой среднюю величину ± стандартное отклонение, п показывает число независимых экспериментов. Для оценки значимости различных факторов использовали критерий Стьюдента.
Диапазон рН (от 7 до 9), изученный в этом эксперименте, не оказал какого-либо значительного влияния на степень разложения.
Пример 3
Влияние хелатной смолы на стабильность концентрированного водного раствора двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
Концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (100 мг/мл) и гидрофосфата натрия (5,3 мМ) при рН 8,0 в течение ночи пропускали через колонку с хелатной смолой Chelex-100®. Полученный раствор помещали порциями (по 8 мл) в 10 мл стеклянные сосуды, которые затем герметизировали. Исходный уровень альдегида (II) составлял 0,20%. Через два месяца при +40°С и относительной влажности 75% концентрация альдегида (II) увеличилась до 2,3%. В контрольном эксперименте, в который не была включена обработка смолой, уровень альдегида (II) увеличился до 3,0%.
Пример 4
Влияния продувки различными смесями воздуха и азота на стабильность концентрированного водного раствора двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
Концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл) и гидрофосфата натрия (5,3 мМ) при рН 8,5 продували смесями воздуха и азота с разным содержанием газов. Растворы хранили в герметичных 10 мл стеклянных сосудах с объемом заполнения 7 мл. Образцы хранили в течение 2 месяцев при +40°С и относительной влажности 75%. Исходный концентрированный водный раствор содержал альдегид (II) (0,25% по площ.) и родственные вещества (0,56% по площ.). Результаты показаны в Таблице 3.
| Таблица 3 | ||
| Содержание воздуха в газовой смеси для продувки, % | Конечное количество альдегида (II) (% по площ.) | Конечное количество родственных веществ (% по площ.) |
| 0 | 0,57 | 1,3 |
| 6,25 | 0,68±0,08 (n=2) | 1,5±0,1 (n=2) |
| 12,5 | 0,63±0,01 (n=2) | 1,4 |
| 25 | 0,77 | 1,6 |
| 50 | 0,93 | 1,9 |
| 100 | 1,27 | 2,4 |
Пример 5
Оценка важности объема свободного пространства в сосуде
Другой способ избежать воздействия кислорода заключается в уменьшении объема свободного пространства в сосудах посредством увеличения объема заполнения.
Концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл) и гидрофосфата натрия (10,5 мМ) при рН 8,5 продували азотом в течение 30 минут. Затем порции этого раствора по 8 мл или 13 мл помещали в стандартные 10 мл стеклянные сосуды (максимально возможный объем заполнения стандартного 10 мл стеклянного сосуда составляет 13 мл). Свободное пространство не продували азотом. Сосуды герметизировали и хранили в течение 2 месяцев при +40°С и относительной влажности 75%. Исходный уровень альдегида (II) составлял 0,1%.
Результаты показаны в Таблице 4.
| Таблица 4 | |
| Объем заполнения (мл) | Конечное количество альдегида (II) (% по площ.) |
| 13 | 0,6 |
| 8 | 1,1 |
Пример 6
Сравнение заполнения свободного пространства воздухом или азотом
400 мг/мл концентрат двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона получали добавлением двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (1500 г) к воде для инъекции (2200 мл), содержащей растворенный дигидрат гидрофосфата натрия (3,51 г). рН раствора доводили до 8,5, добавляя 2М раствор гидроксида натрия, а затем добавляли воду для инъекции до окончательного объема 3750 мл. После приготовления раствор продували азотом в течение 90 минут и затем помещали в 10 мл стеклянные сосуды с объемом заполнения 7,7 мл. Перед укупориванием сосудов свободное пространство продували азотом. Десять сосудов были отобраны для анализа на содержание кислорода в свободном пространстве, и было найдено, что это содержание менее 0,05%. Сосуды хранили или при +5°С и влажности окружающей среды или при +25°С и относительной влажности 60%.
Вторую порцию 400 мг/мл концентрата двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, забуференного 50 мМ фосфатным буфером, обрабатывали так же, за исключением того, что свободное пространство заполняли не азотом, а воздухом, и объем заполнения составлял 10,5 мл.
