Способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах
Владельцы патента RU 2272287:
ГОУ ВПО "Московский государственный медико-стоматологический университет Министерства здравоохранения РФ" (RU)
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах. Предлагается способ количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале, заключающийся в том, что анализируемую пробу биожидкости (кровь, моча) после подкисления до рН=1 обрабатывают для извлечения определяемого вещества органическим экстрагентом. Фенозан-кислоту, содержащуюся в сухом остатке после упаривания экстракта, с целью увеличения летучести переводят в ее метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, используемого в качестве внутреннего стандарта. Полученный раствор анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальная температура колонки 75°С поддерживается без изменения 2 мин после ввода пробы, далее увеличивается до 280°С со скоростью 50 град/мин и поддерживается постоянной до конца программы. Концентрацию фенозан-кислоты определяют по предварительно построенному калибровочному графику. Технический результат: обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата, возможность его использования при выполнении клинических или фармакокинетических исследований препарата, а также при изучении его метаболизма. 3 табл.
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии - способам определения фармакологически активных веществ в биологических объектах.
Фенозан-кислота (4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовая кислота) является синтетическим антиоксидантом и изучается в качестве потенциального лекарственного препарата [Трещенкова Ю.А., Голощапов А.Н., Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты: Тез. докл. V Межд. конф. - М., 1998, С.182-183].
Известен способ количественного определения соединений, относящихся к пространственно-затрудненным фенолам, хемилюминесцентным методом путем регистрации изменения интенсивности хемилюминесценции модельной цепной реакции инициированного окисления углеводородов после введения в систему антиоксиданта [Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Хемилюминесцентный метод изучения природных антиоксидантов в липидах. // Биофизика. - 1971 - №1.- С.39-43].
Однако данный способ не может быть использован для определения фенозан-кислоты в биологических объектах, поскольку невозможно с необходимой достоверностью предварительно определить общее базисное содержание эндогенных антиоксидантов у каждого животного.
Задачей изобретения является обеспечение возможности количественного определения фенозан-кислоты в сложном многокомпонентном биологическом материале.
Это достигается за счет того, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.
Подкисление анализируемой пробы биожидкости до рН=1 необходимо для того, чтобы полностью подавить ионизацию фенозан-кислоты и тем самым обеспечить полный переход ее в органическую фазу в процессе экстракции. Перевод фенозан-кислоты в ее метиловый эфир осуществляется для того, чтобы повысить летучесть определяемого вещества. Предлагаемый температурный режим газожидкостного хроматографирования аналита необходим потому, что именно в этих условиях происходит удовлетворительное разделение пиков фенозан-кислоты, внутреннего стандарта и эндогенных соединений.
Способ осуществляют следующим образом.
К сухому остатку после эфирной экстракции биожидкости добавляют раствор диазометана. После завершения дериватизации эфир удаляют и к сухому остатку прибавляют хроматографически чистый внутренний стандарт, представляющий собой раствор додекана, например, в метаноле с концентрацией 15 нг/мкл. Пробу полученного раствора сразу же вводят в хромато-масс-спектрометр (например, газовый хроматограф HP 5980 серия II, масс-селективный детектор HP 5971 А и станция обработки данных HP 59970 С).
Пробу анализируют при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.
Пример. Количественное определение фенозан-кислоты в плазме крови кроликов (модельные растворы). Раствор "стандартной плазмы" готовят из лиофилизированной сухой плазмы добавлением соответствующего количества дистиллированной воды, перемешивания, настаивания, фильтрации. Основной стандартный раствор фенозан-кислоты концентрации 1 мг/мл готовят растворением точно взвешенного количества воздушно-сухого вещества в метаноле. Растворы-метчики получают разведением основного раствора: концентрация метчика от 10 до 1000 мкг/мл в соответствии с данными табл.1. 100 мкл каждого метчика добавляют к 1 мл плазмы для приготовления калибровочных растворов фенозан-кислоты с содержанием от 1 до 100 мкг/мл (Сплазмы). Для каждого значения концентрации готовят три раствора. "Нулевой" раствор содержит 100 мкл чистого метанола в плазме. После введения метчика растворы в плазме выдерживают не менее 1 ч при 20°С для установления равновесия.
Фенозан-кислоту из калибровочных растворов и из биожидкостей выделяют экстракцией эфиром после подкисления растворов до рН=1, эфирные экстракты упаривают в токе воздуха при 40°С. К сухим экстрактам добавляют по 1 мл эфирного раствора диазометана, смеси оставляют на 12 ч. После завершения дериватизации эфир удаляют в токе воздуха, к высушенному остатку приливают от 50 до 200 мкл раствора внутреннего стандарта, а затем 0,6-1,0 мкл полученного раствора сразу же вводят в хроматограф (Сгх).
Воспроизводимость хромато-масс-спектрометрического определения оценивали по стандартному раствору Сгх, содержащему 12,5 нг/мкл метилового эфира фенозан-кислоты (концентрация хроматографируемого раствора Сгх) и 10 нг/мкл внутреннего стандарта, при числе повторностей, равном 7: ; S=1,52; Sr=0,09; ε=1,4; доверительный интервал 16,5±1,4; W=9,2%.
Воспроизводимость методики оценивали по стандартному раствору 4 мкг/мл фенозан-кислоты в плазме (Спл) при числе повторностей, равном 7: 
; S=1,85; Sr=0,19; ε=1,7; доверительный интервал 9,8±1,7; W=17%. Здесь W - коэффициент вариации, S - среднее квадратичное отклонение, 
, 
, где tα - коэффициент Стьюдента при n=7, α=0,95.
