Биотрансплантат и способ лечения хронической ишемии нижних конечностей

Изобретение относится к биофармакологии, в частности, касается получения культуры генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток, миобластов и фибробластов и способа лечения хронической ишемии нижних конечностей и осложнений данного заболевания. Биотрансплантат для лечения хронической ишемии нижних конечностей содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК). В качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель. В качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации и аллотрансплантации. Биотрансплантат для лечения осложнений хронической ишемии нижних конечностей, содержащий миобласты, полученные из скелетных мышц. В качестве фетального материала используют скелетные мышцы плодов человека 1-2 триместра беременности. В качестве аутологичного и донорского материала используют мышечную ткань взрослого человека, получаемую в результате биопсии скелетных мышц. Биотрансплантат для лечения язвенно-некротических осложнений хронической ишемии нижних конечностей, содержащий суспензию фибробластов из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов. Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей заключается в проведении операции бедренно-подколенного или бедренно-тибиального аутовенозного шунтирования с одновременным введением клеточного биотрансплантата. В общую бедренную артерию вводится 100-500 млн МСК в 20 мл инфукола или физиологического раствора и внутримышечно 5-10 инъекциями (по 0,5 мл) вводится 100-500 млн МСК в 5 мл инфукола или физиологического раствора. При развитии атрофии мышц в пораженные мышцы вводится суспензия культуры миобластов. При развитии язвенно-некротических осложнений ишемии нижних конечностей дефект обкалывается суспензией, содержащей мезенхимальные стволовые клетки и фибробласты в концентрациях от 10 до 100 млн клеток в 1 мл инфукола или физиологического раствора. Изобретение обеспечивает повышение эффективности лечения за счет улучшения различных показателей кровотока. 6 н. и 6 з.п. ф-лы.

 

Изобретение касается получения культуры генетически немодифицированных мезенхимальных стволовых клеток, миобластов и фибробластов и способа лечения хронической ишемии нижних конечностей и осложнений данного заболевания.

Хронические облитерирующие заболевания артерий нижних конечностей (ХОЗАНК) являются в настоящее время одними из самых распространенных видов болезней системы кровообращения.

Основными причинами ишемии нижних конечностей является атеросклероз (около 90%), неспецифический аортоартериит, облитерирующий тромбангиит, диабетическая ангиопатия, постэмболические и травматические окклюзии. Реже встречаются врожденные заболевания: гипоплазия брюшной части аорты и наружных подвздошных артерий.

Высокий процент ампутаций, выполняемых до настоящего времени у значительной части пациентов, страдающих хронической ишемией нижних конечностей, в т.ч. пациентов трудоспособного возраста, обусловливает не только медицинскую, но также экономическую и социальную значимость проблемы. Имеющиеся в настоящее время средства лекарственной терапии при их изолированном использовании позволяют улучшить состояние пациентов только на ранних стадиях заболевания. В случаях более тяжелых форм основным методом лечения является хирургический в виде различных вариантов реконструктивных сосудистых операций.

Одним из наиболее распространенных видов подобных вмешательств является операция бедренно-подколенного или бедренно-тибиального шунтирования, выполняемая в случаях окклюзионно-стенотических поражений бедренно-подколенного или бедренно-тибиального сегментов артерий нижних конечностей. При отсутствии гемодинамически значимых поражений артерий голени результаты таких операций являются удовлетворительными как в ближайшем, так и в отдаленном послеоперационном периоде. В то же время при наличии значимого поражения тибиальных артерий (т.н. дистальных формах поражения) результаты таких операций (проходимость шунтов, сохранность конечностей и т.д.) существенно уменьшаются.

В настоящее время в лечении подобных вариантов поражения реконструктивная сосудистая хирургия достигла определенного предела.

Летальность после операций составляет 2-13%, а частота ампутаций после реконструктивных операций - 10% [De Wsese G. et al., 1972]. В сроки до 10 лет проходимость протезов сохраняется в аорто-подвздошном сегменте у 80-90% больных. Результаты внеполостных операций при данной локализации окклюзии хуже: через 3 года проходимы 60-70% бедренно-бедренных шунтов и 64% подмышечно-бедренных шунтов [Kester R. et al., 1981]. Реконструктивные операции в бедренно-подколенной зоне свидетельствуют о том, что при соблюдении основных правил определения показаний и условий операции проходимость аутовенозных трансплантатов сохраняется у 80-85% больных через 3 года после операции [Kester R. et al., 1981].

