Способ определения антипирина в слюне

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования биологического материала, и может быть применено в лабораторной практике. Согласно способу определения антипирина в слюне центрифугирование супернатанта проводят при скорости 14000 об/мин в течение 5 минут, затем встряхивают смесь супернатанта с ZnSO₄*7H₂O и 0,75N NaOH в течение 1 минуты с последующим центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут, а затем 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 наносят в инжектор хроматографа, хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 С18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С, и определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата. Технический результат: упрощение, сокращение времени, повышение чувствительности и точности способа. При этом сокращаются количество рабочих растворов, число дозирующих процедур, время пробоподготовки, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ, исключается применение токсических веществ (хлороформа, серной кислоты). 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическим методам исследования биологического материала, и может быть применен в лабораторной практике.

Антипириновая проба - очень чувствительный и надежный тест, позволяющий судить о функциональном состоянии монооксигеназной системы печени. Антипирин достаточно медленно выводится из организма, малотоксичен, имеет высокую биодоступность (97-100%), низкое связывание с белками плазмы, равномерно распределяется во всех биологических жидкостях организма и, что самое важное, метаболизм антипирина почти полностью осуществляется при участии цитохром Р450-зависимых монооксигеназ печени (1), о чем свидетельствует линейность отношений между антипирингидроксилазной активностью и периодом полувыведения антипирина, а также тесная корреляция показателей активности цитохрома Р450 в биоптатах печени человека и кинетики элиминации этого препарата (2).

На основании вышеперечисленного антипириновый тест используется для оценки активности микросомальных монооксигеназ печени и служит в качестве количественного критерия функционального состояния печени (3). Иногда антипириновый тест является единственным маркером нарушения функционального состояния печени при нормальных значениях биохимических проб (4). Хорошая корреляция между концентрацией антипирина в плазме и слюне дает возможность при исследовании использовать слюну (5). Метод определения антипирина в слюне неинвазивен и доступен в научной и клинической практике.

Существуют хроматографические методы определения содержания антипирина в слюне:

1. Извлечение антипирина осуществляется в следующем порядке: к 0,5 мл слюны добавляют 4,5 мл хлороформа, содержимое пробирки тщательно встряхивают в течение 10 минут с целью максимального перехода антипирина, содержащегося в биопробе, в хлороформ.

После чего отбирают хлороформную фракцию в специальные конические колбы и упаривают на водяной бане при t - 60°С под током воздуха. Сухой остаток растворяют в 0,2-0,5 мл ацетонитрила и 20 мкл аликвоты, вводят в инжектор хроматографической системы. Хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - "Econosil С-18" с размером зернистости 10 микрон (4,6*150 мм); подвижная фаза (элюент) - ацетонитрил: фосфатный буфер, рН - 6,0, в соотношении 35:65. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 254 нм, скорость потока элюента - 1 мл/мин при давлении на помпе 1500 psi, температура колонки - 25°С. Пороговая чувствительность метода составляет 0,2 мкг/мл (8).

2. Осаждение плотного осадка слюны проводят следующим образом: к 200 мкл супернатанта добавляют 200 мкл смеси 0,1N серной кислоты и этанола (30:70 об.%) и встряхивают в течение 1 минуты, после чего пробу центрифугируют (7000 об/мин в течение 20 мин) и 5 мкл надосадочной жидкости вводят в хроматограф. Состав подвижной фазы: ацетат натрия (рН 6,7) - ацетонитрил (70:30 об/об), скорость потока 100 мкл/мин. Спектр ультрафиолетового поглощения - 250 нм. Пороговая чувствительность методики - 1 мкг/мл (9).

Однако к недостаткам этих методов относится то, что при пробоподготовке слюны используют токсические вещества, такие как: хлороформ, серная кислота.

