Композиция, ингибирующая матричные металлопротеиназы, предназначенная для лечения неопластических болезней

Настоящее изобретение относится к композиции, эффективной при ингибировании матричной металлопротеиназы, содержащей катехин, аскорбиновую кислоту, пролин и лизин, для профилактики и лечения неопластических, воспалительных, инфекционных, сердечно-сосудистых, дегенеративных, неврологических и аутоиммунных заболеваний. 3 н. и 23 з.п. ф-лы, 9 ил.

 

Настоящее изобретение относится к применению катехинов в комбинации с другими компонентами, поступающими с пищей, для ингибирования матричных металлопротеиназ. Конкретнее, настоящее изобретение относится к применению композиции, содержащей катехин, аскорбиновую кислоту, лизин и пролин, при лечении неопластических состояний.

Полифенольные соединения, также известные как катехины, присутствуют в зеленом чае и, как предполагается, обеспечивают защиту от различных заболеваний, в том числе рака (Mukhtar H., Ahmed N., Am. J. Clin. Nutr., 71:16988-1702S (2000)). Sadzuka et al. показали, что пероральное введение зеленого чая усиливает ингибирующее действие доксорубицина на опухоли у мышей.

Противоопухолевая активность катехинов обусловлена их влиянием на некоторые факторы, участвующие в пролиферации и метастазировании раковых клеток. Известно, что катехины вызывают остановку клеточного цикла в клетках карциномы человека (Ahmad N., Feyes D.K., Nieminen A.L., Agrawal R., Mukhtar H.J., Natl. Cancer Inst., 89:1881-1886 (1997)). Показано, что полифенольная фракция из зеленого чая защищает от воспаления и цитокинов, индуцируемых опухолями.

Полифенольные соединения в зеленом чае составляют 30% сухой массы. К ним относятся флаванолы, флавандиолы, флавоноиды и фенольные кислоты. Флаванолы являются наиболее распространенными из числа полифенолов в зеленом чае и обычно известны как катехины. В зеленом чае присутствуют четыре основных катехина: 1) (-)-эпикатехин, 2) (-)-эпикатехин-3-галлат, 3) (-)-эпигаллокатехин и 4) (-)-эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG). Среди катехинов EGCG является основным из полифенольных составляющих, присутствующих в зеленом чае.

EGCG является сильным антиоксиданотом (J. Cell. Biochem., 265:236-257 (1996)) и может обеспечивать противораковую активность зеленого чая. Сообщалось, что катехины проявляют свою антиметастатическую активность путем предотвращения процесса анигиогенеза (Cao Y., Cao R., Nature, 398:381 (1999)). Также показано, что EGCG влияет на активность урокиназы (активатор u-плазминогена) - одного из наиболее часто экспрессируемых ферментов при раковых заболеваниях человека (Jankun J., Selman S.H., Swierez R., Skrzypczak J.E., Nature, 387-567 (1997)).

Однако установлено, что биологическая доступность полифенолов у людей крайне низкая (Chen L., Lee M.J., Yang C.S., Drag Metab. Dispos., 25:1045-1050 (1997); Yang C.S., Chen L., Lee M.J., Balentine D.A., Kuo M.C., Shantz S., Cancer Epidemol. Biomark. Prev., 7:351-35 (1998); Bell J.R., Donovan J.L., Wong R., Waterhouse H., German J.B., Walzem R.L., Kasim K., Am. J. Clin. Nutr., 71:103-108 (2000); Sherry Chow H.H., Cai Y., Alberts D.S., Hakim I., Dorr R., Shahi F., Crowell J.A., Yang S.C., Hara H., Cancer Epidemol. Biomark. Prev., 10:53-58 (2001)). Ссылки, цитированные в данном описании, включены в него в качестве ссылок. Низкая концентрация в ткани существенно снижает терапевтическую ценность полифенолов, в том числе EGCG. Таким образом, в настоящее время существует необходимость в поиске улучшенных композиций, содержащих полифенолы, эффективных при лечении неопластических состояний. Авторы неожиданно обнаружили, что композиция, содержащая катехины, аскорбиновую кислоту, пролин и лизин, обладает сильной антипролиферативной и антиметастатической активностью при неопластических состояниях (заболеваниях).

