Способ морфологической диагностики состояния нервной системы для биологического объекта в конкретный период онтогенеза

Изобретение относится к области медицины, в частности к нейроморфологии. Способ обеспечивает повышение информативности способа морфологической диагностики состояния нервной системы для биологического объекта в конкретный период онтогенеза. В исследуемой области нервной системы производят на срезах замеры первичных морфометрических параметров перикариона и ядра нейрона для определения их объемов и ядерно-цитоплазматического отношения как без воздействия - норма, так и после воздействия экзогенных и/или эндогенных факторов, при этом по объему перикариона нейрона устанавливают тип, а именно - тип 1 - мелкие - объем перикариона нейрона до 1435 мкм³, тип 2 - средние - 1436-8171 мкм³, тип 3 - крупные - 8172-20556 мкм³, тип 4 - гигантские - свыше 20557 мкм³, по ядерно-плазматическому отношению - класс: А - при ядерно-плазматическом отношении до 0,7; В - 0,71-1,29; и С - свыше 1,3, а по сочетанию типа и класса устанавливают категорию и затем долю каждой категории в исследуемой области и по характеру распределения различных категорий нейронов относительно нормы диагностируют состояние нервной системы для биологического объекта в конкретный период онтогенеза под влиянием экзогенных и/или эндогенных факторов. 2 табл.

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а точнее к нейроморфологии, и может найти применение в патологической анатомии для изучения патологии нервной системы, вариантной и возрастной морфологии человека и животных, а также для исследований в области фармакологии и экспериментальной медицины.

Для морфологической диагностики состояния нервной системы определенного вида биообъекта (животное, человек) в конкретный период онтогенеза используют изучение состояния нейрона по таким его компонентам, как перикарион, ядро и цитоплазма перикариона. Для этого используют различные методы, базирующиеся на гистологических классификациях нейронов. При этом состояние нервной системы выявляют путем сопоставления контрольного и опытного образцов.

Известен метод морфологической диагностики состояния нервной системы, при котором используют гистологическую классификацию нейронов по типу окраски и доле компонентов нейрона [1]. При этом нейроны делят на цитохромные, у которых доля ядра превосходит долю цитоплазмы перикариона; на кариохромные, у которых доля ядра приближается к доле цитоплазмы перикариона; на соматохромные, у которых доля цитоплазмы перикариона значительно превосходит долю ядра.

Используемая терминология не отвечает истинному положению дел и не отражает морфологических характеристик нейронов, что вносит определенную терминологическую путаницу; так как неверно характеризует тинкториальные свойства ядра и цитоплазмы перикариона. Так, термином "цитохромный" обозначают нейрон с почти неразличимым ободком цитоплазмы, т.е. у такого нейрона окрашена лишь узкая полоса цитоплазмы перикариона вокруг ядра, а не весь нейрон, как явствует из названия. Термином "кариохромный" обозначают нейрон, имеющий ободок цитоплазмы, доля которой уступает доле ядра. Сам же термин "кариохромный" (от греческого слова - karyos - ядро, и chomos - краска) обозначает нейрон с окрашенным ядром. Учитывая, что в нормальном нейроне ядро имеет характерный везикулярный слабоокрашенный вид, а, напротив, цитоплазма перикариона обладает выраженной базофилией (окрашивается основными красителями, например тионином, в синий цвет), становится очевидной неправомерность данного термина. И, наконец, термином "соматохромные" (лат. soma - тело, в данном случае тело нейрона) можно называть, практически, любые нормальные нейроны, которые имеют окрашенную цитоплазму перикариона (тела нейрона). Поэтому использование этой классификации и трактовка результатов носят во многом условный характер. Не менее важно и то, что, изучая возрастную динамику строения нейронов, сложно охарактеризовать степень отклонения размеров нейрона и его компонентов от возрастной нормы под влиянием воздействия экзогенных и/или эндогенных факторов.

