Способ определения микробиологического загрязнения водных сред и устройство для его осуществления

Группа изобретений относится к микробиологии и экологии и может быть использована для мониторинга водных бассейнов и грунтовых вод, а также бактериологического контроля водных растворов и суспензии в медицине, пищевой и других отраслях промышленности. Способ количественного определения микробиологического загрязнения воды и водных сред заключается в отборе проб исследуемой среды, ее пропускании через бактерицид формулы R₄NI_n((n-1)/2)Н₂O, доведении рН пробы до значений 5-6 и определении микробиологического загрязнения среды по концентрации йода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом. Микробиологическое загрязнение среды может быть определено как по концентрации йода в восстановленной форме J^-, так и в окисленной форме J₂. Устройство для осуществления способа содержит бактерицидный фильтр, соединенный с реакционной камерой, на выходе которой установлен регистрирующий прибор. Достигается повышение чувствительности и достоверности количественного определения микробиологического загрязнения воды и водных сред при сокращении времени определения. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 ил.

 

Область применения

Изобретение относится к микробиологии и экологии, а именно к области определения микробиологического загрязнения водных сред, и может быть использовано для мониторинга поверхностных и подземных вод, а также бактериологического контроля водных растворов и суспензий в медицине, пищевой и других отраслях промышленности.

Предшествующий уровень техники

Оценка количественного присутствия бактерий в воде и жидких водных средах, а также степень заражения являются важнейшим требованием экологической безопасности. Особенно важен контроль бактериального заражения водных сред в условиях эпидемиологических ситуаций, когда такой контроль должен осуществляться максимально быстро.

Общепринятым в настоящее время является метод контрольного рассева с последующим подсчетом образовавшихся колоний.

В качестве регистрирующего прибора для прямого количественного подсчета микробных тел в воде и водных средах используются оптические приборы, например микроскоп.

Этот метод достаточно точен, однако требует значительного времени - от 48 до 72 часов.

Существуют и другие методы контроля степени бактериального заражения, которые можно условно разделить на две большие группы.

1) Прямые методы, заключающиеся в непосредственном подсчете микробных клеток. Из прямых методов известны, в частности, такие, как прямой подсчет микробных клеток, имеющих собственную окраску (см. заявку на изобретение РФ №2000122909, МПК C 12 Q 1/04).

2) Косвенные методы, использующие те или иные специфические свойства бактерий, например электропроводность (см. заявку на изобретение РФ №2001132198, МПК C 12 Q 1/06), светорассеяние (см. патент на изобретение GB №2386946, МПК C 12 Q 1/04), способность к флюоресценции (см. патент на изобретение СА №2264272, МПК C 12 Q 1/04).

Косвенные методы более разнообразны. Так, например, известны методы, использующие цветоиндикаторы, окрашивающие продукты жизнедеятельности бактерий (см. Международная заявка № WO 0218625, МПК C 12 Q 1/04; патент США № US 6632632, МПК C 12 Q 1/04; патент США № US 2003203422, МПК C 12 Q 1/04) или использующие цветные реакции при взаимодействии бактерий с антигенами и антителами (см. Европейский патент № ЕР 1356080, МПК C 12 Q 1/04).

Для косвенного определения микробиологических загрязнений в качестве регистрирующих приборов используются приборы для измерения светорассеяния и флюоресценции.

В последнее время получили распространение так называемые "молекулярные" методы, заключающиеся в приготовлении препаратов бактерий с мечеными нуклеокислотами, которые могут быть обнаружены физическими методами (см. патент США № US 6630302, МПК C 12 Q 1/68).

Эти "молекулярные" методы достаточно точны в оценке бактериального заражения, однако даже самые быстрые из них (если не включать в рассмотрение предварительную подготовку препаратов) требуют не менее 4-х часов.

Кроме прочего, все вышеперечисленные методы требуют соблюдения стерильных условий, что труднодостижимо в полевых условиях.

Наиболее близким к предлагаемому устройству по способу регистрации микробиологических загрязнений является детектор подвижных микроорганизмов, предназначенный для контроля качества воды с использованием оптического метода, содержащий кювету для исследуемой жидкости в виде отрезка полого оптического волновода, источник оптического излучения и два или более фотоприемника (см. патент на изобретение РФ №2143487, МПК С 12 М 1/34).

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и достоверности способа количественного определения микробиологического загрязнения воды и водных сред при сокращении времени определения.