Настоящее изобретение относится к композиции биохимических веществ, содержащей катехин, антиоксидант, пролин и лизин, эффективной при лечении заболеваний человека.

Настоящее изобретение относится к композиции биохимических веществ, содержащей катехин, антиоксидант, пролин и лизин, эффективной при ингибировании матричных металлопротеиназ.

Настоящее изобретение относится к способу лечения неопластических состояний, связанных с чрезмерным разрушением внеклеточного матрикса, включающему введение эффективного количества композиции, содержащей катехин, антиоксидант, пролин и лизин.

Согласно изобретению катехин выбирают из группы, состоящей из эпикатехинов, эпигаллокатехина, эпикатехингаллата и эпигаллокатехингалата, антиоксидант выбирают из группы, состоящей из токоферолов, токотриенолов, глутатиона, альфа-липоевой кислоты, убихинолов и карнитина, и матричную металлопротеиназу (ММП) выбирают из группы, состоящей из ММП 1-12 и ММП 14.

Фиг.1 показывает ингибирующее действие EGCG на пролиферацию клеток рака молочной железы (MDA-MB 231).

Фиг.2 показывает синергичное ингибирующее действие комбинации EGCG, аскорбиновой кислоты, пролина и лизина на пролиферацию клеток рака молочной железы (MDA-MB 231).

Фиг.3 показывает синергичное ингибирующее действие комбинации EGCG, аскорбиновой кислоты, пролина и лизина на пролиферацию клеток рака толстой кишки (НСТ116).

Фиг.4 показывает, что EGCG (20 мкг/мл) ингибирует инвазию матригеля (Matrigel) клетками рака молочной железы примерно на 25%. Комбинация аскорбиновой кислоты, пролина и лизина ингибирует ее примерно на 65%. Комбинация аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с EGCG (20 мкг/мл) ингибирует инвазию матригеля полностью (примерно на 100%).

Фиг.5 показывает, что комбинация аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с EGCG (20 мкг/мл) синергично - до 100% ингибирует инвазию матригеля клетками меланомы (А2058).

Фиг.6 показывает зимограмму, иллюстрирующую, что EGCG снижает активность ММР2, секретированной клетками рака молочной железы.

Фиг.7 показывает нормальную морфологию клеток меланомы после анализа на инвазию матригеля.

Фиг.8 показывает изменения в морфологии клеток меланомы, вызванные комбинацией аскорбиновой кислоты, пролина и лизина.

Фиг.9 показывает апоптическое действие комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с EGCG.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к композиции, содержащей катехины, присутствующие в чайных экстрактах и красном вине, в сочетании с другими элементами, поступающими с пищей, для получения синергичного действия против неопластических и ряда других заболеваний. Компоненты, поступающие с пищей, охватываемые данной заявкой, включают компоненты, подробно описанные в описании, но не ограничиваются ими.

Катехины можно использовать в комбинации с другими антиоксидантами, такими как витамин Е, глутатион, с другими флавиноидами, с вспомогательными веществами, подобными фолиевой кислоте, и с металлами, подобными селену, которые известны как подходящим образом изменяющие активность матричных металлопротеиназ, которые обеспечат возможность снизить эффективную концентрацию, при которой EGCG может проявлять свою противоопухолевую активность.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к композиции, содержащей катехины, которая эффективна для уменьшения трансформации здоровых клеток организма в раковые клетки.

В другом воплощении настоящее изобретение относится к композиции, содержащей катехины, которая эффективна для предупреждения клеточной пролиферации раковых клеток и для ослабления синтеза, секреции и/или активности различных матричных металлопротеиназ, расщепляющих внеклеточный матрикс (ЕСМ).

В другом воплощении настоящее изобретение относится к способу предупреждения и лечения неопластических состояний путем местного или перорального введения композиции, содержащей катехины, аскорбиновую кислоту, пролин и лизин.

Далее настоящее изобретение описывается подробно с обращением к приведенным примерам, не предполагающим ограничения изобретения.

Материалы и методы

(a) Клеточные линии

В исследованиях использовали следующие клеточные линии:

(i) клетки рака молочной железы человека MDA-MB 231;

(ii) клетки рака толстой кишки человека НСТ 116;

(iii) клетки меланомы человека А 2058.

