Антимикробное средство и фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антимикробного средства

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ из тканей животных и человека. Сущность изобретения: получено антимикробное средство из тромбоцитов свиньи и крупного рогатого скота с молекулярным весом 0,5-15 кДа, полученное путем замораживания и размораживания тромбоцитарной массы при температуре - 15-(-20)°С в течение 24 часов, центрифугирования при 1000 g, фильтрации супернатанта через диализные мембраны 15000 и 500 и элюции концентрата, содержащего пептиды, линейным градиентом ацетонитрила с Сефадекса G-50. Изобретение обеспечивает синергидное антимикробное действие пептидов, входящих в средство. 3 н. и 5 з.п.ф-лы, 6 табл.

 

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к получению биологически активных веществ из тканей животных и человека, и может быть использовано для создания и применения новых средств, обладающих антимикробной активностью.

Рост инфекций, вызванных микроорганизмами, проявляющими устойчивость ко многим антимикробным препаратам [1, 2], диктует необходимость расширения арсенала лекарственных средств, обладающих микробицидным действием [3]. В качестве бактерицидных препаратов в настоящее время в основном применяются синтетические и полусинтетические антибиотики (фторхинолоны, аминогликозиды и др.), к которым у большинства микроорганизмов быстро формируется устойчивость [4]. Кроме того, данные препараты обладают токсическим действием на органы и системы организма человека и животных [5], способствуют развитию дисбактериозов и т.д. [5, 6].

Цель изобретения - создание нового антимикробного средства и фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество антимикробного средства.

Известно, что выраженным антимикробным действием обладают катионные пептиды, выделенные из тканей животных и человека [7].

Известно использование антимикробных пептидов, выделенных из нейтрофилов человека [8], крупного рогатого скота [9] и мыши [10], для лечения и профилактики инфекционных заболеваний.

Известно, что кроме нейтрофилов в противоинфекционной защите макроорганизма определенное значение имеют тромбоциты, поскольку: а) тромбоциты адгезируются на патогенных микроорганизмах; б) обладают бактерицидным, противогрибковым и антипротозойным действием in vitro; в) при взаимодействии с микроорганизмами in vitro тромбоциты высвобождают низкомолекулярные бактерицидные белки [11].

Известно использование пептидов, выделенных из тромбоцитов кролика, и их производных для лечения инфекционных заболеваний [12].

Известно, что в тромбоцитах человека содержатся пептиды, обладающие антимикробной активностью [13, 14, 15, 16].

Кроме того, в тромбоцитах обнаружены фосфолипаза А2 и лизоцим [11], которые также обладают антимикробной активностью [17, 18].

Известно синергидное антимикробное действие пептидов, выделенных из нейтрофилов [19].

Известно синергидное антимикробное действие тромбоцитарного фактора-4 и соединительно-тканевого активирующего пептида-3 [20].

Известно, что минимальная молекулярная масса пептидов, содержащихся в тромбоцитах и обладающих антимикробным действием, составляет 0,5 кДа [13].

Известно, что максимальной молекулярной массой обладают следующие антимикробные пептиды, содержащиеся в тромбоцитах: фосфолипаза А2 (молекулярная масса 13,9-14,1 кДа) [17, 21] и лизоцим (молекулярная масса 14,7 кДа) [21].

Авторами экспериментально установлено синергидное антимикробное действие пептидов, выделенных из тромбоцитов человека.

Проводился следующий эксперимент. Смесь антимикробных пептидов из тромбоцитов человека получали следующим образом. 50 мл тромбоцитарной массы, полученной от здоровых доноров, ресуспендировали в 300 мл ледяной (70%) уксусной кислоты и инкубировали при -15° - (-20°)С в течение 24 часов. После инкубации суспензию тромбоцитов разморозили и подвергли центрифугированию при 1000 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученные супернатанты последовательно профильтровали через диализные мембраны Spectra/Por Biotech Regenerated Cellulose Dialysis Membrane MWCO 15000 (задерживающие продукты с молекулярной массой свыше 15000 дальтон) и Spectra/Por Biotech Cellulose Ester MWCO 500 (пропускающие продукты и соли с молекулярной массой менее 500 дальтон). Концентрат ультрафильтрата нанесли на колонку размером 10×250 мм с Сефадексом G-50. Элюцию провели линейным градиентом ацетонитрила (от 0% до 60%) с добавлением 0,1% раствора трифосфорной кислоты. Полученные пептидные фракции собрали, объединили, определили общее содержание белка известным методом [22], которое составило 500 мкг/мл, и лиофилизировали. В качестве препаратов сравнения использовали лизоцим (Calbiochem, USA) и тромбоцитарный катионный белок (ТКБ), полученный из тромбоцитов человека по методу [16].

