Способ получения трансгенных однодольных растений in vitro
Владельцы патента RU 2301519:
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук (RU)
Изобретение относится к культивированию тканей растений и может быть использовано в сельском хозяйстве, а также для проведения исследований в области физиологии растений. Семена однодольного растения обрабатывают в условиях вакуумной инфильтрации в течение 30-50 мин в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, затем инкубируют в суспензии этого штамма в течение 23-25 часов. Проростки выращивают на твердой питательной среде в течение 3-5 суток без антибиотиков, в которую затем добавляют совместно канамицин и цефотаксим. Способ позволяет увеличить выход трансгенных однодольных растений независимо от морфогенетического потенциала и сомаклональной изменчивости и сократить сроки их получения. 2 ил., 1 табл.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано как в сельском хозяйстве, городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области биотехнологии, физиологии и экологии растений.
В настоящее время одной из серьезных проблем является получение трансгенных однодольных растений. Из предлагаемых методов большую экономическую эффективность и стабильность результатов обеспечивает введение генов, опосредованное Agrobacterium tumefaciens, так как при использовании агробактериальных векторов увеличивается возможный размер вводимой конструкции, число копий встраиваемых последовательностей невелико (1-3), что не препятствует экспрессии гена. Метод прост и дешев и не требует специального оборудования (Dai S., Zhang Р., Marmey P., Zhang S., Tian W., Chen S., Beachy R., Fauquet C. Comparative analysis of transgenic plants obtained by Agrobacterium-mediated transformation and particle bombardment // Mol. Breed. V.7. P.25-33). Он детально разработан для двудольных растений, но для однодольных используется сравнительно редко. Это связано с тем, что однодольные растения в природных условиях не трансформируются агробактерией. Считается, что сигнальные молекулы, индуцирующие перенос Т-ДНК в растения, отсутствуют у однодольных, поэтому применение Agrobacterium tumefaciens для получения трансгенных растений пшеницы пока ограничено единичными работами.
Недостатком данного метода является его низкая эффективность.
Одним из аналогов является способ агробактериальной трансформации Arabidopsis thaliana с использованием семян (Feldman K.A., Marks M.D. Agrobacterium - mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana: a non-tissue culture approach // Mol.Gen.Genet 1987. V.208. P.1-9).
Недостатком данного способа является его применение только на арабидопсисе, который не является однодольным растением.
Самым близким по технической сущности аналогом является способ, в котором для введения генов в незрелые зародыши пшеницы проводят инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в течение 3 часов, с последующим высевом на твердую питательную среду и дополнительным трехдневным культивированием без антибиотика (Wu H., Sparks С., Amoah В., Jones H.D. Factors influencing successful Agrobacterium - mediated genetic transformation of wheat // Plant Cell Rep.2003. V.21. P.659-668).
Недостатком данного метода трансформации является низкая частота получения трансгенных растений (от 0,3% до 3%), а также использование в качестве эксплантов незрелых зародышей, на которых впоследствии будет формироваться каллус. Общим недостатком для всех методов трансформации с применением каллусных культур является зависимость от морфогенетического потенциала растения; появление сомаклональных вариантов, в том числе и устойчивых к селективному агенту (канамицину); значительная продолжительность получения трансгенных растений - в вышеприведенной работе время от момента начала трансформации до появления трансгенных растений составляет не менее 8 месяцев.
Задачей настоящего изобретения является разработка такого способа, который будет лишен вышеуказанных недостатков и позволит получать трансгенные растения независимо от морфогенетического потенциала и сомаклональной изменчивости, а также сократит сроки получения генетически модифицированных растений.