(b) Исследования клеточной пролиферации

Для того, чтобы исследовать действие катехинов и пищевой композиции на пролиферацию раковых клеток человека различные линии раковых клеток человека культивировали в 24-луночных планшетах согласно рекомендациям АТСС (поставщик клеточных линий). Клетки обычно инкубировали в течение 3-4 суток (до достижения слияния). Общее число клеток в культуре определяли окрашиванием клеток витальным красителем (МТТ) с последующим определением OD раствора красителя. МТТ окрашивает только погибшие клетки, и количество поглощенного красителя коррелирует с числом погибших клеток в культуре. Процент ингибирования вычисляли, сравнивая OD опытных групп с OD контрольных групп.

(c) Исследования инвазии матригеля

Исследования инвазии матригеля проводили с использованием вкладышей матригеля (Becton Dickinson) в совместимые 24-луночные планшеты. Данный анализ является надежным анализом для оценки метастазирования рака.

Фибробласты человека высевали и культивировали в 24-луночных планшетах с использованием культуральных сред, содержащих ˜ 10% сыворотки. Когда фибробласты достигали слияния, культуральные среды с сывороткой удаляли и заменяли свежими средами без сыворотки. В среды без сыворотки добавляли комбинацию катехинов с добавлением пищевой композиции и на верхнюю поверхность матригелевых вкладышей высевали раковые клетки человека.

Через 18 часов среды удаляли. Некоторые количества сред сохраняли для исследований с помощью зимограмм. Клетки с верхней поверхности вкладышей осторожно снимали ватным тампоном. Клетки, проникшие в матригелевую мембрану и прошедшие до нижней поверхности матригеля, окрашивали красителем Quick Stain и подсчитывали под микроскопом.

(d) Исследования с помощью зимограмм

Среды (25-30 мкл) от исследований инвазии матригеля наносили на гели для зимограмм Novex (Invitrogen). После проведения электрофореза гелевые пластинки окрашивали согласно рекомендациям производителя. Полосы матричных металлопротеиназ (ММР) идентифицировали на основании их известных молекулярных масс.

(e) Морфологические исследования

Морфологию раковых клеток человека, которые мигрировали в нижнюю поверхность матригелевой мембраны, выявляли окрашиванием красителем Quick Stain и фотографировали под микроскопом (100Х).

Пример 1

Ингибирующее действие эпигалокатехингаллата (EGCG) на пролиферацию клеток рака молочной железы человека (MDA MB 231)

В каждую лунку 24-луночного планшета вносили 5×10⁴ клеток рака молочной железы (MDAMB 231). В качестве контрольной группы использовали клетки рака молочной железы, выращенные в среде Лейбовица с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FBS). Опытные группы представляли собой клетки рака молочной железы, выращенные в среде Лейбовица с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка (FBS) плюс 0, 10, 20, 50, 100 или 200 мкг/мл EGCG. Планшеты инкубировали без добавления CO₂ в течение 4 суток.

По окончании указанного периода культуральные среды удаляли и клетки в каждой лунке окрашивали МТТ. Избыток МТТ отмывали. Окрашенные МТТ раковые клетки растворяли в 1 мл ДМСО. Для каждой лунки определяли оптическую плотность (OD) раствора. OD для лунки прямо пропорциональна числу погибших клеток. OD окрашенных МТТ раковых клеток, предварительно культивированных в отсутствие EGCG, использовали в качестве контроля и принимали за 100. Процент ингибирования вычисляли по формуле % ингибирования = (OD_{контроля}-OD_опыта)/OD_{контроля}×100%.

EGCG в концентрации 20, 50, 100 и 200 мкг/мл вызывал 3, 34, 66 и 70% ингибирование пролиферации раковых клеток человека, соответственно, (фиг.1). EGCG в концентрации 10 мкг/мл не вызывал ингибирования пролиферации раковых клеток.

Пример 2

Ингибирующее действие комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с разными концентрациями EGCG на пролиферацию клеток рака молочной железы человека (MDA MB 231)

Анализ проводили также, как в примере 1.