Отдаленные результаты наложения бедренно-педальных шунтов таковы: к концу 1-го года проходимы 68% шунтов, а через 2 года - 40%. Однако уже этот начальный опыт свидетельствует о перспективности данного направления.

По данным 2-го Согласительного документа (1991), при критической ишемии нижних конечностей через 1 год после аортоподвздошно-бедренного протезирования проходимы 90% протезов, после бедренно-подколенного шунтирования аутовеной - 75%, протезом - 65%. После бедренно-подколенного шунтирования ниже колена проходимы 70% аутовен и 60% протезов, после бедренно-тибиального шунтирования - 70% аутовен и 40% протезов. Это свидетельствует о нецелесообразности применения для реконструкции артерий голени и стопы даже самых качественных синтетических протезов. Результаты ангиопластики показывают, что через 2 года проходимы 85% подвздошных артерий и лишь 50% бедренных и подколенных.

Дальнейший поиск проводится в направлении возможностей улучшения состояния дистального артериального русла, уменьшения периферического сопротивления и стимулирования развития капиллярной сети голеней. Одним из возможных путей решения данной проблемы является использование клеточных и генно-инженерных технологий стимуляции ангиогенеза.

Идея клеточной трансплантации для лечения ишемии нижних конечностей (прежде всего атеросклеротического и диабетического генеза) успешно реализуется последние 5 лет - в эксперименте и 2 года - в клинике. Это стало возможным в связи с интенсивным изучением клеточных механизмов ангиогенеза и выделением клеток-предшественников сосудистого эндотелия и ангиобластов.

В эксперименте на модели локальной ишемии конечности (лигирование ветвей бедренной артерии) было предложено использовать различные клетки для неоангиогенеза в ишемизированой зоне - мононуклеары костного мозга [Shintani S, et al. 2001] и периферической крови, тромбоциты периферической крови совместно с мононуклеарами [Iba О, et al. 2002], эндотелиальные прогениторные клетки, мобилизированные в периферический кровоток [Asahara, Т, et al. 1999], гемопоэтические стволовые клетки [Yang С, et al., 2003]. Был показан ангиогенетический эффект мононуклеарных клеток костного мозга и на модели периферической диабетической ангиопатии [Hirata К, et al. 2003]. Почти во всех исследованиях производилась множественная внутримышечная трансплантация клеток. Однако недавно было показано, что однократное внутриартериальное введение клеток по эффективности сравнимо с внутримышечной трансплантацией [Yoshida M, 2003].

Задачей настоящего изобретения является создание биотрансплантата, содержащего мезенхимальные стволовые клетки, миобласты и фибробласты для лечения хронической ишемии нижних конечностей и осложнений данного заболевания.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.

Биотрансплантат для лечения хронической ишемии нижних конечностей, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют; далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

В качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.

В качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации и аллотрансплантации.

Предложен биотрансплантат для лечения осложнений хронической ишемии нижних конечностей (атрофии мышц), содержащий миобласты, полученные из скелетных мышц, и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).

В качестве фетального материала используют скелетные мышцы плодов человека 1-2 триместра беременности.

В качестве аутологичного и донорского материала используют мышечную ткань взрослого человека, получаемую в результате биопсии скелетных мышц.

Предложен биотрансплантат для лечения язвенно-некротических осложнений хронической ишемии нижних конечностей, содержащий суспензию фибробластов.

Фибробласты получают из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов.

Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей заключается в проведении операции бедренно-подколенного или бедренно-тибиального аутовенозного шунтирования с одновременным введением клеточного биотрансплантата. В общую бедренную артерию вводят 100-500 млн МСК в 20 мл инфукола или физиологического раствора и внутримышечно 5-10 инъекциями (по 0,5 мл) вводят 100-500 млн МСК в 5 мл инфукола или физиологического раствора.

При развитии атрофии мышц в пораженные мышцы вводят суспензию культуры миобластов. Осуществляется несколько инъекций в зависимости от степени поражения мышц. Внутримышечно 5-10 инъекциями (по 0,5 мл) вводится 100-500 млн миобластов в 5 мл инфукола или физиологического раствора.

При развитии язвенно-некротических осложнений ишемии нижних конечностей дефект обкалывают суспензией, содержащей мезенхимальные стволовые клетки и фибробласты в концентрациях от 10 до 100 млн клеток в 1 мл инфукола или физиологического раствора.