Эта задача решается новым способом получения трансформированных однодольных растений, заключающимся в обработке семян в условиях вакуумной инфильтрации в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, содержащего селективный ген nptII и целевой ген ipt, при этом суспензию Agrobacterium tumefaciens предварительно активизируют экстрактом из листьев табака, с последующим инкубированием эксплантов в суспензии Agrobacterium tumefaciens в условиях нормального давления при перемешивании, причем в качестве эксплантов используют семена, вакуумную инфильтрацию проводят при -0,7÷-0,9 атм в течение 30-50 минут, инкубацию семян в суспензии Agrobacterium tumefaciens проводят в течение 23-25 часов, выращивание проростков на твердой питательной среде проводят в течение 3-5 суток без антибиотиков с последующим совместным добавлением антибиотика канамицина (50 мг/л) - для отбора канамицин-устойчивых растений и цефотаксима (300 мг/л) - для элиминации агробактерии.
Используемый в работе штамм Agrobacterium tumefaciens любезно предоставлен профессором СПбГУ Лутовой Л.А., содержит плазмиду pGV3850 с геном ipt (изопентениладенин трансфераза - ключевой фермент биосинтеза цитокинина) под промотором 35S вируса мозаики цветной капусты, и геном nptII, который кодирует фермент неомицинфосфотрансферазу, обеспечивающий устойчивость к канамицину для селекции растительных клеток под контролем NOS - промотора.
Заявляемые пределы режимов вакуумной инфильтрации определяются следующим образом: при использовании давления меньше -0,7 атм и обработке менее 30 минут снижается выход канамицин-устойчивых растений, а при повышении давления больше 0,9 атм и обработке более 50 минут снижается появление жизнеспособных растений. Заявляемые пределы совместной инкубации семян и суспензии агробактерии при перемешивании определяются следующим образом: инкубация менее 23 часов приводит к снижению выхода канамицин-устойчивых растений, более 25 часов приводит к сильному разрастанию агробактерии на поверхности семян при дальнейшем их совместном культивировании на твердой питательной среде и к невозможности прорастания большинства семян. Заявляемые пределы последующего совместного культивирования агробактерии и семян на твердой питательной среде без антибиотиков определяются следующим образом: инкубация семян менее 3 дней недостаточна для отбора канамицин-устойчивых растений, более 5 - приводит к гибели большинства проростков в связи с токсическим действием агробактерии.
Сущность изобретения, по мнению авторов, состоит в применении семян для трансформации однодольных, а также в модификации метода агробактериальной трансформации, заключающейся в сочетании нескольких способов: вакуумной инфильтрации эксплантов в суспензии агробактерии, совместным культивировании эксплантов и агробактерии, как в жидкой, так и на твердой питательной среде. Использование семян дает возможность избежать неконтролируемой сомаклональной изменчивости, позволяет получать трансгенные растения независимо от их морфогенетического потенциала, а также способствует сокращению сроков получения генетически модифицированных растений.
Кроме этого, полученные растения обладают более высокой жизнеспособностью по сравнению с регенерированными из каллусных культур.
Краткое описание фигур чертежей:
На фигурах 1 и 2 показан ПЦР-анализ ДНК растений пшеницы, прошедших вакуумную инфильтрацию в суспензии агробактерии при -0,8 атм, в течение 40 минут с последующим переводом на качалку (перемешиванием) в течение 23 часов, высаживанием на твердую питательную среду и культивированием в течение соответственно 3 и 5 суток без антибиотиков, затем добавляя антибиотики совместно в следующих концентрациях: цефотаксим - 300 мг/л - для элиминации Agrobacterium tumefaciens, канамицин - 50 мг/л - для отбора канамицин-устойчивых растений.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Семена пшеницы сорта «Энита» обрабатывают в суспензии Agrobacterium tumefaciens посредством вакуумной инфильтрации при -0,7 атм в течение 30 минут с последующим переводом на качалку (перемешиванием) в течение 23 часов, высаживанием на твердую питательную среду и культивированием в течение 3 суток без антибиотиков, затем добавляя антибиотики совместно в следующих концентрациях: цефотаксим - 300 мг/л для элиминации Agrobacterium tumefaciens, канамицин - 50 мг/л для отбора канамицин-устойчивых растений. Перед трансформацией суспензионную культуру Agrobacterium tumefaciens наращивают в течение 24 часов при +25°С на качалке с круговым вращением (амплитуда 5-10 см, скорость вращения 100 об/мин). После чего ее разбавляют жидкой питательной средой с содержанием макро- и микросолей по Мурасиге-Скуга с добавлением 120 мг/л аспарагина, 20 мг/л аскорбиновой кислоты, 100 мг/л мезо-инозита, без добавления гормонов (МС1). Перед трансформацией в суспензионную культуру агробактерии добавляют экстракт из листьев табака. Для приготовления экстракта табака листья пробирочных растений мелко измельчают, заливают жидкой питательной средой МС1 и выдерживают в течение 2 часов.