В данных исследованиях в культуральные среды добавляли:

(i) аскорбиновую кислоту (100 мкМ) + пролин (140 мкМ);

(ii) аскорбиновую кислоту (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ);

(iii) аскорбиновую кислоту (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) плюс 20 мкг/мл EGCG;

(iv) аскорбиновую кислоту (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) плюс 50 мкг/мл EGCG; или

(v) аскорбиновую кислоту (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) плюс 100 мкг/мл EGCG.

Комбинация аскорбиновая кислота + пролин не вызывала какого-либо ингибирования клеточной пролиферации. Комбинация аскорбиновая кислота + пролин + лизин ингибировала клеточную пролиферацию примерно на 14% (фиг.2). Комбинация аскорбиновая кислота + пролин + лизин плюс 20 мкг/мл EGCG вызывала 20% ингибирование. Один EGCG в концентрации 20 мкг/мл вызывал только 3% ингибирование (пример 1). Таким образом, комбинация аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с EGCG действует синергично в отношении ингибирования пролиферации раковых клеток.

Пример 3

Ингибирующее действие комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с разными концентрациями EGCG на пролиферацию клеток рака толстой кишки человека (НСТ116)

В данном исследовании клетки рака толстой кишки человека выращивали в среде Мак-Кои 5А с 10% фетальной сывороткой теленка в атмосфере 5% СО₂. Анализ проводили также, как в примере 2.

Комбинация аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с EGCG синергично усиливала ингибирующее действие на клеточную пролиферацию от 0% до 31% при 20 мкг/мл EGCG и до примерно 95% при 50 мкг/мл EGCG (фиг.3).

Ингибирующее действие EGCG и комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина на инвазию матригеля раковыми клетками

Пример 4

Ингибирующее действие различных концентраций EGCG и комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с различными концентрациями EGCG на инвазию в матригеле клеток рака молочной железы (MDA MB 231)

Анализ на инвазию матригеля описан выше. В данном анализе клетки рака молочной железы (5×10⁴) высевали на каждый вкладыш. В среду Лейбовица добавляли различные добавки. Планшеты инкубировали в инкубаторе без добавления СО₂.

Концентрация 20 или 50 мкг/мл EGCG в среде ингибировала инвазию клетками рака молочной железы примерно на 26% и 100%, соответственно. Хотя комбинация аскорбиновая кислота (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) в средах вызывала 65% ингибирование, комбинация аскорбиновая кислота (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) + 20 мкг/мл EGCG полностью ингибировала (100% ингибирование) инвазию раковыми клетками (фиг.4).

Пример 5

Ингибирующее действие различных концентраций EGCG и комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина с различными концентрациями EGCG на инвазию в матригеле клеток рака меланомы человека (А 2058)

Анализ на инвазию описан выше. Клетки меланомы человека (5×10⁴) высевали на каждый вкладыш. В среду DMEM добавляли различные добавки. Планшеты инкубировали в инкубаторе с 5% СО₂.

Хотя комбинация аскорбиновая кислота (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) в средах вызывала только 13% ингибирование, комбинация аскорбиновая кислота (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) плюс 20 мкг/мл EGCG полностью предупреждала инвазию клеток меланомы в матригель (фиг.5).

Исследования с помощью зимограмм

Пример 6

Действие различных концентраций EGCG на продуцирование ММР2 клетками рака молочной железы человека (MDA MB 231)

Аликвоты от различных обработок в анализе на инвазию матригеля (пример 4) наносили на гель для зимограмм Novex (Invitrogen). После проведения электрофореза гель окрашивали согласно рекомендациям производителя. Полосы матричных металлопротеиназ (ММР) идентифицировали на основании их известных молекулярных масс (фиг.6).

Зимограмма культуральных сред от анализов на инвазию матригеля показала, что 20 мкг/мл EGCG в средах снижала продуцирование ММР2 и полностью ингибировала продуцирование ММР9 (фиг.6). При концентрациях EGCG 50 мкг/мл и 100 мкг/мл активности ММР2 и ММР9 ингибировались полностью (фиг.6).