Активность заявляемого антимикробного средства и препаратов сравнения по отношению к различным видам микроорганизмов тестировали следующим образом.

Суточные агаровые культуры микроорганизмов смывали физиологическим раствором и готовили микробные взвеси, содержащие 10⁴ КОЕ/мл. Тестируемые препараты (заявляемое антимикробное средство, лизоцим и ТКБ) растворяли в физиологическом растворе из расчета 10 мкг/мл, после чего готовили серийные разведения каждого препарата.

К 0,1 мл взвеси тестируемого штамма микроорганизмов добавляли 0,9 мл разведения антимикробного препарата (в контрольные пробы вместо разведения антимикробного препарата добавляли 0,9 мл физиологического раствора). Полученную смесь инкубировали в течение 40-60 минут при 37°С. После инкубации из опытных и контрольных пробирок высевали по 0,2 мл на чашки Петри с 5% кровяным агаром. Посевы инкубировали 24 часа при 37°С. После инкубации подсчитывали количество выросших колоний на опытных и контрольных чашках. За минимальную бактерицидную концентрацию антимикробного препарата принимали концентрацию, подавляющую 50% колоний бактерий по сравнению с контролем.

Результаты сравнительного определения антимикробной активности различных препаратов представлены в таблице 1.

Таблица 1. Сравнительная характеристика чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (мкг/мл).
Вид микроорганизмов	лизоцим	ТКБ	Заявляемое антимикробное средство
Е.coli К12	>500,0	200,0	100,0
S.aureus 209P	>100,0	50,0	10,0
B.cereus 569	50,0	20,0	0,5

Как видно из таблицы 1, смесь пептидов из тромбоцитов человека обладает более выраженным антимикробным действием по сравнению с аналогами за счет синергидного антимикробного действия различных пептидов. Таким образом, заявляемое антимикробное средство является более эффективным при проявлении антимикробного действия по сравнению с аналогами.

Известно наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах кролика [12, 23].

Авторами впервые установлено наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах крупного рогатого скота. Из свежей цитратной бычьей крови фракционным центрифугированием была получена тромбоцитарная масса, которую 3-4 раза отмыли средой 199. Полученную тромбоцитарную массу ресуспендировали в 5 объемах ледяной уксусной кислоты и заморозили на 24 часа при температуре -15°С. Через 24 часа суспензию тромбоцитов разморозили и подвергли центрифугированию при 1000 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученный супернатант протестировали на содержание белка известным методом [22] и антимикробную активность по отношению к E.coli K12, S.aureus 209P, B.cereus 569 по вышеописанной методике. Было установлено, что кислотный экстракт тромбоцитов крупного рогатого скота обладал бактерицидным действием (МБК50) по отношению к E.coli K12 в концентрации 35 мкг/мл, S.aureus 209P - 5 мкг/мл, B.cereus 569 - 0,5 мкг/мл.

Авторами впервые установлено наличие пептидов, обладающих антимикробной активностью, в тромбоцитах свиньи. Из свежей цитратной свиной крови фракционным центрифугированием была получена тромбоцитарная масса, которую 3-4 раза отмыли средой 199. Полученную тромбоцитарную массу ресуспендировали в 5 объемах ледяной уксусной кислоты и заморозили на 24 часа при температуре (-15°)С. Через 24 часа суспензию тромбоцитов разморозили и подвергли центрифугированию при 1000 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученный супернатант протестировали на содержание белка известным методом [22] и антимикробную активность по отношению к E.coli K12, S.aureus 209P, B.cereus 569 по вышеописанной методике. Было установлено, что кислотный экстракт тромбоцитов свиньи обладал бактерицидным действием (МБК50) по отношению к E.coli K12 в концентрации 100 мкг/мл, S.aureus 209P - 30 мкг/мл, B.cereus 569 - 5 мкг/мл.

