Способ очистки рекомбинантных белков

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу очистки рекомбинантных белков из штаммов-продуцентов микроорганизмов, и может быть использовано в структурной протеомике, при рентгеноструктурном анализе белков с неизвестной функцией, антигенном картировании белков и создании вакцин на основе рекомбинантных белков. В способе очистки рекомбинантных белков из штаммов-продуцентов микроорганизмов используют наночастицы двухвалентных металлов с диаметром частиц 20-100 нм. При этом связывание рекомбинантных белков проводят непосредственно в грубом лизате клеток, а отделение частиц от несвязавшихся белков выполняют с помощью магнитной сепарации. Изобретение позволяет заменить крайне дорогостоящие хроматографические методы, которые применяются в настоящее время для очистки рекомбинантных белков и, тем самым, ускорить и снизить стоимость очистки целевого препарата. 2 ил.

 

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу очистки рекомбинантных белков из штаммов микроорганизмов.

Одной из самых актуальных проблем биотехнологической практики является разработка новых методов и систем очистки рекомбинантных белков для нужд фармацевтической, пищевой промышленности, сельского хозяйства. Используемые в настоящее время методы очистки рекомбинантных белков из штаммов-гиперпродуцентов дороги, трудоемки и требуют специального лабораторного оборудования. В силу этого разработка, с одной стороны, простых и дешевых, а с другой стороны, высокоэффективных и надежных методов очистки белков является чрезвычайно актуальной задачей.

Наиболее распространенными методами очистки рекомбинантных белков в биотехнологии являются хроматографические методы и, в частности, металлохелатная аффинная хроматография [1, 2, 3]. Один из приемов металлоафинной хроматографии основан на том, что некоторые аминокислоты, в частности гистидин, способны формировать комплексы с ионами металлов. После иммобилизации на хроматографической фазе хелатирующих групп целевой рекомбинантный белок, содержащий блок из нескольких остатков гистидина, связывается с хроматографической фазой, после чего отделяются сопутствующие белки и проводится элюция целевого белка. Кроме блока из остатков гистидина, целевой рекомбинантный белок может содержать последовательности глутатион-S-трансферазы (GST), хитина, S-белка и другие, при этом принципы хроматографического выделения целевого рекомбинантного белка остаются теми же.

Ближайшим аналогом является метод металлохелатной хроматографии с использованием никельсефарозы [4]. В качестве хроматографической фазы используется сефароза RTM CL 6В с иммобилизированной никель нитрилотриуксусной кислотой - Ni-NTA [4]. Данный метод позволяет проводить очистку рекомбинантных белков, имеющих в своем составе блок из нескольких (3-7) остатков гистидина. Нуклеотидная последовательность, кодирующая гистидиновый блок, может быть клонирована в соответствующий экспрессирующий плазмидный вектор. Метод основан на афинном взаимодействии рекомбинантного белка, включающего блок из 6 остатков гистидина, с никельнитрилотриуксусной кислотой, выступающей в роли хелатора, и сефарозы, выступающей в роли носителя. На количественный и качественный выход белка, при его очистке с использованием данного метода, влияют два важных фактора: взаимодействие ионов никеля с хелатирующим агентом и взаимодействие гистидинового блока с ионами никеля. Необходимо отметить, что коммерчески доступные реагенты, используемые для данного метода очистки белков, достаточно дороги, кроме того, для достижения оптимальной степени очистки белка необходимо дорогостоящее хроматографическое оборудование.

Целью настоящего изобретения является разработка простого и эффективного способа очистки рекомбинантных белков с использованием наночастиц двухвалентных металлов из ряда никель, кобальт с диаметром частиц 20-100 нм, который позволит ускорить и снизить стоимость очистки целевого препарата.

Поставленная цель достигается путем использования наночастиц металлов с диаметром частиц 20-100 нм для очистки рекомбинантных белков при весовом соотношении белок/металл 1/5-1/15, имеющих в своем составе полигистидиновый блок, методом магнитной сепарации.

Для получения наноразмерных частиц металлов использовалась разработанная в ИНЭПХФ РАН лабораторная установка, предназначенная для получения нанометровых частиц (5-1000 нм) металлов, оксидов металлов и их соединений методом конденсации в потоке по методу Гена-Миллера [5]. Установка снабжена приспособлениями для химической модификации поверхности частиц газофазными реагентами непосредственно в потоке несущего их инертного газа и для отбора пробы частиц непосредственно из потока. Сущность способа состоит в том, что капля расплавленного металла, удерживаемая и разогреваемая до высокой температуры полем высокочастотного противоточного индуктора внутри кварцевой трубки, обдувается потоком инертного газа. Пары металла, диффундирующие в пограничном слое ламинарного потока инертного газа вокруг капли, охлаждаются, при этом происходит гомогенное образование ядер конденсации. По мере продвижения к внешнему краю пограничного слоя происходит рост частиц за счет конденсации на них паров металла и коалесценции. Образовавшиеся частицы выходят в обтекающий поток относительно более холодного газа и уносятся им. В потоке завершается процесс конденсации и происходит коагуляция частиц аэрозоля металла. В дальнейшем, ниже по потоку, твердые частицы аэрозоля металла попадают в зону возможного контакта с парами реагента, после чего задерживаются мишенью или фильтром.