Указанные недостатки частично устранены в другом известном способе морфологической диагностики состояния нервной системы, который наиболее близок к предложенному изобретению [2]. Согласно известному способу проводят сопоставление состояния нервной системы контрольных и опытных, например подвергнутых воздействию иммобилизационного стресса, биологических объектов одного биологического вида, например лабораторных крыс. Для этого в исследуемой (любой) области нервной системы выполняют морфометрию нейронов на окрашенных гематоксилином и эозином срезах посредством винтового окуляр-микрометра "М0В-1-15х" или компьютерных программ, например Image-Tool (США), ImageJ (США) или ВидеотестМорфо (Россия). В каждом случае производят не менее 30 измерений. Первичные морфометрические данные представляют следующими показателями: максимальный и минимальный диаметры перикарионов нейронов, максимальный и минимальный диаметры ядер. Данные показатели служат для определения у каждого нейрона объемов перикариона, ядра и цитоплазмы перикариона нейрона с последующим вычислением ядерно-цитоплазматического отношения (ЯЦО) перикариона нейрона, причем под ядерно-цитоплазматическим отношением понимается отношение объема ядра V_я к объему цитоплазмы перикариона нейрона V_ц. Все количественные данные регистрируют в виде базы данных. Основу характеристики каждой группы нейронов (в конкретной области нервной системы) составляют средние арифметические нескольких количественных параметров, например средний объем перикарионов нейронов, средний объем цитоплазмы перикарионов нейронов, средний объем ядер нейронов, среднее ядерно-цитоплазматическое отношение перикарионов нейронов и т.д.

При использовании подобного подхода оценка индивидуальных и внутригрупповых различий хотя возможна, однако характеризует исследуемую область в целом посредством расчета для всех нейронов таких морфометрических показателей, как средняя арифметическая, стандартное отклонение, стандартная ошибка, минимум, максимум, дисперсия выборки, что позволяет обобщить результаты путем усреднения первичных параметров. Однако по этим данным невозможно установить внутригрупповое распределение и качественный состав входящих в каждую группу элементов, а также степень вариабельности их признаков. Кроме того, анализируемые признаки рассматриваются дискретно, хотя ряд из них взаимосвязан и является составляющими другого признака.

Целью предлагаемого способа морфологической диагностики состояния нервной системы для определенного вида биообъекта в конкретный период онтогенеза является повышение информативности способа диагностики. Технический результат достигается тем, что в известном способе морфологической диагностики состояния нервной системы для биологического объекта в конкретный период онтогенеза, при котором в исследуемой области нервной системы производят на срезах замеры первичных морфометрических параметров перикариона и ядра нейрона для определения их объемов и ядерно-цитоплазматического отношения.

Согласно изобретению по объему перикариона нейрона устанавливают тип, по ядерно-цитоплазматическому отношению - класс, а по сочетанию класса и типа - категорию нейрона, а далее по доле каждой категории выявляют вначале морфометрическую модель исследуемой области в норме, а затем ее морфометрическую модель фактического состояния под влиянием экзогенных и/или эндогенных факторов и сопоставляют их.

При осуществлении способа исходят из того, что нейроны и их компоненты имеют пространственную организацию и потому для выяснения закономерности их изменений необходим анализ их объемных параметров, которые определяют на основе линейных параметров. Границы линейных параметров перикарионов нейронов известны из многочисленных исследований, опубликованных ранее [1÷10], и находятся в пределах от 3 до 150 мкм. Эти сведения позволяют определить объемы перикарионов нейронов, которые для их использования в предлагаемом способе разбивают на четыре типа и сводят в таблицу 1.

Таблица 1. Типы нейронов.
Тип нейрона	Объем перикариона нейрона, мкм3
1 (мелкие)	До 1435
2 (средние)	1436-8171
3 (крупные)	8172-20556
4 (гигантские)	Свыше 20557

Отношение объема ядра к объему цитоплазмы перикариона нейрона, устанавливаемое исходя из первичных линейных параметров, указанных выше, известно как ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО), в предлагаемом способе подразделяют, например, на три класса А, В, С и сводят в таблицу 2.

Таблица 2. Ядерно-цитоплазматическое отношение перикарионов нейронов.
Класс нейрона	Ядерно-цитоплазматическое отношение, число
А	До 0,7
В	0,71-1,29
С	Свыше 1,3

При этом считают, что нейроны с низким ядерно-цитоплазматическим отношением, когда доля цитоплазмы перикариона значительно превышает долю ядра, являются зрелыми в большинстве отделов нервной системы. Напротив, высокое ядерно-цитоплазматическое отношение указывает на низкую зрелость нейронов. Таким образом, изменение ядерно-цитоплазматического отношения в ту или иную сторону является одним из важнейших диагностических признаков.