Антимикробное средство из тромбоцитов получают следующим образом:

- свежую кровь собирают в пластиковые контейнеры, добавляют 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9 частей крови:1 часть 3,8% раствора цитрата натрия;

- получают обогащенный тромбоцитами супернатант путем центрифугирования крови при комнатной температуре при 250 g в течение 30 минут;

- из супернатанта центрифугированием при 1000 g в течение 30 минут осаждают тромбоциты;

- полученную тромбоцитарную массу 3-4 раза отмывают средой 199;

- отмытую тромбоцитарную массу ресуспендируют в 5-6 объемах ледяной (70%) уксусной кислоты и инкубируют при -15° - (-20°)С в течение 18-24 часов;

- после инкубации суспензию тромбоцитов размораживают и центрифугируют при 1000 g в течение 30 минут при комнатной температуре;

- полученные супернатанты подвергают последовательной ультрафильтрации через диализные мембраны (например Spectra/Por), задерживающие продукты с молекулярной массой свыше 15000 дальтон и пропускающие продукты и соли с молекулярной массой менее 500 дальтон;

- концентрат ультрафильтрата наносят на колонку размером 10×250 мм с Сефадексом (например, G-25 или G-50). Элюцию проводят линейным градиентом ацетонитрила (от 0% до 60%) с добавлением 0,1% раствора трифосфорной кислоты;

- пептидные фракции собирают, объединяют, определяют содержание белка по Лоури [22] и лиофилизируют.

Средство настоящего изобретения будет вводиться в количестве, являющемся эффективным. Термин "эффективное количество" означает количество, способное предотвратить либо уменьшить тяжесть или развитие состояния или симптома, подвергающегося лечению. Для специалиста в данной области будет очевидно, что эффективное количество антимикробного средства будет зависеть помимо всего прочего от заболевания, дозировки, схемы введения, от того, вводят ли средство настоящего изобретения отдельно или в сочетании с другими лекарственными средствами, от времени полужизни композиции в сыворотке и общего состояния здоровья пациента.

Средство по настоящему изобретению предпочтительно вводят в композицию, включающую в себя фармацевтически приемлемый носитель. Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает носитель, который не вызывает каких-либо неблагоприятных эффектов у пациентов, которым его вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны в данной области.

Средства по настоящему изобретению могут быть включены в состав фармацевтических композиций в соответствии с хорошо известными методиками. Смотри, например, подходящие составы, описанные в Remington's Pharmaceutical Science E.W.Martin. Фармацевтическая композиция заявляемого средства может быть составлена в виде множества форм, включая жидкую, гелеобразную, лиофилизированную или любую другую подходящую форму. Предпочтительная форма будет зависеть от конкретного симптома, подвергающегося лечению, и будет очевидна для специалиста в данной области.

Фармацевтическая композиция антимикробного средства может быть введена перорально, в виде аэрозоля, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно или подкожно, или любым другим приемлемым способом. Предпочтительный способ введения будет зависеть от конкретного симптома, подвергающегося лечению, и будет очевиден для специалиста в данной области. Фармацевтическая композиция антимикробного средства может быть введена в сочетании с другими лекарственными средствами. Данные средства могут быть включены в виде части той же самой фармацевтической композиции или могут быть введены отдельно от антимикробного средства либо одновременно, либо в соответствии с любой другой приемлемой схемой лечения. К тому же фармацевтическая композиция антимикробного средства может быть применена в качестве дополнения к другим курсам лечения.

Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антимикробного средства, может дополнительно содержать одно или более антимикробное соединение для усиления антимикробного эффекта. Добавляемое антимикробное соединение, как правило, зависит от вида микроорганизмов, их типовой чувствительности к антимикробным соединениям, что определяется общепринятыми методами и очевидно для специалиста в данной области.