Наиболее близким к заявленному изобретению по пробоподготовке является метод Броди (6) и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче (7) для определения антипирина в слюне, заключающийся в том, что больные принимают натощак антипирин из расчета 18 мг/кг массы тела. Через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина собирают слюну в количестве 3 мл, центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин. Забирают 150 мкл супернатанта, к которому добавляют 150 мкл дистиллированной воды и 150 мкл ZnSO₄*7H₂О и затем по каплям при постоянном встряхивании - 150 мкл 0,75N NaOH. После 10-минутного стояния содержимое из колб переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 15 минут при 3500 об/мин. В мерные пробирки помещают по 3 мл супернатанта, раствора стандарта и дистиллированной воды. Далее после добавления ко всем пробам 0,05 мл 4N H₂SO₄ определяют оптическую плотность пробы со слюной относительно пробы с водой на спектрофотометре при длине волны 350 нм. После определения исходной плотности пробы ставят в водяную баню, температура которой 22°С. Через 5 минут во все пробирки добавляют 0,1 мл NaNO₂, содержимое тщательно перемешивают и через 25 минут проводят повторное измерение оптической плотности проб относительно пробы с водой. Оптическая плотность стабильна в течение 20 минут, затем начинает постепенно снижаться. В качестве стандарта используют растворы антипирина концентрацией 8 мг/л и 12 мг/л.

Существенным недостатком данного метода являются: большие затраты времени, недостаточная чувствительность, необходимость химической модификации препарата.

Целью данного изобретения является его упрощение, сокращение времени, что позволяет быстро и с высокой точностью определять количество антипирина в слюне. Цель достигается путем осаждения балластных компонентов с последующим центрифугированием супернатанта при скорости 14000 об/мин в течение 5 минут, встряхиванием смеси супернатанта с ZnSO₄*7H₂О и 0,75N NaOH в течение 1 минуты с центрифугированием при 14000 об/мин 5 минут, а затем хроматографированием 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 методом обращенной-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 C18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С.

Способ осуществляют следующим образом: пробу слюны (3 мл) собирают через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина и центрифугируют в течение 10 минут при скорости 3000 об/мин, забирают 300 мкл супернатанта и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 14000 об/мин.

Отбирают 150 мкл супернатанта, добавляют 150 мкл ZnSO₄*7H₂О и 170 мкл 0,75N NaOH, встряхивают 1 минуту, центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, отбирают 100 мкл аликвоты рН 7,5-8 и наносят в инжектор хроматографической системы. Хроматографический анализ проводят при следующих условиях: неподвижная фаза (хроматографическая колонка) - пронтосил 120-5 С18 2*75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза (элюент) - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН 6,5. Режим хроматографирования: спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, скорость потока элюента 100 мкл/мин, температура колонки 35°С.

Количественное определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата (см. таблицу 1).

Из таблицы 1 видно, что полученная концентрация антипирина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии соответствует концентрации стандарта градуировочных смесей на основе слюны.

В Новосибирском НИИ туберкулеза было исследовано 590 образцов слюны на спектрофотометре СФ-16, пороговая чувствительность метода составляла 1 мкг/мл. Параллельно было проведено исследование 430 проб предлагаемым нами хроматографическим методом, пороговая чувствительность составляла 0,2 мкг/мл.

Сравнительная характеристика данных высокоэффективной жидкостной хроматографии с результатами определения по способу Броди и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче доказывает возможность обнаружения низких концентраций антипирина (см. таблицу 2).

Таким образом, в отличие от других хроматографических методов, перечисленных выше, предлагаемый способ определения антипирина в слюне исключает применение токсических веществ (хлороформа, серной кислоты).

В сравнении с известным способом Броди и соавторов в модификации Девидсона и Мак Инче предлагаемый метод позволяет повысить точность, чувствительность определения антипирина в слюне, а также более прост в исполнении. В нем уменьшено количество рабочих растворов, сокращено число дозирующих процедур, сокращено время пробоподготовки, что способствует снижению трудозатрат на выполнение соответствующих лабораторных работ. В связи с этим возможно широкое внедрение метода в практическую деятельность медицинских учреждений, занимающихся лечением пациентов гепатотоксичными химиопрепаратами (онкологических, фтизиатрического профиля) либо страдающих заболеваниями печени (терапевтических и инфекционных стационаров).