Категорию нейрона устанавливают по сочетанию типа и класса и документируют как сочетание их обозначений: А1, А4, В1, В3, С2, С3 т.д. и т.п.

Осуществляют способ следующим образом. Берут две группы одного и того же возраста из какого-либо вида биообъектов, например лабораторных белых крыс в количестве не менее десяти животных в каждой группе. Одна группа - контрольная (норма), другая группа - опытная, подвергаемая воздействию эндогенных и/или экзогенных факторов, например иммобилизационному стрессу. Выбирают область нервной системы, подвергаемую диагностике, например гигантоклеточное ретикулярное ядро продолговатого мозга, в которой исследуют от 30 до 100 нейронов у каждого животного из обеих групп. Для этого с помощью, например, окуляр-микрометра осуществляют на срезах замеры первичных морфометрических параметров перикариона и ядра нейрона, а уже по ним определяют объем перикариона V_пер, объем ядра V_я и объем цитоплазмы перикариона V_ц.

После этого по приведенным выше таблицам 1 и 2 устанавливают тип, класс и категорию нейрона. Так, если V_пер равно 800000 мкм³, а ядерно-цитоплазматическое отношение равно 1,35, то это значит, что у нейрона 4-й тип, класс С. Отсюда этот нейрон относят к категории С4. Каждый из исследуемых нейронов относится к какой-то категории, причем часть нейронов имеет, например, категорию С4, часть - С3, а часть - категорию В3. Затем определяют долю каждой категории в исследуемой области нервной системы, что позволяет выявить ее морфометрическую модель.

Описание морфометрических моделей для обеих групп можно выразить следующим образом: С4(80%)+С3(15%)+В3(5%) - норма и С4(30%)+С3(20%)+В3(50%) - опыт.

Выявленные морфометрические модели сопоставляют и проводят морфологическую диагностику состояния исследуемой области нервной системы биологического объекта в конкретный период онтогенеза.

В приведенном примере для морфометрической модели гигантоклеточного ретикулярного ядра продолговатого мозга в норме у крыс в возрасте двух месяцев характерно значительное преобладание (80%) гигантских нейронов с низким ядерно-цитоплазматическим отношением - категория С4. Кроме того, выявлено и наличие нейронов крупных размеров с низким ядерно-цитоплазматическим отношением - категория С3 (15%) и нейронов крупных размеров со средним ядерно-цитоплазматическим отношением - категория В3 (5%). Таким образом, обнаружено явное доминирование нейронов категории С4.

А для морфометрической модели той же области нервной системы у крыс того возраста под воздействием иммобилизационного стресса характерно резкое уменьшение (30%) гигантских нейронов с низким ядерно-цитоплазматическим отношением - категория С4 на фоне резкого преобладания крупных нейронов (50%) со средним ядерно-цитоплазматическим отношением - В3, а также увеличением доли нейронов крупных размеров с низким ядерно-цитоплазматическим отношением - категория С3 (20%). Выявленные изменения указывают не только на значительное отставание процессов роста и созревания нейронов данной области. Они позволяют, во-первых, точно определить за счет какой именно популяции нейронов (категория В3) происходит наиболее выраженное отставание роста, во-вторых, охарактеризовать распределение и соотношение популяций нейронов данной области нервной системы как более равномерное с отсутствием явно выраженного доминирования одной категории нейронов.