Примеры основных классов антибиотиков для применения в составе фармацевтической композиции включают аминогликозиды (например, тобрамицин), пенициллины (например, пиперациллин), цефалоспорины (например, цефтазидим), фторхинолоны (например, ципрофлоксацин), карбапенемы (например, имипенем), тетрациклины и макролиды (например, эритромицин и кларитромицин).

Антибиотик, добавляемый в фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество антимикробного средства, для усиления антимикробного действия, выбирается в зависимости от чувствительности микроорганизмов к данному антибиотику, которая определяется общепринятыми методами. При этом добавляемый антибиотик помимо описанных выше включает аминогликозиды (амикацин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, стрептомицин, азитромицин, кларитромицин, эритромицин), бета-лактамы или пенициллины (например, пенициллин V, пенициллин G, метициллин, оксациллин, амипициллин, амоксициллин, тикарциллин, карбенициллин, азлоциллин, пиперациллин), цефалоспорины (например, цефалотин, цефазолин, цефаклор, цефамандол, цефуроксим, цефоницид, цефметазол, цефотетан, цефпрозил, лоракарбеф, цефетамет, цефоперазон, цефотаксим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефепим, цефиксим, цефподоксим, цефсулодин). Другие классы антибиотиков включают карбапенемы (например, имипенем), монобактамы (например, азтреонам), хинолоны (например, флероксацин, налидиксовая кислота, норфлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, эноксацин, ломефлоксацин, циноксацин), тетрациклины (например, доксициклин, миноциклин, тетрациклин) и гликопептиды (например, ванкомицин, тейкопланин). Другие антибиотики включают хлорамфеникол, клиндамицин, сульфометоксазол, триметоприм, нитрофуран, рифампицин.

Фармацевтические готовые формы антимикробного средства могут быть выполнены в форме для орального или парэнтерального назначения для терапии или профилактики инфекционных заболеваний.

Средство (одно или в комбинации с одним или более антимикробными соединениями) смешивают с обычными фармацевтическими носителями и эксципиентами и используют в форме таблеток, капсул, свечей, мазей, растворов для инъекций и т.д. Вид носителя зависит от предполагаемого применения. Композиции, включающие средства настоящего изобретения, содержат эффективное количество активного ингредиента, которое зависит от многих факторов, включая чувствительность к антимикробному средству инфекционных агентов, и определяется известными методами [24, 25, 26].

Средства настоящего изобретения могут применяться орально, парэнтерально (включая подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутриягодичные инъекции или вливания), путем ингаляционного распыления, ректально, местно накожно.

Такие фармацевтические композиции могут выпускаться в виде орально применяемых суспензий, таблеток или капсул; спреев; стерильных препаратов для инъекций, например, в виде водных суспензий или лиофилизированных порошков для последующего приготовления растворов; свечей; присыпок; бактерицидных салфеток.

Для орального применения в виде суспензий композиции готовят согласно методам, известным в области приготовления фармацевтических рецептур, и они могут содержать микрокристаллическую целлюлозу для обеспечения массы, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспензирующего агента, метилцеллюлозу в качестве усилителя вязкости и подслащивающие агенты и/или отдушки, известные в этой области. В виде таблеток или капсул такие композиции могут содержать микрокристаллическую целлюлозу, кальций фосфат, лактозу и/или другие эксципиенты, связующие вещества, расширители, дезинтеграторы, разбавители и смазывающие вещества, известные в данной области.

При применении в виде спреев или аэрозолей такие композиции готовят методами, хорошо известными в области фармацевтических процедур, и они могут выпускаться в виде растворов на физиологическом растворе, с использованием бензойной кислоты или других подходящих консервантов, промоторов адсорбции для усиления биоприменимости, и/или других солюбилизирующих или диспергирующих агентов, известных в данной области.

Растворы или суспензии для инъекций могут формироваться согласно известным методам с использованием нетоксичных, парэнтерально применимых разбавителей или растворителей, таких как маннитол, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия и т.д.

При ректальном применении в виде свечей такие композиции могут готовиться путем смешивания активных ингредиентов с таким нераздражающим эксцепиентом как масло какао, синтетические глицеридные сложные эфиры или полиэтиленгликоли, которые являются твердыми веществами при обычных температурах, но сжижаются и/или растворяются в ректальной полости с выделением активных ингредиентов.

