Способ получения препарата, содержащего комплекс белков теплового шока 70,90,96, ассоциированных с антигенными пептидами

Изобретение относится к биофармакологии, препаративной биохимии и медицине. Способ включает гомогенизирование ткани млекопитающего, центрифугирование, к супернатанту, содержащему комплекс белков теплового шока (БТШ), добавляют сульфат аммония до 35-65% насыщения, образовавшийся осадок растворяют в фосфатном буфере рН 7,2, проводят хроматографию на колонке с сефадексом G-50, затем полученную белковую фракцию хроматографируют на гепарин-сефарозе, фракции, содержащие БТШ 70, 90, 96, содержание которых обнаруживали с помощью соответствующих антител, объединяют, концентрируют и обессоливают с помощью ультрафильтрации. Изобретение обеспечивает упрощение и сокращение времени проведения способа без использования дорогостоящего оборудования, полученные комплексы возможно использовать в иммунотерапии онкологических заболеваний. 1 табл., 2 ил.

 

Изобретение относится к области биофармакологии, препаративной биохимии, медицины и может быть использовано для выделения белков теплового шока, ассоциированных с антигенными пептидами.

Уровень техники

Известно, что опухоли содержат антигены, способные вызывать иммунный ответ в организме [1]. Антигены некоторых (немногих) опухолей животных и человека выделены и охарактеризованы [2]. Опухолевые антигены, используемые для иммунизации, способны вызвать противоопухолевый иммунный ответ, который является специфичным - именно к той опухоли, антигенами которой проведена иммунизация, что связано со специфическим антигенным составом каждой индивидуальной опухоли [3]. Это объясняется как генетическими различиями белков разных индивидуумов, так и разнообразием мутаций, произошедших при опухолевой трансформации клетки. Выделение и идентификация антигенов определенной опухоли для специфического иммунного ответа представляет собой самостоятельную и сложную задачу. Такую задачу на современном уровне невозможно решать в рамках лечения конкретного больного. Однако возможен другой подход, позволяющий решить данную проблему. Индуцируемые в условиях стресса белки (стресс-белки), или белки теплового шока (БТШ), или шапероны синтезируются в опухолевой ткани в большем количестве по сравнению с нормальными тканями. Было показано, что БТШ опухолевой ткани нековалентно связывают пептидные антигены этой ткани [3]. Таким образом, становится не обязательным для индукции специфического иммунного ответа выделять и идентифицировать антигены определенной опухоли, достаточно выделить из опухолевой ткани БТШ, ассоциированные с антигенами этой ткани. Следует подчеркнуть, что БТШ, благодаря взаимодействию со специфическими рецепторами, стимулируют именно Т-клеточный иммунитет, что особенно важно для противоопухолевого иммунитета [4, 5]. Можно заключить, что работа в этой области представляется достаточно обоснованной и перспективной. Такие, ассоциированные с антигенными пептидами, белки выделены из ткани опухоли, и получены положительные результаты регрессии опухолей при введении такой аутологичной вакцины. Это относится к семействам белков БТШ70, БТШ90, БТШ96 и др. [5, 6, 7]. Обнаружено, что определенные БТШ образуют комплексы с определенными белками и пептидами, т.е., вероятно, что антигены, связывающиеся с БТШ70, не связываются с БТШ96. Кроме того, активность одного БТШ в отношении связывания определенных белков увеличивается в присутствии другого БТШ [6, 7].

Из уровня техники известны работы по методам выделения БТШ-пептидных комплексов. Одним из них (United States Patent 5997837. Srivastava, December 7, 1999) защищен метод получения БТШ70-пептидных комплексов из опухолевых клеток млекопитающих или из клеток, инфицированных вирусами, бактериями или другими инфекционными агентами в отсутствие АТФ. Отметим, что выделение одного индивидуального БТШ является недостатком данного патента, исходя из поставленной задачи использования экзогенного введения данного белка для повышения специфического противоопухолевого иммунного ответа. Это уменьшает разнообразие антигенов, участвующих в иммунном ответе организма, что следует из сказанного выше о специфичности образования комплексов БТШ-антигенный пептид. Метод выделения БТШ70-пептидных комплексов из опухолевых клеток млекопитающих, предложенный автором, включает следующие стадии: гомогенизирование ткани, центрифугирование при 1000000g, хроматографию на колонке с конканавалин-А сефарозой (ConA сефароза), с которой выделяемые БТШ70-пептидные комплексы не связываются. Этот не связавшийся материал подвергается диализу и далее хроматографии с использованием MONOQ и FPLC системы. На завершающем этапе материал высаливается (50-70% насыщения сульфатом аммония (NH₄)₂SO₄). Перед использованием полученных БТШ70-пептидных комплексов они должны быть каким-либо способом переведены в раствор, пригодный для иммунизации. Достоинством предложенного метода является возможность получения гомогенных БТШ70-пептидных комплексов, что исключает риск введения реципиенту трансформирующих или иммуносупрессорных агентов, таких как трансформированная ДНК или трансформирующий фактор роста β.