Для решения задачи, в соответствии с предложенным способом количественного определения микробиологического загрязнения воды и водных сред, проводят отбор проб исследуемой среды, которые пропускают через бактерицид формулы R₄NI_n((n-1)/2) H₂O, доводят рН пробы до значений 5-6 и определяют микробиологическое загрязнение среды по концентрации иода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом.

Указанный бактерицид известен как препарат для создания эффективных обеззараживающих средств для воды и водных растворов (патент РФ №2213063, 27.09.2003). В нем n - целое число от 3 до 9, R - органический радикал, N - азот, I - иод.

Микробиологическое загрязнение среды может быть определено как по концентрации йода в восстановленной форме J^-, так и в окисленной форме J₂.

На решение поставленной задачи направлено решение, касающееся устройства для осуществления способа, содержащее регистрирующий прибор, включающий источник оптического излучения, кювету для исследуемой среды и фотоприемник, бактерицидный фильтр с бактерицидом формулы R₄NI_n((n-1)/2)Н₂О и реакционную камеру, соединенные между собой. При этом регистрирующий прибор установлен на выходе реакционной камеры.

Реакционная камера выполнена из коррозионно-стойкого материала и имеет горловину для ввода реагентов, узел перемешивания.

Изобретение поясняется чертежом, на котором представлена блок-схема устройства, с помощью которого может быть реализован заявляемый способ.

Позициями на чертеже обозначены: 1 - бактерицидный фильтр, 2 - реакционная камера, 3 - горловина для ввода реагентов, 4 - узел перемешивания, 5 - выходной патрубок с вентилем, 6 - регистрирующий прибор.

Предлагаемый способ основан на использовании йодсодержащего бактерицида, имеющего полезное свойство выделять положительный йод-радикал "по сигналу" - при появлении в воде живых микроорганизмов, несущих избыточный электростатический заряд. Выделяющийся бактерицидом положительный йод-радикал (I^*+) взаимодействует только с электростатическим зарядом микроорганизмов, а не с функциональными группами их оболочек. Это количественное взаимодействие, положенное в основу заявляемого способа, использовано для счета микробиологических загрязнений. Данное взаимодействие поясняется следующей формулой:

где Q^*- - микробиологический объект, несущий отрицательный электростатический заряд;

R₄NI_n((n-1)/2)Н₂О - йодсодержащий бактерицид;

(Q^*I^*)⁰ - йод-радикал, присоединенный к микробиологическому объекту;

I^- - йод в восстановленной форме.

Степень микробиологического загрязнения, например бактериального заражения, определяется по количеству образовавшихся йодид-ионов (I^-) любым из известных способов: весовым, титрометрическим, колориметрическим и т.д.

Наиболее удобным является количественное колориметрическое определение йода, образующегося после перевода йодид-ионов в молекулярный йод в результате окислительной реакции в кислой среде (рН 5-6), например, по формуле

Результаты экспериментов показали, что концентрация йода пропорциональна степени микробиологического загрязнения, т.е. количеству микробных тел в единице объема.

Устройство для количественного определения микробиологического загрязнения воды и водных сред состоит из бактерицидного фильтра 1, соединенного с реакционной камерой 2, имеющей горловину 3 для ввода реагентов. Для ускорения реакции камера может быть снабжена узлом перемешивания 4. Камера имеет выходной патрубок с вентилем 5. Устройство содержит также регистрирующий прибор 6. В качестве регистрирующего прибора может быть использован фотоэлектроколориметр.

Бактерицидный фильтр 1 представляет собой емкость, в которой в качестве засыпки использован йодсодержащий бактерицид формулы R₄NI_n((n-1)/2)Н₂О. Реакционная камера 2 представляет собой корпус из стойкого к коррозии материала, например полипропилена.

Лучший вариант осуществления изобретения

Определение микробиологического загрязнения осуществляют пропуская пробу воды через бактерицидный фильтр 1, в котором йодсодержащий бактерицид количественно взаимодействует с микробиологическими объектами. Выделившиеся в раствор йодид-ионы попадают в реакционную камеру 1, где в раствор для создания среды с рН 5-6 добавляют, например, фосфатно-лимонно-кислотный буфер. Затем в образовавшийся буферный раствор добавляют окислитель, например надсерно-кислый аммоний, в результате чего происходит реакция окисления йодид-ионов до йода с изменением окраски исходного раствора. Реакция может быть ускорена перемешиванием.