При наружном применении в виде присыпок такие композиции готовятся путем смешивания активных ингредиентов с инертными носителями, известными специалисту в данной области, такими как окись алюминия, карбонат кальция, гидрокарбонат натрия и т.д. Бактерицидные салфетки готовятся путем пропитывания соответствующих бумажных и/или ватно-марлевых носителей раствором или суспензией активных ингредиентов.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Получение антимикробного средства из тромбоцитов крупного рогатого скота.

Из 1000 мл свежей нитратной бычьей крови путем центрифугирования крови при комнатной температуре при 250 g в течение 30 минут получили обогащенный тромбоцитами супернатант. Тромбоциты осадили центрифугированием при 1000 g в течение 30 минут. 50 мл полученной тромбоцитарной массы 4 раза отмыли средой 199, после чего ресуспендировали в 300 мл ледяной (70%) уксусной кислоты и инкубировали при -15° - (-20°)С в течение 24 часов. После инкубации суспензию тромбоцитов разморозили и подвергли центрифугированию при 1000 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученные супернатанты последовательно профильтровали через диализные мембраны Spectra/Por Biotech Regenerated Cellulose Dialysis Membrane MWCO 15000 (задерживающие продукты с молекулярной массой свыше 15000 дальтон) и Spectra/Por Biotech Cellulose Ester MWCO 500 (пропускающие продукты и соли с молекулярной массой менее 500 дальтон). Концентрат ультрафильтрата нанесли на колонку размером 10×250 мм с Сефадексом G-50. Элюцию провели линейным градиентом ацетонитрила (от 0% до 60%) с добавлением 0,1% раствора трифосфорной кислоты. Полученные пептидные фракции собрали, объединили, определили общее содержание белка, которое составило 260 мкг/мл, и лиофилизировали.

Пример 2. Определение активности антимикробного средства, выделенного из тромбоцитов крупного рогатого скота.

Активность антимикробного средства, полученного согласно примеру 1, по отношению к различным видам микроорганизмов тестировали следующим образом.

Суточные агаровые культуры микроорганизмов смывали физиологическим раствором и готовили микробные взвеси, содержащие 10⁴ КОЕ/мл. Лиофилизированное антимикробное средство растворяли в физиологическом растворе из расчета 10 мкг/мл, после чего готовили серийные разведения антимикробного средства.

Таблица 2. Чувствительность микроорганизмов к антимикробному средству (МБК50), выделенному из тромбоцитов крупного рогатого скота.
Вид микроорганизмов	Содержание белка в антимикробном средстве при эффективном разведении (мкг/мл)
B.subtilis 6633	0,02
S.aureus 6538P	0,4
M.lysodeikticus 2665	0,33
B.cereus 569	0,02
E.coli K12	1,3
S.epidermidis 14990	0,4
P.aerugmosa 219	0,65

К 0,1 мл взвеси тестируемого штамма микроорганизмов добавляли 0,9 мл разведения антимикробного средства (в контрольные пробы вместо разведения антимикробного средства добавляли 0,9 мл физиологического раствора). Полученную смесь инкубировали в течение 40-60 минут при 37°С. После инкубации из опытных и контрольных пробирок высевали по 0,2 мл на чашки Петри с 5% кровяным агаром. Посевы инкубировали 24 часа при 37°С. После инкубации подсчитывали количество выросших колоний на опытных и контрольных чашках. За минимальную бактерицидную концентрацию антимикробного средства принимали концентрацию, подавляющую 50% колоний бактерий по сравнению с контролем.

Результаты определения активности антимикробного средства, полученного согласно примеру 1, представлены в таблице 2.

Пример 3. Получение антимикробного средства из тромбоцитов свиньи.