Другой патент - United States Patent: 5750119 "Immunotherapeutic stress protein-peptide complexes against cancer", Srivastava, May 12, 1998, в котором описан способ выделения БТШ70-, БТШ90- и БТШ96-пептидных комплексов. Выделение включает разрушение клеток путем воздействия ультразвуком и (или) механического гомогенизирования в лизирующем буфере: 5 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,0, с 150 мМ NaCl, 2 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂, 1 мМ PMSF(фенилметансульфонилфторид). Лизат центрифугировали при 1000g 10 мин, и полученный супернатант снова центрифугировали при 100000g 90 мин. Надосадочную жидкость смешивали с ConA сефарозой, перемешивали с сорбентом 2-3 ч, не связавшийся с сорбентом материал отделяли фильтрованием и подвергали диализу против буфера (10 мМ трис-ацетат, рН 7,5, с 20 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА-этилендиаминтетрауксусной кислотой, 15 мМ 2-меркаптоэтанолом), необходимого для хроматографии с использованием MONOQ и FPLC системы. БТШ70-пептидные комплексы элюировали при 20-500 мМ концентрации NaCl в том же буфере. Собранные иммунореактивные (с антителами к БТШ70) фракции высаливали при 50-70% насыщении (NH₄)₂SO₄, центрифугировали при 17000 об. в мин, освобождали от (NH₄)₂SO₄ на колонке с сефадексом G25.

Выделение БТШ90-пептидных комплексов было аналогичным, только при хроматографии с использованием MONOQ и FPLC системы БТШ90-пептидные комплексы элюировали при 200-600 мМ концентрации NaCl.

Выделение БТШ96-пептидных комплексов было аналогичным до стадии хроматографии на ConA сефарозе. БТШ96-пептидные комплексы сорбировались на ConA сефарозе, сорбентом наполняли колонку, промывали ее лизирующим буфером, выдерживали с 10% α-метилманнозидом и элюировали БТШ96-пептидные комплексы α-метилманнозидом. Далее материал подвергали хроматографии с использованием MONOQ и FPLC системы. БТШ96-пептидные комплексы элюировали при 400-550 мМ концентрации NaCl. Данный патент принят в качестве прототипа.

Такой способ обеспечивают получение гомогенных БТШ70-, БТШ90- и БТШ96-пептидных комплексов, что выявлено посредством соответствующих аналитических методов: электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и иммуноблоттинга. Однако способ - прототип является трудоемким за счет многостадийности выделения БТШ, а также включает использование дорогостоящего оборудования и реактивов.

Технический результат, который достигается заявленным способом, представляет собой достаточно быстрое (сопоставимое со временем лечения больного), включающее минимально возможное количество стадий, без использования дорогостоящего оборудования и реактивов выделение БТШ70-, БТШ90- и БТШ96-пептидных комплексов.

БТШ70-, БТШ90- и БТШ96-пептидные комплексы, полученные заявленным способом, возможно использовать в иммунотерапии онкологических заболеваний.

Раскрытие изобретения

Выделение БТШ70-, БТШ90- и БТШ96-пептидных комплексов включает: гомогенизирование ткани, центрифугирование гомогената, высаливание при 35-65% насыщении (NH₄)₂SO₄ с последующим центрифугированием или фильтрованием, обессоливание на колонке с сефадексом G50, хроматографию на колонке с гепарин-сефарозой, концентрирование и обессоливание препарата ультрафильтрацией.

Заявляемый нами способ выделения БТШ 70-, БТШ 90- и БТШ 96-пептидных комплексов позволяет выделять БТШ 70-, БТШ 90- и БТШ 96-пептидные комплексы в единой процедуре.

