Способ культивирования изолированных пыльников растений ярового рапса
Владельцы патента RU 2314680:
Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский и проектно-технологический институт рапса (ГНУ ВНИПТИР) (RU)
Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для создания нового исходного селекционного материала. Собранные бутоны растений рапса помещают в растворы фитогормонов и выдерживают в холодильнике в течение 2-3 суток при температуре 4-5°С. Такая обработка позволяет увеличить выход эмбриоидных структур. В качестве фитогормонов могут быть использованы, например, 2,4-Д, кинетин или гиббереллиновая кислота (ГК). При использовании 2,4-Д в концентрации не менее 1,0 мг/л наибольший выход эмбриоидов составляет 6,6%. При использовании кинетина в концентрации 0,4-0,6 мг/л выход эмбриоидов составляет 5,5%. Обработка бутонов ГК стимулирует выход эмбриоидов до 7,4% в концентрации до 0,1 мг/л. 3 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл.
Изобретение относится к биологии и может быть использовано в эмбриологии, генетике и биотехнологии при культивировании пыльников гибридных растений с целью получения константных гибридных линий для создания нового исходного селекционного материала.
Известен способ культивирования пыльников, при котором соцветия, собранные с растений рапса, помещали в водопроводную воду и ставили в темноту на 14 суток в холодильник при температуре 4°С (Dunwel J.M., Cornish M. Influence of preculture varifbles on microspore embryo production in Brassica napus ssp. oleifera cv. Duplo/Annals of Botany. - 1986. Vol.56. P.281-289).
Недостатком этого способа является то, что пыльники, изолируемые из таких бутонов, культивируемые на питательных средах, формируют малое количество эмбриоидов, а длительный период хранения бутонов приводит к снижению выхода эмбриоидов из пыльников.
Известен способ получения гаплоидных растений ярового рапса, включающий отбор ценных донорных растений, сбор бутонов, соцветий, обработку пониженной положительной температурой 4°С в чашках Петри с раствором сахарозы 0.35М и 800 мг L-глютамином в течение 1-3 суток, стерилизацию поверхности бутонов в 7% водном растворе гипохлорита натрия, трехкратную промывку стерильной дистиллированной водой, затем вычленяют пыльники из бутонов и помещают на агаризованную среду для эмбриоидогенеза. Модифицированная питательная среда Nitsch, Nitsch (1967), содержащая фитогормоны: 3 мг/л 2,4-Д, 3 мг/л НУК и 3 мг/л 6-БАП с добавлением 7% сахарозы и 1% глюкозы, L-глютамина 800 мг/л, L-серина 100 мг/л, картофельный экстракт Difco 2,5 г/л, инкубация в темноте при 30°С в течение 14 суток с последующим культивированием при 26°С, через 3-4 недели на поверхности появляются матовые вторичные структуры (эмбриоиды), пыльники с эбриоидами переносили в условия 16 часового освещения, через 3-4 суток зеленые эмбриоиды пересаживают на безгормональную среду MS (Murashige and Skoog) с уменьшенным содержанием сахарозы до 1%. По мере развития эмбриоидов в растения-регенеранты на этой среде и появления 2-3 настоящих листьев и корней их пересаживали в стерильный компост (Lichter R.Anther culture of Brassica napus in a liquid culture medium /Z.Pflanzenphysiol. 1981. Vol.103. P.229-237).
Однако и в этой работе наблюдается низкий выход эмбриоидов в культуре пыльников ярового рапса в условиях in vitro.
Наиболее близким к заявленному является способ культивирования пыльников, при котором на бутоны воздействуют пониженными положительными температурами (4-5°С) в течение 4-7 суток, пыльники помещают на искусственную питательную среду и выращивают до образования эмбриоидов (Методические рекомендации по получению андроклинных растений ярового рапса. - М.: Типография Россельхозакадемия, 1999. - 23 с.).
Однако и данный способ не позволяет значительно увеличить выход эмбриоидов.
Целью изобретения является увеличение выхода эмбриоидных структур.
Поставленная цель достигается тем, что бутоны размером 1,5-3,5 мм помещают в водные растворы фитогормонов, в качестве которых может быть использована или 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), или кинетин, или гиббериллиновая кислота (ГК).
В ходе проведения патентного поиска автором не обнаружено совокупности аналогичных признаков.