Выращивание агробактерии проводят при 26°С на агаризованной среде LB (бакто-триптон (пептон) - 10 г/л, бакто-дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl - 10 г/л, агар-агар - 15 г/л, рН 7,5) с антибиотиками (300 мг/л стрептомицина и 100 мг/л карбеницеллина). При получении суспензионной культуры агар из среды исключают.
Растения, устойчивые к канамицину (не побелевшие), высаживают в почву и проверяют на наличие трансгена методом ПЦР с праймерами к генам nptII и ipt. Проверка проводилась на 20-й день после начала эксперимента. ДНК выделяют методом, описанным Moller et al. (Moller Е.М., Bahnurg G., Sandermann H., Jeiger H.H. A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentos fungi fruit bodies and infected plant tosscus. // Nucl. Acid. Res. - 1992 - v.20 - is.22 - p.6115-6116).
Из 100 мг молодых листьев. Для анализа трансгенных растений методом ПЦР применяют следующие пары праймеров TMR-1 5'-GGA-AGC-GGA-CGA-CCA-ACA-GTG-GAA-3', TMR-2 5'-CTC-CTG-AGC-GAT-CCC-ATT-AAT-CAA-3' (для гена ipt); NPT D 5'-GTC-GAG-AAG-GCT-ATT-CGG-CTA-3', NPT-R 5'-CCA-CCA-TGA-TAT-TCG-GCA-AG-3' (для гена nptII). Праймеры были изготовлены НПФ «Литех». Амплификацию проводят в программируемом термоцикле МС2 (ЗАО «ДНК-Технология», Москва). Реакционная смесь объемом 30 мкл содержала 67 мМ трис-HCl (рН 8,6), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 0,0025% Tween - 20; 0,0025% Np40, 0,0125% крезолового красного, 6,25% глицерина, 0,2 мМ каждого dNTP, 0,25 мМ праймера, 2 ед. термостабильной Tag-ДНК-полимеразы (НПО «СИЛЕКС М», Москва), 30 нг выделенной ДНК. На реакционную смесь наслаивают 20 мкл минерального масла. Были выбраны следующие условия амплификации: денатурация 94°С/2 мин; 5 циклов: денатурация 94°С/20 с, отжиг 65°С/10 с, элонгация 72°С/10 с; 35 циклов: денатурация - 94°С/5 с, отжиг 65°С/5 с, элонгация 72°С/5 с; 1 цикл: элонгация 72°С/2 мин. Продукты реакции (10 мкл из реакционной смеси) разделяют электрофорезом в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием в ТВЕ - буфере. Для определения длины фрагментов использовали маркер М3 (123 bp DNA Ladder) "GIBCO BRL". Для проверки чистоты реактивов в качестве отрицательного контроля (К-) в реакционную смесь вместо исследуемой ДНК добавляли 5 мкл воды.
Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.
Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.
Пример 4. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 5. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 6. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 7. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 8. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 9. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 10. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 11. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 12. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 13. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм.
Пример 14. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.
Пример 15. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.
Пример 16. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 17. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 18. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 19. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 20. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 21. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 22. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 23. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 24. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 25. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.
Пример 26. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.
Пример 27. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов.