Пример осуществления изобретения

Фрагмент опухолевой ткани грудной железы больного массой 1 г был гомогенизирован с помощью диспергатора Miccra D-1 "Roth" с насадкой DS-8/P (МашХим Консалт) в 4 мл буфера (10 мМ NaHCO₃, рН 7,0, с 2 мМ ЭДТА и 2 мМ PMSF) при 4°С. Гомогенат центрифугировали при 35000g и 4°С в течение 25 мин, надосадок собирали и БТШ-пептидные комплексы осаждали высаливанием (NH₄)₂SO₄. Собирали осадок (центрифугированием или фильтрованием), образующийся при 35-65% насыщении (NH₄)₂SO₄, и растворяли его в фосфатном буфере (10 мМ фосфат натрия; 2 мМ MgCl₂; 0,5 мМ дитиотреитол; рН 7,2). Далее проводили хроматографию растворенного осадка на колонке с сефадексом G 50 fine, уравновешенную тем же буфером. При этом отделяли белковую фракцию от материала, молекулярная масса которого менее 50 кДа и переводили ее в буфер, необходимый для аффинной хроматографии на гепарин-сефарозе (гепарин-сефароза 6 Fast Flow, "Amersham Biosciences"). Белковую фракцию, полученную после хроматографии на колонке с сефадексом G 50 fine, вносили в колонку с гепарин-сефарозой. Далее последовательно промывали колонку: фосфатным буфером, рН 7,2, с 2 мМ MgCl₂, 0,5 мМ дитиотреитолом; тем же буфером с 0,05 М NaCl и 0,05-0,7 М NaCl на том же буфере. Объединяли фракции, элюирующиеся фосфатным буфером, рН 7,2, с 2 мМ MgCl₂, 0,5 мМ дитиотреитолом, 0,05М NaCl (содержат БТШ70- и БТШ90-пептидные комплексы) и элюирующиеся при 0,4-0,7 М концентрации NaCl, которые содержат БТШ96. Объединенные фракции концентрировали и обессоливали с помощью ультрафильтрации. Обнаружение БТШ70, БТШ90 и БТШ96 в гомогенате и фракциях после каждой стадии выделения проводили с помощью соответствующих антител методом дот-блота. Относительное содержание каждого БТШ определяли с помощью соответствующих антител путем последовательных разведений, принимая за единицу максимальное разведение, при котором еще определяется соответствующий БТШ, методом дот-блота. Степень очистки БТШ70, БТШ90 и БТШ96 во фракциях и конечном продукте анализировали методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях - в присутствии додецилсульфата Na (Ds-Na-ПААГ). Для доказательства соответствия белковых полос выделяемым БТШ проводили иммуноблоттинг. Количество белка оценивали спектрофотометрически.

Из 1 г опухолевой ткани грудной железы получено 2,59 мг очищенных БТШ. Как видно на Фиг.1, выделенные белки обладают достаточной степенью чистоты (5 дорожка): примесные белки не выявляются при электрофорезе в Ds-Na-ПААГ при внесении в лунку 7 мкг белка и окраске серебром. Основные полоски принадлежат БТШ70, БТШ90 иБТШ96, о чем свидетельствует реакция с соответствующими антителами при иммуноблоттинге (Фиг.2). Минорная полоса, с молекулярной массой менее 66 кДа, принадлежит пептидным дериватам БТШ70 и БТШ90 (выявляется и при иммуноблоттинге), т.е. также не является примесью.

Полученный препарат БТШ исследовали на наличие цитотоксической и пролиферативной активности с использованием клеточных линий: НГУК1 (невринома Гассерова узла крысы. Институт морфологии человека и животных, РАМН), MCF7 (аденокарцинома молочной железы человека. Институт цитологии, РАН, СПб), Hela-Gal (эпителиальная карцинома шейки матки человека. Национальный Институт Здоровья, Бетесда, США), К-562 (суспензионная культура клеток эритромиелолейкозной линии человека) и ФЭЧ (эмбриональные фибробласты человека. Институт Полиомиелита, РАМН). Клетки культивировали в 48-луночных планшетах при 37°С в атмосфере 5% CO₂, в среде RPMI1640 (НГУК и К-562), ДМЕМ (Hela-Gal), Игла-МЕМ (MCF7 и ФЭЧ), с 2 мМ L-глутамином и 10% эмбриональной телячьей сыворотки, рН 7,4, в присутствии антибиотиков (пенициллин и стрептомицин). Клетки культивировали до состояния плотного монослоя (24-48 часов). Определение цитотоксической активности препарата БТШ проводили, добавляя к клеткам 0,5-40 мкг препарата БТШ. Через 24\48 часов определяли цитотоксичность препарата, используя МТТ-тест. Выживаемость клеток оценивали в процентах от соответствующего контроля (выживаемость в питательной среде без исследуемого препарата БТШ). Как следует из данных табл.1, препарат БТШ не обладает цитотоксической активностью, не обладает он также и пролиферативной активностью (табл.1). Тест на стимуляцию пролиферации проводили, добавляя к клеткам через 20 часов инкубации с препаратом БТШ раствор С¹⁴-тимидина (удельная радиоактивность 56 мКи/мМ), содержащий 1 мКи меченого тимидина. Время мечения составляло 5 часов. Сравнивали включение меченого тимидина в опытных (с препаратом БТШ) и контрольных пробах. Результаты выражали в имп/мин на 10⁶ клеток и в % к контролю. Подобные результаты были получены со всеми используемыми клеточными культурами.