Таблица 1 Результаты определения антипирина в модельных растворах слюны предлагаемым способом, р=0,95, n=5
Концентрация стандарта, мкг/мл	По калибровочному графику, мкг/мл
10	9,9±0,01
4,7	4,32±0,05
2,5	2,39±0,04
1,18	1,15±0,01
0,6	0,57±0,02
0,3	0,27±0,02
Таблица 2 Результаты определения антипирина в слюне методом спектрофотометрии (СФ) и предлагаемым способом с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Время, час	Концентрация антипирина, M±m, мкг/мл
СФ, n=10	ВЭЖХ, n=10
3	4,02±0,46	3,77±0,4
5	3,07±0,41	2,73±0,3
7	2,84±0,25	1,73±0,2
9	2,3±0,32	1,21±0,15
11	1,98±0,24	0,93±0,18
13	1,18±0,2	0,35±0,1

Список литературы:

1. Викторов А.П., Рыбак А.Е. Использование антипиринового теста при изучении микросомального окисления лекарственных средств // Фармакология и токсикол. - 1990. - Т.53. - N1. - С.74-79.

2. Sotaniemi E.A., Pelkonen R.O., Ahokas J. et al. Drug metabolism in man: in vivo and in vitro correlations // Arch.Toxicol.Suppl. - 1978. - Vol.1. - P.36-39.

3. Логинов А.С., Бендиков Э.А., Кельня Ж.А., Петраков А.В. Активность монооксигеназ при заболеваниях печени по данным метаболизма антипирина // Тер.арх. - 1987. - N2. - С.84-88.

4. Криничный А.В., Бекетов Б.Н., Малюшина Л.Н. Антипириновая проба в диагностике заболеваний печени // Диагностика и лечение заболеваний печени, поджелудочной железы, селезенки и двенадцатиперстной кишки: Тез.докл.конф.хирургов. - Тюмень. - 1990. - Т.1. - С.54-55.

5. Неделькина С.В., Субботина Р.С. Определение активности микросомальных ферментов у человека // Изв. СО АН СССР. - 1977. - N5, c.139-140.

6. Brodie B.B., Axelrod J., Soberman R., Levy B.B. The estimation of antipyrine in biological materials // J.Biol.Chem. - 1949. - Vol.179. - N25. - P.25-39.

7. Davidsson D., Mac Intyre J. - Biochem. J., 1956, v.62. №3, p.37P-38P.

8. Гичев Ю.Ю. Влияние пищевых индолов на активность монооксигеназной системы печени у больных вирусными гепатитами: Автореф. дисс.... канд.мед. наук. - Новосибирск, 2003. - 25 с.

9. Андреева Т.В., Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Горохов А.Г. Высокоэффективная жидкостная хроматография антипирина - метод экспресс-диагностики функциональной активности монооксигеназной системы печени человека // Хим.-фарм. жур. - 2000. - том 34. - №1. - с.10-11.

Способ определения антипирина в слюне, включающий сбор слюны через 3, 5, 7, 9, 11, 13 часов после приема антипирина, центрифугирование 3 мл слюны 10 мин при 3000 об/мин, добавление к 150 мкл супернатанта 150 мкл дистиллированной воды, 150 мкл ZnSO₄·7H₂O и 150 мкл 0,75 N NaOH, последующее центрифугирование смеси, отличающийся тем, что полученный после центрифугирования слюны супернатант в количестве 300 мкл центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, к смеси супернатанта и ZnSO₄·7Н₂О добавляют 170 мкл 0,75 N NaOH, встряхивают смесь 1 минуту и центрифугируют 5 минут при 14000 об/мин, затем 100 мкл аликвоты рН=7,5-8 хроматографируют методом ОФ ВЭЖХ при следующих условиях: неподвижная фаза - пронтосил 120-5 С18 2·75 мм, dp=5 мк; подвижная фаза - 100% ацетонитрил, фосфатный буфер рН=6,5, спектр ультрафиолетового поглощения - 244, 262, 280 нм, время 0,18 с, температура колонки 35°С, и определение проводят по калибровочному графику зависимости высоты хроматографического пика от концентрации препарата.