Результаты суммированы в Таблице 5.
| Таблица 5 | ||||
| Срок хранения (месяцы) | Количество альдегида (II) (% по площ.) | |||
| Свободное пространство, заполненное азотом | Свободное пространство, заполненное воздухом | |||
| +5°С | +25°С | +5°С | +25°С | |
| 0 | 0,2 | 0,2 | 0,3 | 0,3 |
| 3 | 0,2 | 0,4 | 0,3 | 0,7 |
| 6 | 0,2 | 0,3 | 0,5 | 1,0 |
| 12 | 0,3 | 0,5 | 0,4 | 0,7 |
Дополнительная информация приведена в Таблице 6. Для 10 мл сосудов объем заполнения составлял 10,7 мл; для 20 мл сосудов объем заполнения составлял 20,7 мл.
| Таблица 6 | |||||||
| Композиции | |||||||
| Концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (мг/мл) | 50 | 50 | 100 | 400 | 400 | 400 | 400 |
| Размер сосуда [мл] | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 20 | 20 |
| Газ в свободном пространстве | воздух | N2 | воздух | воздух | N2 | воздух | N2 |
| Условия хранения | Количество альдегида (II) (мас./мас.%) | ||||||
| Исходное | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,3 | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| 2 месяца при +40°С | 2,8 | 1,4 | 1,8 | 0,8 | 0,5 | 0,7 | 0,5 |
| 3 месяца при +40°С | 3,3 | 1,5 | Н.А. | 0,9 | 0,6 | 0,8 | 0,5 |
| 6 месяца при +40°°С | 3,5 | 1,7 | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. | Н.А. |
| Н.А. - анализ не проводился. |
Пример 7
Оценка фотостарения водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
Разбавленные водные растворы двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (0,9 мг/мл или 10 мг/мл) испытывали на фотостабильность, выдерживая их при искусственном освещении и комнатной температуре в течение 8 часов. Растворы с более низкими концентрациями испытывали как с добавлением, так и без добавления карбонатного буфера. Образовывался основной продукт фотостарения. Забуференный препарат был более устойчив к фотостарению, чем незабуференный препарат. Наименьшей скоростью фотостарения обладал препарат с двунатриевой солью α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (10 мг/мл).
Аналогичные эксперименты с использованием 400 мг/мл водного концентрата двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-трет-бутилнитрона показали, что в этом случае вообще не произошло разложения после 8 часов в условиях эксперимента.
Результаты суммированы в Таблице 7.
| Таблица 7 | |||
| Время (часы) | Количество продукта фотостарения (% по площ.) | ||
| Концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона 0,9 мг/мл Незабуференный раствор | Концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона 0,9 мг/мл Забуференный раствор | Концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона 10 мг/мл Незабуференный раствор | |
| 0 | 0,03 | 0 | 0 |
| 1 | 0,3 | 0,3 | 0,2 |
| 2 | 0,8 | 0,6 | 0,2 |
| 3 | 1,2 | 0,9 | 0,4 |
| 4 | 1,8 | 1,3 | 0,5 |
| 5 | 2,5 | 1,6 | 0,6 |
| 6 | 2,9 | 2,0 | 0,8 |
| 7 | 3,5 | 2,3 | 0,8 |
| 8 | 4,0 | 2,7 | 0,9 |
Пример 8
Влияние корцентрации на стабильность водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-Т-трет-бутилнитрона
В начальном эксперименте водные растворы с тремя различными концентрациями двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, забуференные гидрокарбонатом натрия (50мМ), распределяли по 20 мл стеклянным сосудам, герметизировали их и затем хранили в течение 40 дней при +40°С и относительной влажности 75%. В особенной партии используемой двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона было высокое исходное содержание альдегида.
Результаты суммированы в Таблице 8.
| Таблица 8 | ||
| Концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-Т-трет-бутилнитрона (мг/мл) | Исходное количество альдегида (% по площ.) | Конечное количество альдегида (% по площ.) |
| 200 | 1,7 | 3,5 |
| 300 | 1,7 | 3,2 |
| 400 | 1,8 | 2.9 |
Во втором исследовании незабуференные водные растворы двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (концентрация или 100 мг/мл, или 200 мг/мл) распределяли по 50 мл стеклянным сосудам и хранили при +5°С.