Пример 28. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 29. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 30. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 25 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 31. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм.
Пример 32. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.
Пример 33. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.
Пример 34. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 35. Проводят аналогично примеру 5, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 36. Проводят аналогично примеру 6, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 37. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 38. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 39. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 40. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 41. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 42. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,9 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 43. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм.
Пример 44. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут.
Пример 45. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут.
Пример 46. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 47. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 48. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 49. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 50. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 51. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов.
Пример 52. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 53. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 40 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Пример 54. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что используют семена овсяницы красной, семена обрабатывают в суспензии агробактерии посредством вакуумной инфильтрации при -0,8 атм, вакуумную инфильтрацию проводят в течение 50 минут, инкубацию эксплантов в суспензии агробактерии в условиях нормального давления при перемешивании проводят в течение 24 часов, семена и агробактерию совместно культивируют на твердой питательной среде в течение 5 суток.
Результаты, представленные в примерах 1-54, являются стабильно воспроизводимыми и математически усредненными и приведены в Таблице.
| Таблица 1 Получение трансгенных растений пшеницы и овсяницы путем инкубации семян в суспензии Agrobacterium tumefaciens в условиях вакуумной инфильтрации и последующего перемешивания на качалке | |||||||||
| № примера | Растение | Давление (атм) | Время обработки в условиях вакуума | Время инкубации семян в суспензии агробактерии в условиях нормального давления | Время культивирования на твердой питательной среде, сутки | Кол-во семян | Кол-во канамицин-устойчивых растений | ПЦР-положительные | % трансформации |
| 1 | пшеница | -0,7 | 30 | 23 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 2 | пшеница | -0,7 | 40 | 23 | 3 | 150 | 5 | 5 | 3,3 |
| 3 | пшеница | -0,7 | 50 | 23 | 3 | 150 | 6 | 6 | 4 |
| 4 | пшеница | -0,7 | 30 | 23 | 5 | 105 | 4 | 4 | 3,8 |
| 5 | пшеница | -0,7 | 40 | 23 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 6 | пшеница | -0,7 | 50 | 23 | 5 | 150 | 5 | 5 | 3,3 |
| 7 | пшеница | -0,7 | 30 | 24 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 8 | пшеница | -0,7 | 40 | 24 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 9 | пшеница | -0,7 | 50 | 24 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 10 | пшеница | -0,7 | 30 | 24 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 11 | пшеница | -0,7 | 40 | 24 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 12 | пшеница | -0,7 | 50 | 24 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 13 | пшеница | -0,8 | 30 | 23 | 3 | 150 | 7 | 7 | 4,7 |
| 14 | пшеница | -0,8 | 40 | 23 | 3 | 100 | 5 | 5 | 5 |
| 15 | пшеница | -0,8 | 50 | 23 | 3 | 150 | 6 | 6 | 4 |