Таким образом, на данном примере продемонстрировано, что применение предлагаемого изобретения впервые позволяет в значительной мере детализировать результаты морфологической диагностики, сделать новые выводы о характере распределения различных категорий нейронов, которые невозможно было сделать, используя прототип. Оно не отменяет традиционного морфометрического анализа, позволяет повысить его информативность за счет более полной и лаконичной характеристики различных областей нервной системы. Морфологическое выявление некоторых категорий нейронов в пределах исследуемой анатомической области с одной стороны способствует углубленному анализу и дифференцировке нейронов (выделение категорий), а с другой стороны отражает смысл современных представлений о структурной гетероморфности нейронов (7), в частности о способности нейронов одной и той же области нервной системы синтезировать широкий спектр нейромедиаторов и модуляторов, способствует поиску новых схем объяснения взаимодействий между элементами нервной системы. Способ морфологической диагностики обеспечивает не только определение качественного состава популяций нейронов, но также учитывает составляющую каждой популяции в общей группе, что позволяет производить сравнение одноименных областей нервной системы как по признаку существования категорий нейронов, так и по изменению количественного состава нейронов внутри категории. Последнее преимущество предлагаемого способа очень ценно для биологических исследований, поскольку морфологические изменения в анализируемой области зачастую носят неравномерный характер, а очаговый тип распределения с различной выраженностью изменений внутри патологического очага, что зависит как от локальных нейроанатомических предпосылок, так и от действия системных факторов.

Изобретение позволяет уточнить степень структурных изменений в нейронах при изучении краевой патологии, вариантной и возрастной нейроанатомии при определении конституциональных особенностей индивидуумов, будь то животное или человек, а также при исследовании влияния фармацевтических препаратов или каких-либо других экзогенных факторов, например алкоголя, стресса, иммунизации, воздействия аппаратуры и т.д.

Список использованной литературы

1. Ермохин П.Н. Гистопатология центральной нервной системы (Атлас микрофотографий). М.: Медицина, 1969. - 243 с.

2. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина, 1990. - 384 с.

3. Автандилов Г.Г. Основы количественной патологической анатомии: Учебное пособие. - М.: Медицина, 2002. - 240 с.

4. Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. и др. Гистология: Учебник. - 5-е изд. - М.: Медицина, 2001. - 744 с.

5. Бабминдра В.П., Брагина Т.А. Структурные основы межнейронной интеграции. - Л.: Наука, 1982. - 164 с.

6. Писарев В.Б., Потанин М.Б. Морфофункциональное состояние головного мозга стресс-неустойчивых животных при иммобилизационном стрессе // Морфология компенсаторных и приспособительных процессов при действии стрессорно-повреждающих факторов внешней среды: Сб. науч. тр. Волгогр. мед. акад. - 2001, Т.57, Вып.2. - С.101-112.

7. Руководство по гистологии / В 2 т. - СПб.: СпецЛит, 2001.

8. Сивухина Е.В. Крупноклеточные ядра гипоталамуса при хронической алкогольной интоксикации (экспериментальное и клинико-морфологическое исследование). Дисс. ... канд. мед. наук. - Курск, 2003. - 167 с.

9. Смирнов А.В. Структурные особенности нервно-мышечного аппарата сердца развивающегося организма в условиях дозированной гиподинамии и гипокинезии (экспериментально-морфологическое исследование). Автореф. дисс. ... канд. мед. наук. - Волгоград, 1998. - 18 с.

10. Ross M.H., Romrell L.J., Kaye G.I. Histology: a text and atlas. Williams & Wilkins, USA, 1995. - 823 р.

Способ морфологической диагностики состояния нервной системы для биологического объекта в конкретный период онтогенеза, при котором в исследуемой области нервной системы производят на срезах замеры первичных морфометрических параметров перикариона и ядра нейрона для определения их объемов и ядерно-цитоплазматического отношения как без воздействия - норма, так и после воздействия экзогенных и/или эндогенных факторов, отличающийся тем, что по объему перикариона нейрона устанавливают тип, а именно - тип 1 - мелкие - объем перикариона нейрона до 1435 мкм³, тип 2 - средние - 1436-8171 мкм³, тип 3 - крупные - 8172-20556 мкм³, тип 4 - гигантские - свыше 20557 мкм³, по ядерно-плазматическому отношению - класс: А - при ядерно-плазматическом отношении до 0,7; В - 0,71-1,29; и С - свыше 1,3, а по сочетанию типа и класса устанавливают категорию и затем долю каждой категории в исследуемой области и по характеру распределения различных категорий нейронов относительно нормы диагностируют состояние нервной системы для биологического объекта в конкретный период онтогенеза под влиянием экзогенных и/или эндогенных факторов.