Морфология клеток

Пример 7

Действие EGCG и комбинации аскорбиновой кислоты, пролина и лизина на морфологию клеток меланомы человека (А 2058)

Микрофотографии раковых клеток в базальных средах, при их миграции через матригель, приведены на фиг.7. Включение в среды комбинации аскорбиновая кислота (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) изменяло морфологию клеток (фиг.8). Растяжение клеток с разным развитием ядра очевидно. Добавление в среды к комбинации аскорбиновая кислота (100 мкМ) + пролин (140 мкМ) + лизин (400 мкМ) 20 мкг/мл EGCG вызывает экстенсивные апоптические изменения (фиг.9).

Результаты, описанные в примерах 1-7, показывают, что EGCG проявляет сильное синергичное действие при использовании в комбинации аскорбиновая кислота + пролин + лизин. Следовательно, указанные исследования показывают неожиданное синергичное действие комбинации EGCG и комбинации аскорбиновая кислота + пролин + лизин, что создает возможность получения существенного преимущества антипролиферативной и антиметастатической активности EGCG при сравнительно низкой его концентрации в тканях.

Следовательно, полученные данные имеют большое значение, так как они могут привести к обеспечению эффективной концентрации катехинов, более приближенной к концентрациям, которые можно достичь в тканях.

Предполагается, что пролиферация раковых клеток и активация их ферментов вызываются повышенной концентрацией реакционноспособных кислородсодержащих частиц (ROS). В такой ситуации применение комбинаций различных биологических антиоксидантов, таких как токоферолы и картиноиды, с другими вспомогательными веществами, подобными убихинолоам, бифлавоноидам, липоевой кислоте и карнитину, будет обеспечивать более сильную синергичную смесь для лечения вышеуказанных состояний и заболеваний.

Настоящее изобретение приводит к неожиданному наблюдению, что комбинация, содержащая катехины, может проявлять синергичную активность, и посредством этого создается возможность достижения весьма эффективной противораковой активности при более низких концентрациях катехинов в тканях. Вышеуказанные выводы открывают возможность использования различных элементов в комбинации различных элементов в количествах, эффективных для предупреждения и лечения неопластических состояний и заболеваний.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что пролин и лизин не ограничиваются только пролином и лизином. Предусматривается, что объем настоящего изобретения охватывает производные лизина и его предшественников и производные пролина и его предшественников.

Специалисту в данной области техники будет понятно, что под антиоксидантом, аскорбиновой кислотой следует понимать также производные аскорбиновой кислоты и предшественников аскорбиновой кислоты.

К другим биологическим антиоксидантам относятся токоферолы и родственные соединения, трансретиноевая кислота и родственные соединения, каратиноиды и родственные соединения, фолаты и родственные соединения, бифлавоноиды и родственные соединения, а также соединения селена.

Клинические применения

Изобретение фокусируется на профилактическом и лечебном применении катехина в комбинации с антиоксидантом, пролином и лизином. Комбинация катехина с антиоксидантом, пролином и лизином повышает эффективность катехина при лечении болезней человека.

К болезням человека относятся, но не ограничиваются перечисленным, неопластические состояния, воспалительные заболевания, инфекционные болезни, сердечно-сосудистые заболевания и другие патологические состояния с участием разрушения внеклеточного матрикса. К таким состояниям относятся аномальный ангиогенез, патологическая интравазация, ревматоидный артрит и остеоартрит, атеросклероз, дилатированная кардиомиопатия, эмфизема и другие хронические состояния.

Настоящее изобретение относится к способу лечения и предупреждения болезней у человека, включающих разрушение внеклеточного матрикса, таких как: i) неопластические состояния; ii) воспалительные состояния (включая аллергии, эмфизему, ревматоидный артрит, остеоартрит, перидонтит, нейродерматит и другие состояния); iii) инфекционные болезни (включая вирусные инфекции, такие как простуда, грипп, гепатит, герпес, ВИЧ и другие инфекции; бактериальные инфекции, такие как пневмония, туберкулез, менингит, гонорея, сифилис, и грибковые заболевания); iv) сердечно-сосудистые заболевания (включая атеросклероз, кардиомиопатию, повторный стеноз после ангиопластики и другие заболевания); v) дегенеративные болезни (включая остеопороз, артрит и другие заболевания); vi) неврологические расстройства (включая болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и другие заболевания); и vii) аутоиммунные заболевания (включая артрит и другие заболевания), путем введения эффективных количеств композиций, описанных в данной заявке.