Эффективность данного способа лечения ишемии нижних конечностей оценивалась по следующим специализированным тестам.

Плече-локтевой индекс

Дистанция безболевой ходьбы (по результатам тред-мил теста)

Радиоизотопные исследования кровотоков и перфузии мышц нижних конечностей.

В исследование были включены 19 пациентов мужского пола с атеросклеротическим поражением терминального отдела аорты и артерий нижних конечностей, у 6 пациентов отмечались трофические язвы голени пораженной ноги. Возраст больных колебался от 39 до 58 лет.

Степень хронической ишемии нижних конечностей определяли по классификации R.Fantaine. Больных с ХИНК ПБ степени ишемии было 7, с III степенью - 8, с IV степенью - 4.

Плече-лодыжечный индекс давления (ПЛИ) до трансплантации стволовых клеток по предложенному способу составлял 0,35±0,15. Средние показатели минимальной дистанции безболевой ходьбы по ровной поверхности со скоростью 3.2 км/ч (90-100 шагов в минуту), но не более 500 метров - 52.3±41.4.

Всем пациентам проведено лечение по предложенному способу.

В раннем посттрансплантационном периоде все больные получали стандартную сосудистую терапию.

В раннем посттрансплантационном периоде у всех больных отмечалось клиническое улучшение, которое проявлялось уменьшением ишемии на одну или более степеней. После трансплантации I степень ишемии налюдалась у 11 больных, IIA - у 7, IIБ - 2. Дистанция безболевой ходьбы в среднем увеличилась на 329.19, р<0.01, плече-лодыжечный индекс давления - на 0.57, р<0.01.

За весь период наблюдения отмечалось снижение показателей ПЛИ на 0.11, р<0.05. Дистанция безболевой ходьбы увеличилась в среднем дистанции на 430 метров, р<0.01 у всех 6 пациентов, имевших трофические нарушения, после трансплантации не отмечалось язвенных деффектов.

Таким образом, трансплантация клеток по предложенному способу выявила улучшение различных показателей кровотока в ишемизированной конечности, увеличение времени безболевого периода при ходьбе, способствовала ускорению заживления язв.

1. Биотрансплантат для лечения хронической ишемии нижних конечностей, характеризующийся тем, что он содержит мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют, далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут, избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.

2. Биотрансплантат по п.1, где в качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.

3. Биотрансплантат по п.1, где в качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации.

4. Биотрансплантат по п.1, где в качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аллотрансплантации.

5. Биотрансплантат для лечения хронической ишемии нижних конечностей, характеризующийся тем, что он содержит миобласты и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).

6. Биотрансплантат по п.5, где в качестве фетального материала для получения миобластов используют скелетные мышцы плодов человека 1-2 триместра беременности.

7. Биотрансплантат по п.5, где в качестве аутологичного и донорского материала для получения миобластов используют мышечную ткань взрослого человека, получаемую в результате биопсии скелетных мышц.

8. Биотрансплантат для лечения осложнений хронической ишемии нижних конечностей, характеризующийся тем, что он содержит фибробласты человека, полученные из кожи фетусов 1-2 триместра беременности, кожи взрослого человека, полученной в результате пластических операций или биопсий, липоаспиратов.

9. Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей, заключающийся в проведении операции бедренно-подколенного или бедренно-тибиального аутовенозного шунтирования с одновременным введением клеточного биотрансплантата, где в общую бедренную артерию вводят 100-500 млн МСК в 20 мл инфукола или физиологического раствора.

10. Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей по п.9, где в мышцы голени 5-10 инъекциями (по 0,5-1 мл) вводят 100-500 млн МСК в 5 мл инфукола или физиологического раствора.

11. Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей, характеризующийся тем, что при развитии атрофии мышц в пораженные мышцы вводят суспензию культуры миобластов, где внутримышечно 5-10 инъекциями (по 0,5 мл) вводят 100-500 млн миобластов в 5 мл инфукола или физиологического раствора.

12. Способ лечения хронической ишемии нижних конечностей, характеризующийся тем, что при развитии язвенно-некротических осложнений ишемии нижних конечностей дефект обкалывают суспензией, содержащей мезенхимальные стволовые клетки и фибробласты в концентрациях от 10 до 100 млн клеток в 1 мл инфукола или физиологического раствора.