Способ прогнозирования течения острых кишечных инфекций у детей

Изобретение относится к области лабораторной диагностики и может быть использовано для прогнозирования течения инфекционного процесса при острых кишечных инфекциях у детей. Сущность изобретения состоит в том, что в мазках проб крови, окрашенных акридиновым оранжевым, рассчитывают коэффициент соотношения количества полиморфно-ядерных лейкоцитов с однонитевой РНК к количеству полиморфно-ядерных лейкоцитов с двуспиральной ДНК до (α^k) и после (α°) обработки эндотоксином, определяют индекс соотношения α° к α^k и при его значении, большем или равном единице, прогнозируют затяжное течение острой кишечной инфекции. Техническим результатом является повышение точности прогноза.

 

Изобретение относится к медицине, в частности к инфекционным болезням, и может быть использовано для прогнозирования течения инфекционного процесса при острых кишечных инфекциях (ОКИ) у детей.

Проблема острых кишечных инфекций, обусловленных патогенными возбудителями (шигеллами, сальмонеллами, эшерихиозами), у детей по-прежнему является одной из наиболее актуальных в инфекционной патологии, поскольку уровень заболеваемости во многих странах мира, в том числе и в Российской Федерации, остается на достаточно высоких цифрах. Отмечен рост бактериальных диарей, вызванных условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), что связано с экологическим неблагополучием и нерациональным использованием антибиотиков или других препаратов. В отличие от характера течения ОКИ прошлых лет, особенно у детей, наблюдаются существенные изменения клинического течения этих заболеваний. Увеличилась частота регистраций тяжелых с затяжным течением форм ОКИ с выраженными симптомами токсикоза.

Степень интоксикации, тяжесть течения и исход ОКИ, в первую очередь, зависят от своевременного включения функционально-адаптационных систем макроорганизма и их активности. Оценка показателей, отражающих особенности взаимоотношений возбудителя и макроорганизма при инфекционных заболеваниях, как известно, позволяет объективно оценить характер и прогноз течения инфекционного процесса при ОКИ.

В последние годы проблеме разработки методологических подходов к оценке прогноза течения инфекционных заболеваний уделяется большое внимание. Так, известен способ прогнозирования течения ОКИ, основанный на определении степени связывания эндотоксина грамотрицательными бактериями при помощи FC-зависимого механизма (В.Г.Лиходед, И.А.Аниховская и соавт. FC-зависимое связывание эндотоксинов грамотрицательных бактерий полиморфноядерными лейкоцитами крови человека //Журн.микробиол., 1996, №2, с.76-79), описаны способ определения биосинтетической активности лимфоцитов больных шигеллезом с помощью иммуноферментного анализа (М.З.Шахмарданов, В.И.Лучшев и соавт. Биосинтетическая активность лимфоцитов больных шигеллезом на фоне лечения эубиотиками //Журн.эпидем. и инфекц.болезни, 1997, №1, с.42-44) и способ, основанный на способности эозинофилов взаимодействовать с липополисахаридом (ЛПС) (М.Ю.Яковлев, А.А.Кубатиев, В.М.Бондаренко и соавт. Эозинофил- супераффинная клетка крови человека к эндотоксину //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1989, №6, с.765-766).