Результаты суммированы в Таблице 9.
| Таблица 9 | ||||
| Время хранения (месяцы) | Концентрат (100 мг/мл) | Концентрат (200 мг/мл) | ||
| Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | |
| 0 | 0,2 | 7,4 | 0,2 | 7,6 |
| 1 | 0,5 | 7,5 | 0,4 | 7,6 |
| 3 | 1,0 | 7,3 | 0,6 | 7,4 |
| 6 | 1,6 | 7,1 | 0,8 | 7,4 |
| 12 | 1,6 | 6,9 | 1,1 | 6,9 |
В третьем исследовании водные растворы двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (концентрация или 200 мг/мл, или 400 мг/мл), буферизованные фосфатным буфером (50 мМ), распределяли по 10 мл стеклянным сосудам и хранили при +5°С.
Результаты суммированы в Таблице 10.
| Таблица 10 | ||||
| Время хранения (месяцы) | Концентрат (200 мг/мл) | Концентрат (400 мг/мл) | ||
| Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | |
| 0 | 0,1 | 8,0 | 0,1 | 8,0 |
| 6 | 0,4 | 7,9 | 0,3 | 7,8 |
| 12 | 0,6 | 7,9 | 0,4 | 7,8 |
| 18 | 0,7 | 8,0 | 0,4 | 7,9 |
Пример 9
Влияние рН на стабильность водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
Проводили широкое исследование разложения водных растворов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона в зависимости от рН. В Таблице 11 показано сравнение незабуференного раствора двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (4 мг/мл) с раствором двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (4 мг/мл), забуференным фосфатом (0,53 мМ). Оба раствора, полученные подходящим разбавлением соответствующего концентрата, хранили при комнатной температуре в условиях, которые могли достаточно корректно имитировать разбавленный концентрат, готовый для введения пациентам.
| Таблица 11 | ||||
| Время хранения (дни) | Незабуференный раствор | Забуференный раствор | ||
| Количество альдегида (11) (% по площ.) | PH | Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | |
| 0 | 0,9 | 6,8 | 0,8 | 8,0 |
| 1 | 1,1 | 6,8 | 0,9 | 7,9 |
| 2 | 1,2 | 6,8 | 0,9 | 7,7 |
| 5 | 1,6 | 6,8 | 1,0 | 7,5 |
| 7 | 2,0 | 6,7 | 1,1 | 7,5 |
Пример 10
Влияние разбавления водных концентратов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона на рН
Приготавливали три партии водного концентрата двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл) и доводили рН до 8,5. Один концентрат был незабуференным, а два других концентрата забуферили 2,6 мМ или 26 мМ растворами гидрофосфата натрия соответственно. В каждом случае в 0,9%-ный раствор хлорида натрия (500 мл), содержащийся в ПВХ пакете, переносили 7 мл порцию концентрата. Затем защищенные от света пакеты хранили при комнатной температуре в течение 48 часов. Образцы вынимали через 0, 24 и 48 часов и анализировали.
Результаты суммированы в Таблице 12.
| Таблица 12 | ||||||
| Время (часы) | Без буфера | Буфер, применяемый в концентрате (2,6 мМ) | Буфер, применяемый в концентрате (26 мМ) | |||
| PH | Количество альдегида (II) (% по площ.) | PH | Количество альдегида (II) (% по площ.) | PH | Количество альдегида (II) (% по площ.) | |
| 0 | 6,01 | 0,25 | 6,50 | 0,30 | 7,43 | 0,17 |
| 24 | 6,32 | 0,68 | 6,69 | 0,44 | 7,39 | 0,20 |
| 48 | 6,48 | 0,89 | 6,67 | 0,57 | 7,38 | 0,25 |
Пример 11
Влияние рН на стабильность водных растворов и концентратов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона
В дополнительном исследовании сравнивали стабильность как забуференных (гидрокарбонат натрия), так и незабуференных водных растворов и концентратов двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, хранящихся при комнатной температуре. Результаты (Таблица 13) показывают, что разложение зависит от концентрации, а также является более выраженным при более низких значениях рН. Для забуференных растворов не обнаружено очевидной зависимости разложения от концентрации, вследствие короткого срока хранения и умеренной температуры хранения.