Пример реализации изобретения. Очистка зеленого флуоресцирующего белка с использованием наночастиц никеля диаметром 50 нм.

На первом этапе работы получали штамм продуцент зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent protein, GFP). Для трансформации использовали штамм E.coli BL21 (DE3) [pLysS] (Novagen, Германия) и плазмидный вектор pHAT-GFPUv (Clontech, США). Клетки Е.coli штамма BL21 (DE3) [pLysS] трансформировали плазмидой pHAT-GFPuv, содержащей полноразмерную кодирующую последовательность гена GFP. Двумя-тремя рекомбинантными колониями инокулировали 10 мл среды ТВ (1,2% бактотриптон, 2,4% бактодрожжевой экстракт, 4% глицерин, 17 мМ КН₂PO₄, 72 мМ К₂HPO₄), содержащей ампициллин (50 мкг/мл), и растили в течение ночи при температуре 37°С. 1 мл полученной культуры инокулировали 100 мл среды ТВ, содержащей ампициллин (50 мкг/мл), предварительно прогретой до 37°С, и растили при температуре 37°С и постоянном встряхивании до достижения культурой оптической плотности OD₆₀₀=1,2. Экспрессию целевого белка индуцировали добавлением изопропил-β-D-тиогалактозида до конечной концентрации 1 мМ. Культуру инкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С и постоянном встряхивании. Наличие целевого белка проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (10%) согласно стандартной методике. Электрофореграмма приведена на фиг.1.

Клетки E.coli, содержащие рекомбинантный белок, осаждали центрифугированием (6000 g, 4°C, 20 мин), промывали буфером (10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) и ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (20 мМ натрий-фосфатный буфер, 0,5 М Nad), содержащем 10 мМ имидазол, 20% глицерин и 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (буфер для выделения). Клетки подвергали двукратному замораживанию-оттаиванию. После этого клетки подвергали ультразвуковой дезинтеграции (22 кГц, 3×10 с), добавляли рибонуклеазу до концентрации 2 ед./мл и дезоксирибонуклеазу до концентрации 300000 ед./мл и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Фрагменты разрушенных клеток осаждали центрифугированием (100000 g, 4°C, 1 ч). Осадок ресуспендировали в буфере для выделения, содержащем 1% Emulgen-913, инкубировали в течение 2 часов при температуре 4°С и медленном покачивании, после чего повторно центрифугировали при указанных выше условиях. Полученный в обоих случаях супернатант пропускали через фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.

К грубому лизату клеток E.coli добавляли порошок никеля с диаметром частиц 50 нм в соотношении 5 мг частиц никеля на 1 мг суммарного белка грубого лизата, инкубировали при интенсивном встряхивании в течение 15 мин при комнатной температуре. Магнитную сепарацию частиц никеля проводили с использованием Magnetic Separation Unit (Promega, США). Несвязавшиеся белки удаляли, частицы никеля промывали путем добавления фосфатно-солевого буфера при интенсивном встряхивании 15 мин при комнатной температуре. Далее, частицы также были сепарированы, элюцию белка проводили с использованием фосфатно-солевого буфера с добавлением 250 мМ имидазола. Наличие очищенного белка проверяли с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (10%). Результаты приведены на фиг.2.

Связывание рекомбинантных белков с наночастицами металлов диаметром менее 20 нм и более 100 нм происходит неэффективно.

В настоящее время очистка рекомбинантных белков из штаммов-гиперпродуцентов проводится с использованием различных хроматографических методов. Метод, основанный на аффинном связывании целевого белка с Ni-NTA сефарозой, является дорогостоящим (цена колеблется от 200 до 700 USD за количество данного хроматографического агента, способного связать 10 мг рекомбинантного белка). В то же время стоимость ультрадисперсных порошков различных металлов не превышает 1000 USD за килограмм, а для получения 1 мг рекомбинантного белка необходимо всего 100-300 мг наночастиц металла. Данный метод значительно уменьшает расходы на получение и очистку рекомбинантных белков.

Литература

1. Патент США, 4569794, НКИ 530/344; 530/415; 930/10; 930/20, 1989 г.

2. Патент США, 5284933, НКИ 530/350; 435/69.7; 530/324; 530/409; 530/413, 1994 г.

3. Патент США, 5310663, НКИ 435/69.7; 435/320.1; 530/413; 536/23.1, 1994 г.

4. Патент США, 4877830, НКИ 525/54.3; 525/54.31; 525/54.32; 525/54.4; 525/54.45, 1989 г.

5. Авт.св. СССР №814432, МПК В 05 В 7/16; С 23 С 14/00, 1981 г.

Способ очистки рекомбинантных белков путем образования комплексов с ультрадисперсными порошками металлов, отличающийся тем, что непосредственно в грубый лизат клеток штамма-продуцента, содержащего рекомбинантный белок, добавляют ультрадисперсный порошок металла из ряда никель, кобальт с размерами частиц 20-100 нм, при весовом соотношении суммарный белок грубого лизата клеток штамма-продуцента/металл 1/5-1/15, инкубируют при комнатной температуре и интенсивном встряхивании, процедуры промывки частиц и элюции целевого белка проводят путем магнитной сепарации ультрадисперсных порошков металлов.