Из 700 мл свежей цитратной свиной крови путем центрифугирования крови при комнатной температуре при 250 g в течение 30 минут получили обогащенный тромбоцитами супернатант. Тромбоциты осадили центрифугированием при 1000 g в течение 30 минут. 25 мл полученной тромбоцитарной массы 4 раза отмыли средой 199, после чего ресуспендировали в 150 мл ледяной (70%) уксусной кислоты и инкубировали при -15° - (-20°)С в течение 24 часов. После инкубации суспензию тромбоцитов разморозили и подвергли центрифугированию при 1000 g в течение 30 минут при комнатной температуре. Полученные супернатанты последовательно профильтровали через диализные мембраны Spectra/Por Biotech Regenerated Cellulose Dialysis Membrane MWCO 15000 (задерживающие продукты с молекулярной массой свыше 15000 дальтон) и Spectra/Por Biotech Cellulose Ester MWCO 500 (пропускающие продукты и соли с молекулярной массой менее 500 дальтон). Концентрат ультрафильтрата нанесли на колонку размером 10×250 мм с Сефадексом G-50. Элюцию провели линейным градиентом ацетонитрила (от 0% до 60%) с добавлением 0,1% раствора трифосфорной кислоты. Полученные пептидные фракции собрали, объединили, определили общее содержание белка, которое составило 675 мкг/мл, и лиофилизировали.

Пример 4. Определение активности антимикробного средства, выделенного из тромбоцитов свиньи.

Таблица 3. Чувствительность микроорганизмов к антимикробному средству (МБК50), выделенному из тромбоцитов свиньи.
Вид микроорганизмов	Содержание белка в антимикробном разведении (мкг/мл)
B.subtilis 6633	0,09
S.aureus 6538P	2,0
M.lysodeikticus 2665	0,5
B.cereus 569	0,08
E.coli K12	5,0
S.epidermidis 14990	2,5
P.aerugmosa 219	3,5

Активность антимикробного средства, полученного согласно примеру 3, по отношению к различным видам микроорганизмов тестировали согласно примеру 2.

Результаты определения активности антимикробного средства, полученного согласно примеру 3, представлены в таблице 3.

Пример 5. Определение активности антимикробного средства из тромбоцитов свиньи в комбинации с антибиотиками.

Для определения активности антимикробного средства из тромбоцитов свиньи в комбинации с антибиотиками был использован клинический штамм S.epidermidis 312 из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, выделенный от больного хроническим простатитом.

Методом серийных разведении [27] была определена чувствительность (минимальная подавляющая концентрация - МПК) S.epidermidis к антибиотикам. В качестве тестируемых антибиотиков были использованы ампициллин, гентамицин, карбенициллин, канамицин, ванкомицин, цефазолин. Конечная концентрация бактерий в среде с антибиотиком составляла 10⁵ КОЕ/мл. Через 24 часа инкубации при 37°С учитывали результаты. За МПК принимали разведение антибиотика, при котором не наблюдалось видимого бактериального роста.

Результаты представлены в таблице 4.

По методике, описанной в примере 2, была определена чувствительность штамма S.epidermidis 312 к антимикробному средству, выделенному из тромбоцитов свиньи, согласно примеру 4. Было установлено, что 50% угнетение роста S.epidermidis наблюдалось при концентрации антимикробного средства 10 мкг/мл.

На втором этапе в пробирки, содержащие антимикробное средство в конечной концентрации 10 мкг/мл и взвесь S.epidermidis в конечной концентрации 10⁵ КОЕ/мл, вносили суббактериостатические концентрации антибиотиков. Через 24 часа инкубации при 37°С учитывали результаты. За МПК принимали разведение антибиотика, при котором не наблюдалось видимого бактериального роста. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 4. Чувствительность S.epidermidis 312 к антибиотикам
Антибиотик	МПК (мкг/мл)
Ампициллин	1,0
Гентамицин	2,0
Карбенициллин	4,0
Канамицин	16,0
Ванкомицин	4,0
Цефазолин	0,5
Таблица 5. Чувствительность S.epidermidis 312 к антибиотикам в комбинации с антимикробным средством в концентрации 10 мкг/мл
Антибиотик	МПК (мкг/мл)
Ампициллин	0,25
Гентамицин	1,0
Карбенициллин	3,0
Канамицин	10,0
Ванкомицин	2,0
Цефазолин	0,25

Пример 6. Определение активности антимикробного средства из тромбоцитов крупного рогатого скота в комбинации с антибиотиками.

Для определения активности антимикробного средства из тромбоцитов крупного рогатого скота в комбинации с антибиотиками был использован клинический штамм S.epidermidis 312 из коллекции Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН, выделенный от больного хроническим простатитом.