| Таблица 13 | |||||
| Время хранения (часы) | Концентрация двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (мг/мл) | Незабуференный | Забуференный | ||
| Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | Количество альдегида (II) (% по площ.) | рН | ||
| 0 | 7,5 | 1,0 | 5,8 | 0,6 | 8,1 |
| 48 | 7,5 | 2,4 | 6,3 | 0,7 | 8,7 |
| 0 | 75 | 1,1 | 6,1 | 0,6 | 8,0 |
| 48 | 75 | 1,9 | 6,7 | 0,7 | 8,1 |
| 0 | 150 | 1,0 | 6,1 | 0,6 | 7,9 |
| 48 | 150 | 1,7 | 6,7 | 0,7 | 7,8 |
Пример 12
Антимикробная эффективность двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл) по сравнению с двунатриевой солью α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (10 мг/мл) и контрольным образцом
Исследовали антимикробную эффективность трех различных растворов:
1) двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (10 мг/мл);
2) двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл); и
3) контрольного карбонатного буфера.
Исследования проводили в соответствии с European Pharmacopoeia 2000, глава 5.1.3, страницы 259-260. Инокулировали семь 10 мл сосудов, по одному на исследуемый организм. Во время анализов сосуды хранили при контролируемой комнатной температуре и защищали от света. Образцы отбирали в различные интервалы времени и после соответствующих разведении определяли количество жизнеспособных микроорганизмов (колониеобразующих единиц на мл, КОЕ/мл) с использованием стандартных чашечных методов.
Результаты для трех растворов показаны в Таблицах 14, 15 и 16 соответственно.
| Таблица 14 Антимикробная эффективность двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (400 мг/мл) | |||||||||
| Исследуемый микроорганизм | Подсчитанный инокулят на мл | Количество КОЕ на мл - время после инокуляции | |||||||
| <1 мин | 6 ч | 24 ч | 48 ч | 7 дней | 14 дней | 21 день | 28 дней | ||
| S.aureus | 2,2×106 | 3,3×106 | 6,7×105 | 8,7×102 | 3,8×102 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| Е.coli | 5,5×105 | 3,8×105 | 4,1×104 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| Ps.aeruginosa | 1,1×106 | 1,1×104 | 1,4×101 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| Bur.cepacia | 5,6×105 | 1,1×105 | 8,7×101 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| E.gergoviae | - | 5,2×105 | 1,3×102 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| C.albicans | 1,5×105 | 1,6×105 | 3,1×104 | 6,1×103 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| A.niger | 1,8×105 | 1,0×105 | 5,9×104 | 3,4×104 | 1,7×104 | 1,9×102 | <1 | <1 | <1 |
| Таблица 15 Антимикробная эффективность двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона (10 мг/мл) | |||||||||
| Исследуемый микроорганизм | Подсчитанный инокулят на мл | Количество КОЕ на мл - время после инокуляции | |||||||
| <1 мин | 6 ч | 24 ч | 48 ч | 7 дней | 14 дней | 21 день | 28 дней | ||
| S.aureus | 2,0×106 | 2,0×106 | 4,5×105 | 4,5×103 | ≤10 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| Е.coli | 2,0×106 | 1,5×106 | 9,0×105 | 5,0×104 | ≤10 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| Ps.aeruginosa | 1,0×106 | 1,5×106 | 4,0×104 | 4,0×102 | 3,5×102 | ≤10 | <1 | <1 | <1 |
| Bur.cepacia | 4,5×105 | 3,5×106 | 1,5×103 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| Е.gergoviae | 8,0×105 | 8,0×105 | 2,0×105 | ≤10 | <1 | <1 | <1 | <1 | <1 |
| С.albicans | 9,5×105 | 6,5×105 | 7,0×10^ | 6,5×105 | 6,5×105 | <10 | <1 | <1 | <1 |
| A.niger | 1,0×105 | 5,0×104 | 4,5×104 | 5,0×104 | 5,5×104 | 3,0×104 | 1,0×103 | 1,0×102 | ≤10 |
| Таблица 16 Антимикробная эффективность контрольного буфера гидрокарбоната натрия | |||||||||