Таким образом, заявленный способ позволяет получать комплекс белков теплового шока 70,90 и 96 с антигенными пептидами высокой чистоты и минимально возможными затратами.

Табл. 1. Определение цитотоксической активности белкового препарата, содержащего комплекс БТШ, и влияние этого препарата на синтез ДНК при инкубации в течение 24-х часов с клетками К-562.
№	мкг белка в лунке (0.3 мл среды)	Число живых клеток, % к контролю	Включение С14-тимидина, % к контролю*)
1	1,5	98	100
2	3,0	102	114
3	7,5	102	104
*) Включение С14-тимидина в контроле равно 10290 имп/мин на 106 клеток.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kenneth O. Lloid K.O. Tumor antigens known to be immunogenic in man. In: Specific immunotherapy of cancer with vaccines, Ann. of the New York, Academy of Sciences, New York 1993, V.690, pp.50-58. Ed. J-C.Bystrin, S.Ferrone, Ph.Livingston.

2. Real F.X., Mattes M.J., Houghton A.N., Oettgen H.F., Lloid K.O., Old L.J. Classi (unique) tumor antigens of human melanoma. Identification of a 90000 dalton cell surface glycoprotein by autologous antibody. J. Exp.Med. 1984, V.160, pp.1219-1233.

3. Heike M., Weinmann A., Bethke K., Galle P.R. Stress protein/peptide complexes derived from autologous tumor tissue as tumor vaccines. Biochem. Pharmacology, 1999, Vol.58, pp.1381-1387.

4.Suto R., Srivastava P.K. A mechanism for the specific immunogenicity of heat shock protein-chaperoned peptides. Science, 1995. Vol.269, pp.1585-1588.

5. Janetzki S., Blachere N.E., Srivastava P.K. Generation of tumor-specific cytotoxic Т lymphocytes and memori Т cells by immunization with tumor-derived heat shock protein gp96. J.Immunother. 1998, Vol.4, pp.269-277.

6. Meng Song-Dong, Song J., Rao Z., Tien P., Gao G.F. Three-step purification of gp96 from human liver tumor tissues suitable for isolation of gp96-bound peptides. J. of Immunol. Methods, 2002, Vol.264, pp.29-35.

7. Venoret A., Bell G. Purification of multiple heat shock proteins from a single tumor sample. J. of Immunol. Methods, 2000. Vol. 237, pp.119-130.

8. United States Patent №5997837.

9. United States Patent №5750119.

Краткое описание чертежей

Фиг.1.

Электрофореграмма белков фракций: после гомогенизирования (дорожка 1), хроматографического разделения на сефадексе G50 fine (дорожка 2), гепарин-сефарозе (дорожки 3-4) и объединенной фракции после хроматографии на гепарин-сефарозе, переведенной в физиологический раствор и сконцентрированной (дорожка 5). Положение белковых полос оценивали относительно маркера молекулярной массы («Amersham Biosciences», Великобритания) (дорожка 6). Электрофорез в Ds-Na ПААГ: 9% разделяющий гель, 3% формирующий гель, окраска серебром.

Фиг.2.

Исследование содержания полноразмерных форм БТШ70 (дорожка 1), БТШ90 (дорожка 2) и БТШ96 (дорожка 3) в объединенной и сконцентрированной фракции на конечном этапе выделения БТШ.

Электрофорез в Ds-Na ПААГ: 9% разделяющий гель, 3% формирующий гель, детекция с помощью «ТМБ-блот».

Способ получения препарата, содержащего комплекс белков теплового шока (БТШ) 70, 90 и 96, ассоциированных с антигенными пептидами, включающий взятие ткани из организма млекопитающего, гомогенизирование ее, центрифугирование и отделение супернатанта, содержащего БТШ, отличающийся тем, что к супернатанту добавляют сульфат аммония до 35-65% насыщения, отделяют образовавшийся осадок, растворяют его в фосфатном буфере, рН 7,2, проводят хроматографию на колонке с сефадексом G50, уравновешенную тем же буфером, собирают белковую фракцию и проводят хроматографию на колонке с гепарин-сефарозой, собирают фракции, содержащие БТШ 70, 90 и 96, объединяют их и полученный комплекс белков концентрируют и обессоливают путем ультрафильтрации.