По методике, описанной в примере 2, была определена чувствительность штамма S.epidermidis 312 к антимикробному средству, выделенному из тромбоцитов крупного рогатого скота, согласно примеру 1. Было установлено, что 50% угнетение роста S.epidermidis наблюдалось при концентрации антимикробного средства 5 мкг/мл.

По методике, описанной в примере 5, определили МПК S.epidermidis 312 к ряду антибиотиков.

Результаты представлены в таблице 4.

На втором этапе в пробирки, содержащие антимикробное средство в конечной концентрации 5 мкг/мл и взвесь S.epidermidis в конечной концентрации 10⁵ КОЕ/мл, вносили суббактериостатические концентрации антибиотиков. Через 24 часа инкубации при 37°С учитывали результаты. За МПК принимали разведение антибиотика, при котором не наблюдалось видимого бактериального роста. Результаты представлены в таблице 6.

Таблица 6. Чувствительность S.epidermidis 312 к антибиотикам в комбинации с антимикробным средством в концентрации 5 мкг/мл
Антибиотик	МПК (мкг/мл)
Ампициллин	0,1
Гентамицин	0,5
Карбенициллин	2,0
Канамицин	8,0
Ванкомицин	1,0
Цефазолин	0,1

Источники информации

1. Shailaja V.V., Himabindu V., Anuradha К. et al. In vitro activity of gatifloxacin against gram negative clinical isolates in a tertiary care hospital // Indian J. Med. Microbiol. - 2004. - Vol.22. - P.222-225.

2. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. - Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - С.174-186.

3. Mosca D.A., Hurst M.A., So W. et al. IB-367, a protegrin peptide with in vitro and in vivo activities against the microflora associated with oral mucositis // Antimicrob. Agents Chemother. - 2000. - Vol.44. - P.1803-1808.

4. Фадеев С.Б. Видовой состав и персистентные характеристики возбудителей хирургической инфекции мягких тканей. - Автореф. дисс... канд. мед. наук. - Оренбург, 1998.

5. Справочник практического врача. - М., 1992. - С.5-18.

6. Бурмистрова А.Л. Иммунный гомеостаз и микросимбиоценоз. Метаморфозы и пути развития воспалительных заболеваний кишечника. - Челябинск, 1997. - С.166-167.

7. Hancock R.E.W., Scott M.G. The role of antimicrobial peptides in animal defenses // PNAS. - 2000. - Vol.97. - P.8856-8861.

8. US Patent 5338724, A 61 K 037/02, 1994.

9. US Patent 6211148, А 61 К 038/16, 2001.

10. US Patent 6008195, С 07 К 007/08, 1999.

11. Yeaman M.R. The role of platelets in antimicrobial host defence // Clin. Infect. Dis. - 1997. - Vol.25. - P.951-968.

12. US Patent 6743769 A 61 K 038/04, 2004.

13. Krijgsveld J., Zaat S.A.J., Meeldijk J. et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion productes of CXC chemokines // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol.275. - P.20374-20381.

14. Darveau R.P., Blake J., Seachord C.L. et al. Peptides related to the carboxyl terminus of human platelet factor IV with antibacterial activity // J. Clin. Invest. - 1992. - Vol.90. - P.447-455.

15. Tang Y.-Q., Yeaman M.R., Selsted M.E. Antimicrobial peptides from human platelets // Infect. Immun. - 2002. - Vol.70. - P.6524-6533.

16. Бухарин О.В., Черешнев В.А., Сулейманов К.Г. Антимикробный белок тромбоцитов. - Екатеринбург: УрО РАН, 2000. - С.35-99.

17. Qu X.-D, Lehrer R.I. Secretory phospholipase A2 is the principal bactericide for staphylococci and other gram-positive bacteria in human tears // Infect. Immun. - 1998. - Vol.66. - P.2791-2797.

18. Das S., Banerjee S., Gupta J.D. Experimental evaluation of preventive and therapeutic potentials of lysozyme // Chemotherapy. - 1992. - Vol.38. - P.350-357.

19. Yan H., Hancock R.E.W. Synergistic interactions between mammalian antimicrobial peptides // Antimicrob. Agents. Chemother. - 2001. - Vol.45. - P.1558-1560.