| Исследуемый микроорганизм | Подсчитанный инокулят на мл | Количество КОЕ на мл - время после инокуляции | |||||||
| <1 мин | 6 ч | 24 ч | 48 ч | 7 дней | 14 дней | 21 день | 28 дней | ||
| S.aureus | 2,0×106 | 2,5×106 | 2,0×106 | 1,5×106 | 7,0×105 | 3,0×104 | 1,0×103 | 4,5×102 | 70 |
| Е.coli | 2,0×106 | 1,5×106 | 1,5×106 | 5,0×106 | 7,0×106 | 6,5×106 | 4,0×106 | 4,0×106 | 2,5×106 |
| Ps.aeruginosa | 1,0×106 | 1,5×106 | 1,5×106 | 5,5×106 | 6,0×106 | 7,0×106 | 6,0×106 | 5,0×106 | 1,5×106 |
| Bur.cepacia | 4,5×105 | 4,0×105 | 3,0×105 | 5,0×106 | 1,0×106 | 2,0×105 | 40 | 5,0×102 | 20 |
| E.gergoviae | 8,0×105 | 7,5×105 | 6,5×105 | 1,5×106 | 2,0×105 | 3,5×106 | 1,5×106 | 1,0×106 | 8,5×105 |
| C.albicans | 9,5×105 | 7,5×105 | 7,0×105 | 7,0×105 | 6,0×105 | 7,0×105 | 7,0×105 | 7,5×105 | 7,5×105 |
1. Фармацевтический препарат, содержащий концентрированный водный раствор двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона, отличающийся тем, что концентрация находится в пределах от 100 до 600 мг/мл и рН находится в пределах от 7 до 9,5.
2. Препарат по п.1, где концентрация составляет от 200 до 400 мг/мл.
3. Препарат по п.1, где концентрация составляет примерно 400 мг/мл.
4. Препарат по п.1, где раствор забуферен с использованием физиологически приемлемого буфера в пределах рН от 7 до 9,5.
5. Препарат по п.4, где раствор забуферен при рН примерно 8,5.
6. Препарат по п.4 или 5, где буфер представляет собой фосфатный буфер.
7. Препарат по п.1, где раствор продувают инертным газом.
8. Препарат по п.1, где раствор продувают инертным газом и хранят в атмосфере инертного газа.
9. Препарат по п.1, где раствор хранят в герметичном стеклянном сосуде с минимальным объемом свободного пространства и это свободное пространство заполнено инертным газом.
10. Препарат по п.9, где объем свободного пространства в герметичном стеклянном сосуде составляет менее 20% от общего максимального объема сосуда.
11. Препарат по любому из пп.7-10, где инертный газ представляет собой азот.
12. Способ приготовления препарата по любому из пп.1-7, при котором двунатриевую соль α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона растворяют в воде для инъекции или в подходящем водном буфере и, если необходимо, устанавливают рН раствора в пределах от 7 до 9,5 и после этого, возможно, дегазируют раствор с использованием инертного газа.
13.Способ по п.12, включающий стадии, на которых:
а) растворяют подходящий буферный агент, такой, как гидрофосфат натрия, в воде для инъекции;
б) растворяют двунатриевую соль α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона в указанном буферном растворе;
в) проверяют рН и затем устанавливают рН в пределах от 7 до 9,5 добавлением подходящего количества водного раствора гидроксида натрия или водного раствора соляной кислоты;
г) добавляют дополнительное количество воды для инъекции до требуемой конечной концентрации двунатриевой соли α-(2,4-дисульфофенил)-N-трет-бутилнитрона;
д) дегазируют раствор газообразным азотом в течение подходящего периода времени;
е) проводят стерильное фильтрование раствора через 0,22 мкм стерильный фильтр в предварительно стерилизованный сосуд и
ж) асептически переносят раствор в атмосфере азота в отдельные сосуды с их последующей герметизацией.
14. Препарат по п.1 для приготовления внутривенной инфузии для лечения удара.
15. Препарат по п.1 для приготовления внутривенной инфузии для лечения сотрясения.
16. Препарат по п.1 для приготовления внутривенной инфузии для лечения травматического повреждения мозга.
17. Препарат по п.1 для приготовления внутривенной инфузии для лечения травмы центральной нервной системы.