| 16 | пшеница | -0,8 | 30 | 23 | 5 | 100 | 7 | 3 | 6,7 |
| 17 | пшеница | -0,8 | 40 | 23 | 5 | 105 | 10 | 10 | 9,6 |
| 18 | пшеница | -0,8 | 50 | 23 | 5 | 150 | 10 | 10 | 6,7 |
| 19 | пшеница | -0,8 | 30 | 24 | 3 | 100 | 5 | 5 | 5 |
| 20 | пшеница | -0,8 | 40 | 24 | 3 | 150 | 7 | 7 | 4,7 |
| 21 | пшеница | -0,8 | 50 | 24 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 22 | пшеница | -0,8 | 30 | 24 | 5 | 100 | 8 | 8 | 8 |
| 23 | пшеница | -0,8 | 40 | 24 | 5 | 100 | 9 | 9 | 9 |
| 24 | пшеница | -0,8 | 50 | 24 | 5 | 100 | 8 | 8 | 8 |
| 25 | пшеница | -0,8 | 30 | 25 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 26 | пшеница | -0,8 | 40 | 25 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 27 | пшеница | -0,8 | 50 | 25 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 28 | пшеница | -0,8 | 30 | 25 | 5 | 100 | 6 | 6 | 6 |
| 29 | пшеница | -0,8 | 40 | 25 | 5 | 100 | 6 | 6 | 6 |
| 30 | пшеница | -0,8 | 50 | 25 | 5 | 100 | 5 | 5 | 5 |
| 31 | пшеница | -0,9 | 30 | 23 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 32 | пшеница | -0,9 | 40 | 23 | 3 | 150 | 5 | 5 | 3,3 |
| 33 | пшеница | -0,9 | 50 | 23 | 3 | 150 | 6 | 6 | 4 |
| 34 | пшеница | -0,9 | 30 | 23 | 5 | 105 | 10 | 10 | 9,6 |
| 35 | пшеница | -0,9 | 40 | 23 | 5 | 100 | 7 | 3 | 6,7 |
| 36 | пшеница | -0,9 | 50 | 23 | 5 | 150 | 10 | 10 | 6,7 |
| 37 | пшеница | -0,9 | 30 | 24 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 38 | пшеница | -0,9 | 40 | 24 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 39 | пшеница | -0,9 | 50 | 24 | 3 | 100 | 5 | 5 | 5 |
| 40 | пшеница | -0,9 | 30 | 24 | 5 | 100 | 6 | 6 | 6 |
| 41 | пшеница | -0,9 | 40 | 24 | 5 | 100 | 5 | 5 | 5 |
| 42 | пшеница | -0,9 | 50 | 24 | 5 | 100 | 5 | 5 | 5 |
| 43 | овсяница | -0,8 | 30 | 23 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 44 | овсяница | -0,8 | 40 | 23 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 45 | овсяница | -0,8 | 50 | 23 | 3 | 150 | 5 | 5 | 3,3 |
| 46 | овсяница | -0,8 | 30 | 23 | 5 | 150 | 5 | 5 | 3,3 |
| 47 | овсяница | -0,8 | 40 | 23 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 48 | овсяница | -0,8 | 50 | 23 | 5 | 150 | 6 | 6 | 4 |
| 49 | овсяница | -0,8 | 30 | 24 | 3 | 100 | 3 | 3 | 3 |
| 50 | овсяница | -0,8 | 40 | 24 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 51 | овсяница | -0,8 | 50 | 24 | 3 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 52 | овсяница | -0,8 | 30 | 24 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 53 | овсяница | -0,8 | 40 | 24 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
| 54 | овсяница | -0,8 | 50 | 24 | 5 | 100 | 4 | 4 | 4 |
Заявленный способ показывает, что использование семян дает возможность получать трансгенные растения в короткие сроки: проростки на наличие трансгена анализируют на 20-й день после начала эксперимента. Заявленный способ предотвращает появление неконтролируемой сомаклональной изменчивости, а также снимает зависимость от морфогенетического потенциала растения.
Кроме того, неожиданным результатом является увеличение выхода трансгенных растений от 3 до 9,6% для пшеницы и до 4% для овсяницы.
Способ получения трансгенных однодольных растений, заключающийся в обработке эксплантов вакуумной инфильтрацией в суспензии штамма Agrobacterium tumefaciens GV3850, содержащего селективный ген nptII и целевой ген ipt, причем суспензия Agrobacterium предварительно активизирована экстрактом из листьев табака с последующим инкубированием эксплантов в суспензии Agrobacterium в условиях нормального давления при перемешивании, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют семена, вакуумную инфильтрацию проводят при (-0,7)÷(-0,9) атм в течение 30-50 мин, инкубацию семян в суспензии Agrobacterium - в течение 23-25 ч, выращивание проростков на твердой питательной среде - в течение 3-5 сут без антибиотиков с последующим совместным добавлением канамицина и цефотаксима в концентрациях соответственно 50 мг/л и 300 мг/л для отбора канамицин-устойчивых растений и элиминации Agrobacterium.