1. Композиция, содержащая катехин, антиоксидант, пролин и лизин, эффективная при ингибировании матричной металлопротеиназы.

2. Композиция по п.1, в которой катехин выбирают из группы, состоящей из эпикатехинов, эпигаллокатехина, эпикатехингаллата и эпигаллокатехингаллата.

3. Композиция по п.1, в которой антиоксидант выбирают из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, токоферолов, токотриенолов, каротиноидов, глутатиона, альфа-липоевой кислоты, убихинолов, биофлавоноидов и карнитина.

4. Композиция по п.3, в которой аскорбиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из предшественников аскорбатов, метаболитов аскорбатов и аскорбата соли.

5. Композиция по п.1, которая дополнительно содержит фолиевую кислоту.

6. Композиция по п.5, в которой фолиевая кислота является фолатом.

7. Композиция по п.1, которая дополнительно содержит селен.

8. Композиция по п.7, в которой селен выбирают из группы, состоящей из селенита и метилселината.

9. Композиция по п.1, в которой матричную металлопротеиназу выбирают из группы, состоящей из матричной металлопротеиназы 1, матричной металлопротеиназы 2, матричной металлопротеиназы 3, матричной металлопротеиназы 4, матричной металлопротеиназы 5, матричной металлопротеиназы 6, матричной металлопротеиназы 7, матричной металлопротеиназы 8, матричной металлопротеиназы 9, матричной металлопротеиназы 10, матричной металлопротеиназы 11, матричной металлопротеиназы 12 и матричной металлопротеиназы 14.

10. Способ лечения болезней человека, связанных с повышенной активностью матричной металлопротеиназы, включающий введение нуждающемуся в этом пациенту композиции, содержащей катехин, антиоксидант, пролин и лизин, эффективной при ингибировании матричной металлопротеиназы.

11. Способ по п.10, согласно которому катехин выбирают из группы, состоящей из эпикатехинов, эпигаллокатехина, эпикатехингаллата и эпигаллокатехингаллата.

12. Способ по п.10, согласно которому антиоксидант выбирают из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, токоферолов, токотриенолов, каротиноидов, глутатиона, альфа-липоевой кислоты, убихинолов, биофлавоноидов и карнитина.

13. Способ по п.12, согласно которому аскорбиновая кислота включает аскорбат, выбранный из группы, состоящей из предшественников аскорбатов, метаболитов аскорбатов и солей аскорбатов.

14. Способ по п.10, согласно которому композиция дополнительно содержит фолиевую кислоту.

15. Способ по п.14, согласно которому фолиевая кислота включает фолат.

16. Способ по п.10, согласно которому композиция дополнительно содержит селен.

17. Способ по п.16, согласно которому селен выбирают из группы, состоящей из селенита и метилселината.

18. Способ по п.10, согласно которому болезнь человека выбирают из группы, состоящей из неопластических состояний, воспалительных заболеваний, инфекционных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, дегенеративных болезней, неврологических болезней и аутоиммунных болезней.

19. Способ лечения неопластических заболеваний, связанных с чрезмерным разрушением внеклеточного матрикса, включающий введение эффективного количества композиции, содержащей катехин, антиоксидант, пролин и лизин.

20. Способ по п.19, согласно которому катехин выбирают из группы, состоящей из эпикатехинов, эпигаллокатехина, эпикатехингаллата и эпигаллокатехингаллата.

21. Способ по п.19, антиоксидант выбирают из группы, состоящей из аскорбиновой кислоты, токоферолов, токотриенолов, каротиноидов, глутатиона, альфа-липоевой кислоты, убихинолов, биофлавоноидов и карнитина.

22. Способ по п.21, согласно которому аскорбиновую кислоту выбирают из группы, состоящей из предшественников аскорбатов, метаболитов аскорбатов и солей аскорбатов.

23. Способ по п.19, согласно которому композиция дополнительно содержит фолиевую кислоту.

24. Способ по п.23, согласно которому фолиевая кислота включает фолат.

25. Способ по п.19, согласно которому композиция дополнительно содержит селен.

26. Способ по п.25, согласно которому селен выбирают из группы, состоящей из селенита и метилселината.