В табл.2 приведены результаты калибровки. Объединенное уравнение регрессии для интервала концентраций 0,5-100 мкг/мл имеет вид: Спл=0,245Q+1,515 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,998. Для интервала концентраций 0,5-0,01 мкг/мл: Спл=0,097Q-0,0051 мкг/мл, коэффициент линейной регрессии r=0,989.
Для оценки методики в целом независимо приготовленный раствор - стандартный образец фенозан-кислоты в плазме концентрации 4 мкг/мл - был проанализирован среди серии калибровочных растворов. В табл.3 приведены значения определенных по калибровочному графику и рассчитанных концентраций фенозан-кислоты, 
.
Стандартная статистическая обработка полученных результатов показала их достоверность и высокую воспроизводимость для α=0,95, максимальное единичное отклонение средней величины 
от истинной концентрации составляет 18%, отклонение, рассчитанное для средней величины ΔС, составляет 2%.
Из табл.3 видно, что предлагаемый способ количественного определения фенозан-кислоты в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии обладает высокой чувствительностью и воспроизводимостью, он позволяет надежно и достоверно определять в биологическом материале количественное содержание фенозан-кислоты в различные интервалы времени после его введения.
Разработанный способ может быть использован для количественного определения фенозан-кислоты в плазме крови или моче после внутривенного или внутримышечного введения или после применения таблеток препарата.
| Таблица 1 | |||||||||
| Приготовление калибровочных растворов фенозан-кислоты в плазме крови. | |||||||||
| А | В | С | |||||||
| № | Cисх мг/мл | Vисх мл | Vобщ мл (МеОН) | Cметчика мкг/мл | Cплазмы мкг/мл | Cгх, нг/мкл | m (метиловый эфир фенозан-кислоты) нг | ||
| 200 мкл | 25 мкл | 200 мкл | 25 мкл | ||||||
| 1 | 1 | - | - | 1000 | 100 | 500 | 300 | ||
| 2 | 1 | 3,5 | 5 | 700 | 70 | 350 | 210 | ||
| 3 | 1 | 2,5 | 5 | 500 | 50 | 250 | 150 | ||
| 4 | 1 | 1,0 | 5 | 200 | 20 | 100 | 60 | ||
| 5 | 1 | 0,5 | 5 | 100 | 10 | 50 | 30 | ||
| 6 | 1 | 0,25 | 5 | 50 | 5 | 25 | 15 | ||
| 7 | 1 | 0,10 | 5 | 20 | 2 | 10 | 6 | ||
| 8 | 0,1 мкг/мл | 0,5 | 5 | 10 | 1 | 5 | 3 | ||
| 9 | 0,1 мкг/мл | 0,25 | 5 | 5 | 0,5 | 2,5 | 20 | 1,5 | 12 |
| 10 | 0,01 мкг/мл | 0,5 | 5 | 1,0 | 0,1 | 0,5 | 4 | 0,3 | 2,4 |
| 11 | 0,01 мкг/мл | 0,25 | 5 | 0,5 | 0,05 | 0,25 | 2 | 0,15 | 1,2 |
| 12 | 0,001 мкг/мл | 0,5 | 5 | 0,1 | 0,01 | 0,05 | 0,4 | 0,03 | 0,24 |
| А - из расчета объем метчика 100 мкл, объем плазмы 1 мл. | |||||||||
| В - из расчета объем реконструирующего раствора 200 мкл и 25 мкл. | |||||||||
| С - из расчета объема пробы, вводимой в хроматограф, равной 0,6 мкл. |
| Таблица 2 | |||||||
| Результаты анализа калибровочных растворов фенозан-кислоты в плазме крови. | |||||||
| № | Спл, мкг/мл | Cгх мкг/мл | Q1 | Q2 | О3 | ||
| 1 | 100 | 500 | 338 | 340 | 351 | ||
| 2 | 70 | 350 | 238 | 242 | 242,7 | ||
| 3 | 50 | 250 | 170,7 | 168,3 | 190 | ||
| 4 | 20 | 100 | 58,5 | 51,8 | 56,4 | ||
| 5 | 10 | 50 | 31,12 | 39,3 | 31,6 | ||
| 6 | 5 | 25 | 12,4 | 10,02 | 13,6 | ||
| 7 | 2 | 10 | 4,44 | 4,52 | 2,66 | ||
| Таблица 3 | |||||||
| Оценка точности методики анализа фенозан-кислоты в плазме крови. | |||||||
| № | Q |   |  |  | S |  | ΔС |
| 1 | 13,157 | 4,74 | 0,83 | 0,74 | 18,5 | ||
| 2 | 8,93 | 3,70 | 0,21 | 0,30 | 7,5 | ||
| 3 | 9,57 | 3,86 | 0,05 | 0,14 | 3,5 | ||
| 4 | 9,80 | 3,92 | 3,91 | 0,01 | 0,455 | 0,08 | 2,0 |
| 5 | 7,44 | 3,34 | 0,57 | 0,66 | 16,5 | ||
| 6 | 8,56 | 3,61 | 0,30 | 0,39 | 9,75 | ||
| 7 | 11,01 | 4,21 | 0,30 | 0,21 | 5,25 |
Способ количественного определения фенозан-кислоты, 4-гидрокси-3,5-ди-трет-бутилфенилпропионовой кислоты в биологических жидкостях, характеризующийся тем, что анализируемую пробу биожидкости после подкисления до рН=1 обрабатывают органическим экстрагентом для извлечения фенозан-кислоты, после чего переводят ее в метиловый эфир, к которому добавляют раствор додекана, анализируют методом хромато-масс-спектрометрии при следующем температурном режиме: начальную температуру колонки 75°С поддерживают без изменения 2 мин после ввода обработанной пробы биожидкости, далее температуру увеличивают до 280°С со скоростью 50 град/мин, концентрацию фенозан-кислоты определяют по калибровочному графику.