20. Tang Y.Q., Yeaman M.R., Selsted M.E. Microbicidal and synergistic activities of human platelet factor-4 (hPF-4) and connective tissue activating peptide-3 (CTAP-3). - Blood. - 1995. - Vol.86 (Suppl.1). - P.556a.

21. Cole A.M., Dewan P., Ganz T. Innate antimicrobial activity of nasal secretions // Infect. Immun. - 1999. - Vol.67. - P.3267-3275.

22. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.l93. - P.265-275.

23. Yeaman M.R., Tang Y.Q., Shen A.J. et al. Purification and in vitro activities of rabbit platelet microbicidal proteins // Infect. Immun. - 1997. - Vol.65. - P.1023-1031.

24. Spilker B. Guide to Clinical Studies and Developing Protocols. - Raven Press Books, Ltd.: New York, 1984. - P.7-13, 54-60.

25.Spilker В. Guide to Clinical Trials. - Raven Press, Ltd.: New York, 1991. - P.93-101.

26. Т.Speight, ed. Avery's Drug Treatment: Principles and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3d ed. - Williams and Wilkins: Baltimore, 1987. - P.50-56.

27. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard, 2^nd ed. Document M7-A3. - National Committee for Clinical Laboratory Standards: Wayne, Pa. - 1993.

1. Антимикробное средство, представляющее собой пептидсодержащую фракцию тромбоцитов крупного рогатого скота с молекулярным весом 0,5-15 кДа, полученную путем замораживания и размораживания тромбоцитарной массы при температуре -15÷(-20)°С в течение 24 ч, центрифугирования при 1000 g, фильтрации супернатанта через диализные мембраны 15000 и 500 и элюции концентрата, содержащего пептиды, линейным градиентом ацетонитрила с Сефадекса G-50.

2. Антимикробное средство, представляющее собой пептидсодержащую фракцию тромбоцитов свиньи с молекулярным весом 0,5-15 кДа, полученную путем замораживания и размораживания тромбоцитарной массы при температуре -15÷(-20)°С в течение 24 ч, центрифугирования при 1000 g, фильтрации супернатанта через диализные мембраны 15000 и 500, и элюции концентрата, содержащего пептиды, линейным градиентом ацетонитрила с Сефадекса G-50.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество антимикробного средства по любому из пп.1 и 2 и фармацевтически приемлемый носитель.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что дополнительно содержит одно или более антимикробное соединение.

5. Фармацевтическая композиция по п.4, отличающаяся тем, что антимикробное соединение представляет собой антибиотик, противогрибковый или противовирусный агент.

6. Фармацевтическая композиция по п.5, отличающаяся тем, что антибиотик выбирается из группы, включающей аминогликозиды, пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы, монобактамы, хинолоны, тетрациклины, гликопептиды, нитрофураны, рифампицин, клиндамицин, хлорамфеникол, триметоприм, сульфометоксазол.

7. Фармацевтическая композиция по п.6, отличающаяся тем, что антибиотик представляет собой амикацин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, стрептомицин, азитромицин, кларитромицин, эритромицин, пенициллин G, пенициллин V, метициллин, оксациллин, ампициллин, амоксициллин, тикарциллин, карбенициллин, мезлоциллин, азлоциллин, пиперациллин, цефалотин, цефазолин, цефаклор, цефамандол, цефокситин, цефуроксим, цефоницид, цефметазол, цефотенан, цефпрозил, лоракарбеф, цефетамет, цефоперазон, цефотаксим, цефтизоксим, цефтриаксон, цефтазидим, цефепим, цефиксим, цефподоксим, цефсулодин, имипенем, азтреонам, флероксацин, налидиксовая кислота, норфлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин, эноксацин, ломефлоксацин, циноксацин, доксициклин, миноциклин, тетрациклин, ванкомицин или тейкопланин.

8. Фармацевтическая композиция по любому из пп.3-7, характеризующаяся тем, что выполнена в форме порошка для инъекций, таблеток, капсул, раствора для инъекций, суппозиториев, мази, крема, спрея, геля, бактерицидных салфеток, присыпок.