Несмотря на высокую степень технологии и чувствительности предложенных способов прогнозирования характера течения инфекционных заболеваний последние не лишены существенных недостатков. Они не обладают точностью, отличаются трудоемкостью и длительностью проведения исследования, для воспроизведения требуют дорогостоящего оборудования и препаратов, а также строгого соблюдения противоэпидемического режима в связи с работой живыми культурами возбудителей.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ прогнозирования характера течения ОКИ, основанный на оценке функциональной активности лимфоцитов крови с использованием флюоресцентного красителя акридинового оранжевого (Е.Г.Завгородняя, М.З. Шахмарданов и соавт. //Журн. Клинич.лаб.диагн., 1993, №2, с.75-76 ). Для исследования используются пробы крови из пальца в объеме 0,5 мл, которая отстаивается в термостате при температуре 37°С в течение 20-30 мин, затем разводится раствором питательной среды 199 (1:1). Из полученной смеси, взятой в объеме 0,02 мл, готовится тонкий мазок, который высушивается, фиксируется в смеси 96° этилового спирта с ацетоном (1:1) и затем окрашивается акридиновым оранжевым красителем в концентрации 1:25000 в течение 10 мин. Окрашенные мазки просматривают на микрофлюориметре «Люмам И-3» и учитывают интенсивность флюоресценции нуклеиновых кислот (РНК и ДНК) в лимфоцитах. В красной области спектра (640 нм) учитывается свечение однонитевых РНК. При исследовании в зеленой части спектра (530 нм) определяется свечение двуспиральной ДНК. Соотношение количества лимфоцитов с РНК свечением к количеству лимфоцитов с ДНК-свечением характеризует их биосинтетическую активность и определяется как коэффициент «», который у «условно» здоровых составляет 0,12±0,02, у больных ОКИ на начальном этапе заболевания коэффициент «» колеблется от 0,17±0,01 до 0,25±0,03.

Основным недостатком вышеописанного способа оценки функциональной активности лимфоцитов крови с использованием акридинового оранжевого красителя является его ограниченная информация о прогнозе характера течения заболевания. Описанный способ не обеспечивает объективной сравнительной оценки функциональной активности лимфоцитов при дополнительной нагрузке липополисахарида (ЛПС).

Между тем, известно, что уже на начальном этапе развития инфекционного процесса при ОКИ в толстой кишке, наряду с высокой колонизационной активностью возбудителя, регистрируется высокая колонизация и другими условно-патогенными (УПМ) грамотрицательными микроорганизмами, что сопровождается развитием декомпенсированных форм дисбактериоза кишечника и, следовательно, снижением антиинфекционной резистентности макроорганизма. Снижению антиинфекционной (колонизационной) резистентности слизистой толстой кишки при ОКИ у детей способствует поступление специфического ЛПС возбудителя в кровоток. Дозы ЛПС, превышающие функциональные возможности природных защитных (антиэндотоксиновых) систем организма, вызывают активацию мононуклеарных клеток с последующим истощением их функциональной активности, пролонгируя и утяжеляя таким образом течение инфекционного процесса.

Для устранения вышеуказанных недостатков авторы впервые предлагают способ прогнозирования характера течения ОКИ у детей путем оценки функционального состояния полиморфно-ядерных лейкоцитов (ПЯЛ) в мазках проб крови с гепарином, окрашенных акридиновым оранжевым красителем и просмотренных под люминесцентным микроскопом, отличающийся тем, что пробу крови распределяют в пробирки - «контроль» и «опыт», опытную пробу обрабатывают эндотоксином, подсчитывают в опытных и контрольных мазках ПЯЛ с однонитевой РНК, флюоресцирующей в красной области спектра и двуспиральной ДНК, флюоресцирующей в зеленой части спектра, рассчитывают коэффициент соотношения количества ПЯЛ с однонитевой РНК к числу ПЯЛ с двуспиральной ДНК и при сравнительной оценке этих коэффициентов устанавливают индекс, по которому судят об утрате или сохранении резервов связывания эндотоксина ПЯЛ. И прогнозируют (при индексе ≥1) затяжной или хронический характер течения инфекционного процесса.

Технический результат изобретения заключается в повышении точности и экспрессности.