При использовании колориметрического способа концентрация йода в водном растворе может быть легко пересчитана в единицы бактериального заражения (количество микробных тел в см³, м.т./см³). В качестве раствора сравнения использовалась дистиллированная или деионизированная вода.

Пример 1:

Готовили пробы стерильной воды объемом 50 см³, затем загрязняли ее бактериями E.coli в концентрациях 5000 и 10000 м.т./см³ и последовательно пропускали через бактерицидный фильтр с насыпным объемом 100 см³.

Затем рН отфильтрованных растворов доводили добавлением 10 см фосфатно-лимонно-кислотного буферного раствора до значений 5-6, а концентрацию выделившегося из бактерицида йода, пропорциональную микробиологическому заражению воды (количеству микробных тел на единицу объема), определяли весовым методом путем осаждения 0,1 Н раствором AgNO₃. Параллельно проводился контрольный опыт с пробой стерильной воды.

Результаты экспериментов представлены в таблице 1.

Таблица 1
Концентрация йода в восстановленной форме, г/дм3	Степень микробиолоического загрязнения воды, м.т./см3
0,0000	0
0,0020	5000
0,0039	10000

Корреляция между концентрацией йода и микробиологическим загрязнением воды определяется следующим эмпирическим уравнением:

,

где - концентрация йода в восстановленной форме,

C_J2 - концентрация йода в окисленной форме (молекулярный йод),

Q - количество микробных тел в единице объема, м.т./см³.

Пример 2.

Готовили пробы стерильной воды объемом 50 см³, которые загрязняли бактериями Е.Coli в концентрациях 500, 1000, 5000 и 10000 м.т./см³ и последовательно подвергали операциям, аналогичным описанным в примере 1, до получения отфильтрованного раствора с рН 5-6, содержащего йод в восстановленной форме.

Затем I^- переводился в окисленную форму I₂ стехиоиметрическим окислением надсерно-кислым аммонием (NH₄)₂S₂O₈ по реакции (2).

Концентрация I₂, пропорциональная степени микробиологического загрязнения воды, определялась колориметрически по калибровке, выраженной уравнением

Д=16C_J2,

где Д - оптическая плотность.

Результаты исследований представлены в таблицах 2 и 3

Таблица 2
Концентрация йода, г/дм3	Степень микробиологического загрязнения воды, м.т./см3
0,00,	0
0,0002	500
0,0004	1000
0,00180	5000
0,00391	10000
Таблица 3
Оптическая плотность, Д	Степень микробиологического загрязнения воды, м.т./см3
0,0000	0
0,0064	500
0,0128	1000
0,0630	5000
0,1267	10000

В результате проведенных экспериментов (см. таблицу 3) выявлено, что зависимость микробиологического загрязнения от оптической плотности может быть выражена следующим эмпирическим уравнением:

Д=127 10^-7Q

Пример 3.

Определение микробиологического загрязнения в пробе воды объемом 50 см³ из подземного источника глубиной 22 метра, расположенного на расстоянии 400 метров от реки Волга, проводили аналогично примеру 2.

Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4
Оптическая плотность, Д	Степень микробиологического загрязнения воды, м.т./см3
0,5000	37000

Промышленная применимость

Предлагаемый способ количественного определения микробиологического загрязнения водных сред очень быстр (до 30 мин), точен (до 400 м.т./см³) и не требует особой стерильности.

1. Способ определения микробиологического загрязнения водных сред, заключающийся в отборе проб исследуемой среды, ее пропускании через бактерицид формулы R₄NI_n((n-1)/2)Н₂О, доведении рН пробы до значений 5-6 и определение микробиологического загрязнения среды по концентрации йода, выделившегося после взаимодействия пробы с бактерицидом.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микробиологическое загрязнение среды определяют по концентрации йода в восстановленной форме J^-.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что микробиологическое загрязнение среды определяют по концентрации йода в окисленной форме J₂.

4. Устройство для осуществления способа, содержащее регистрирующий прибор, отличающееся тем, что он дополнительно содержит бактерицидный фильтр с бактерицидом формулы R₄NI_n((n-1)/2)Н₂О и реакционную камеру, соединенные между собой, при этом регистрирующий прибор установлен на выходе реакционной камеры.

5. Устройство по п.4, отличающееся тем, что реакционная камера выполнена из коррозионно-стойкого материала и имеет горловину для ввода реагентов, узел перемешивания, выходной патрубок.