С целью повышения точности способа авторы впервые предлагают проводить исследование проб крови от больных ОКИ одновременно в «опыте» и «контроле». В «контрольной» пробе авторы определяют «исходный» коэффициент (α^k), отражающий уровень функциональной активности лейкоцитов (ПЯЛ) на начальном этапе (в первые дни болезни) развития инфекционного процесса. В отличие от прототипного способа авторы впервые предлагают проводить повторное определение коэффициентов РНК/ДНК (α°) после обработки исследуемых клеток ПЯЛ эндотоксином. Для осуществления этого этапа исследования авторы используют дополнительную пробу крови («опыт»). Таким методологическим подходом авторы впервые моделируют процесс дополнительного поступления ЛПС в кровоток, обусловленный высокой колонизационной активностью грамотрицательной микрофлоры, которая имеет место при всех нозологических формах ОКИ. Следовательно, полученный коэффициент в опытной пробе объективно отражает функциональную активность лейкоцитов после дополнительной нагрузки, что отражает резервную возможность ПЯЛ нейтрализовать ЛПС.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. Использованы малые объемы крови, взятые из пальца (0,5 мл), кровь с гепарином отстаивается в термостате при 37°С в течение 20-30 мин. Полученную плазму в соотношении 1:1 разводят раствором питательной среды 199 и распределяют в две пробирки («опыт» и «контроль»). В опытную пробирку вносят эндотоксин (50 мкг/мл), что и отличает это изобретение от вышеперечисленных методов. Из полученных растворов («опыта» и «контроля»), взятых в объеме 0,02 мл, готовят два тонких мазка. Высушенные мазки фиксируют 20 мин - смесью 96° этилового спирта и ацетона (1:1). Далее мазки промывают дистиллированной водой, погружают в цитратно-фосфатный буфер рН 4,2 на 4-5 мин. Обработанные таким образом мазки окрашивают акридиновым оранжевым красителем (1:25000) в течение 10 мин. Окрашенные мазки просматривают под люминесцентным микроскопом с использованием светофильтров СЗ С 24-4, ФС 1-2, ЖС 18, ЖС 19 и светоделительной пластинки («зеленая»). При исследовании клеток в красной области спектра (640 нм) учитывают свечение однонитевых РНК, при исследовании в зеленой части спектра (530 нм) - двуспиральных ДНК. В каждом мазке из 25 ПЯЛ подсчитывают клетки со свечением однонитевых РНК и двуспиральных ДНК, определяют соотношение РНК/ДНК - коэффициенты α° и α^k , затем рассчитывают индекс - частное от деления коэффициента α° к α^k. При индексе, равном или более 1 (≥1), судят об утрате резервов связывания эндотоксина ПЯЛ и прогнозируют затяжной или хронический характер течения инфекционного процесса.

Предложенный способ апробирован на материале (пробах крови) от 25 больных ОКИ (шигеллезом, сальмонеллезом, эшерихиозом). Результаты изучения функциональной активности ПЯЛ, установленной в соответствии к предлагаемому способу, позволили установить, что при индексе ≥1 имела место утрата резервов связывания эндотоксина ПЯЛ, что коррелировало (r=0,78) с тяжестью и длительностью течения инфекционного процесса при этих заболеваниях. Клиническая картина у больных ОКИ с индексом ≥1 характеризовалась наличием выраженных симптомов интоксикации. У всех больных отмечались многократная рвота, резкая слабость, длительная лихорадка до 38,5°С. Частота жидкого стула доходила до 10 раз с примесью слизи и крови, схваткообразные боли в животе, болезненная сигмовидная кишка. При индексе < 1 клиническая картина характеризовалась умеренными признаками интоксикации и непродолжительной лихорадки. Ведущими клиническими проявлениями были жидкий стул до 5 раз в сутки. Тошноты и рвоты не регистрировались. У этой группы пациентов прогноз течения заболевания был благоприятный.

Выявленная закономерность подтверждена следующими примерами.

Пример 1. Больной Максим Р., 2 года 3 мес. Диагноз: Острая дизентерия Флекснер 2а, тяжелая форма. Осложнение: Миокардиодистрофия острого периода дизентерии.

Ребенок заболел остро. Отмечались выраженные симптомы интоксикации: бледность, повышение температуры до 38,4-39,5°С и многократная рвота, а также гемоколитный синдром. Симптомы интоксикации сохранялись до 18 дня болезни, боли в животе и тенезмы отмечались в течение 14 дней. Дисфункция кишечника регистрировалась до 26 дня болезни, гемоколит - до 12 дня, бактериовыделения - до 21 дня.

У пациента коэффициент α^k равен 0,25±0,02, α° - 0,36±0,03, индекс (соотношение α° к α^k) составил >1.

Пример 2. Больной Слава Т., 1 год 4 мес. Диагноз: Острая дизентерия Зонне, средне тяжелая форма.

Ребенок поступил в первые сутки заболевания, заболел остро с подъема температуры до 38,5°С . Отмечался 3-кратный жидкий стул со слизью. Явления гемоколита и болевой синдром носили кратковременный характер до 3-го дня болезни. Нормализация характера стула - на 5 сутки.

Коэффициент α^k у пациента равен 0,20±0,02, α° - 0,16±0,03, индекс (соотношение α° к α^k) составил <1.

Таким образом, авторами впервые предложен способ прогнозирования течения ОКИ у детей. Учитывая доступность, высокую чувствительность и возможность получения результатов через 1,5-2 час после взятия материала, разработанный способ является перспективным и может быть применен при массовых скрининговых обследованиях детей при ОКИ для прогноза затяжного или хронического течения инфекционного процесса при ОКИ.

Пример 3. Больной Владислав С., 3 года 2 мес. Диагноз: Острая дизентерия Флекснер 2а, тяжелая форма, затяжное течение. Ребенок заболел остро, с подъема температуры до фебрильных цифр (38,4-39,5°С), однократной рвоты, болей в животе и появлением жидкого стула со слизью и прожилками крови. При поступлении состояние мальчика тяжелое за счет выраженных симптомов интоксикации: вялость, адинамия, анорексия, бледность кожных покровов. На отделении проводилась дезинтоксикационная, антибактериальная (гентамицин с фуразолидоном и клафораном) и симптоматическая терапия. На фоне проводимого лечения состояние мальчика несколько улучшилось, однако симптомы интоксикации сохранялись до 18 дня заболевания, гипертермия - до 11 дня болезни. Боли в животе и тенезмы сохранялись в течение 14 дней. Дисфункция кишечника сохранялась до 26 дня болезни, явления гемоколита - до 12 дня заболевания. При обследовании в анализе крови был выявлен выраженный нейтрофильный лейкоцитоз, сдвиг лейкоцитарной формулы влево до юных форм, ускоренная СОЭ до 24 мм/час. В копрограмме выраженные ферментативные нарушения, большое количество лейкоцитов и слизи. Бактериовыделение шигелл Флекснера 2а продолжалось до 21 дня болезни. Индекс соотношения α° и α^k, интегрально отражающий функциональную активность ПЯЛ, был больше 1, то есть свидетельствовал об утрате резервов связывания эндотоксина ПЯЛ, что и определяло тяжесть и затяжное течение инфекционного процесса.

Пример 4. Больная Светлана Ж., 5 лет. Диагноз: Острая дизентерия Флекснер 2а, среднетяжелая форма. Девочка поступила в стационар на 3 сутки заболевания. При поступлении состояние средней тяжести, вялая, отмечались: 3-кратная рвота, боли в животе, снижение аппетита и жидкий стул с примесью слизи до 4-6 раз в день. На фоне проведения этиотропной (полимиксин с фуразолидоном) и симптоматической терапии интоксикационный синдром купировался только к 10-му дню, болевой синдром и явления метеоризма сохранялись до 9-го дня болезни. Нормализация характера стула отмечалась на 7-й день болезни. Возбудитель (культура шигелл Флекснер 2а) выделялся трехкратно, при первичном обследовании и повторно на фоне проводимой этиотропной терапии. В анализе крови - нейтрофильный лейкоцитоз, ускорение СОЭ до 17 мм/час. В копрограмме - большое количество слизи, лейкоцитов до 60-70 в поле зрения. Индекс соотношения α° и α^k, интегрально отражающий функциональную активность ПЯЛ, был равен 1, то есть свидетельствовал о снижении потенциальной активности ПЯЛ связывать эндотоксин возбудителя, что и определяло затяжное течение инфекционного процесса.

Способ прогнозирования течения острых кишечных инфекций у детей путем исследования крови, отличающийся тем, что в мазках проб крови, окрашенных акридиновым оранжевым, рассчитывают коэффициент соотношения количества полиморфно-ядерных лейкоцитов с однонитевой РНК к количеству полиморфно-ядерных лейкоцитов с двуспиральной ДНК до (α^к) и после (α°) обработки эндотоксином определяют индекс соотношения α° к α^к и при его значении большем или равном единице прогнозируют затяжное течение острой кишечной инфекции.