Не является очевидным для достижения цели изобретения использование в качестве предобработки (хранение) бутонов в интервале пониженных положительных температур (4-5°С) в растворах предложенных фитогормонов в течение 2-3 суток перед изолированием пыльников из бутонов.
Изобретение иллюстрируется таблицей N 1 и графиками 1, 2, 3.
На графике 1 показано влияние предобработки бутонов в различных концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/л 2,4-Д на выход (сбор) эмбриоидов в культуре пыльников ярового рапса в условиях in vitro.
На графике 2 показано влияние предобработки бутонов в различных концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/л кинетина на выход (сбор) эмбриоидов в культуре пыльников ярового рапса в условиях in vitro.
На графике 3 показано влияние предобработки бутонов в различных концентрациях от 0,1 до 1,0 мг/л ГК на выход (сбор) эмбриоидов в культуре пыльников ярового рапса в условиях in vitro.
Способ осуществляют следующим образом.
Для получения гаплоидных растений ярового рапса использовали в качестве материнских, маточных, донорных растений сортов Karat (Канада), Наппа (Швеция), К-4285 (Чехословакия). Растения выращивали в контролируемых условиях теплицы при температурах 15-20°С днем, 10-15°С ночью в 16 часовом освещении. С цветущих растений собирали бутоны размерами 1,5-3,5 мм и по 40-60 штук помещали в чашки Петри диаметром 60 мм, в которые заранее наливали 2 мл водного раствора одного из фитогормона в концентрациях 0,1, 0,5 и 1,0 мг/л. Стерилизовали бутоны, например, в 5-10% водном растворе domestos в течение 7 минут с последующим 3-5 кратным промыванием стерильной дистиллированной водой. Пыльники извлекали из бутонов и по 18 штук помещали в пробирки на агаризованную индукционную питательную по прописи среду 1 (табл.2). Материал инкубировали в темноте до получения вторичных структур (эмбриоидов) матового цвета, например, 3-4 недели при начальном культивировании пыльников в температуре 35°С в течение 2-3 суток с последующим инкубированием в условиях 26°С. Развившиеся из пыльников эмбриоиды переносили на свет до появления хлорофилла, затем пересаживали на регенерационную среду, т.е. среду 2 по прописи (таблица 2). Пересадку проростков в почву (смесь почвы и песка в соотношении 3:1) проводили при формировании 2-3 листьев и корневой системы и предварительно выращивали в течение 2 недель при оптимальных условиях влажности воздуха, например под стеклянными стаканами, для лучшей акклиматизации проростков. Периодически растения поливали и рыхлили землю, в фазу цветения изолировали соцветия, а по окончании вегетационного периода срезали и обмолачивали.
Пример использования фитогормонов. Обработка бутонов раствором 2,4-Д во всех концентрациях стимулирует образование эмбриоидов (табл.1). Максимальный их выход 6,6% получен на пыльниках сорта Наппа при выдерживании бутонов в растворе 1,0 мг/л. У других генотипов при увеличении концентрации фитогормона сохранялась тенденция повышения выхода эмбриоидов (график 1).
Предварительная обработка бутонов растворами кинетина (табл.1), особенно в концентрации 0,5 мг/л, увеличивала формирование эмбриоидов на пыльниках сорта Наппа 1,8 по прототипу до 3,5% в варианте, у образца К-4285 с 2,1 по прототипу до 3,5%. Максимальный выход эмбриоидов получен на сорте Karat, с 0,9 (прототип) до 5,5% после обработки бутонов в концентрации 0,5 мг/л. Повышение концентрации фитогормона до 1 мг/л ингибировало их образование (график 2).
Обработка бутонов раствором ГК в минимальной (0,1 мг/л) концентрации стимулировала индукцию эмбриоидов у всех изучаемых сортов (табл.1). Максимальное образование эмбриоидов получили у сорта Karat с 0,9 (прототип) до 7,4% в лучшем варианте, у образца К-4285 с 1,8 в контроле (прототипе) до 5,3% в варианте. Увеличение концентрации ГК ингибировало индукцию эбриоидов у всех генотипов (график 3).
| Таблица 1 | ||||||||||
| Зависимость частоты выхода эмбриоидов (%) от концентраций фитогормонов (мг/л) | ||||||||||
| Генотип | Вода (прототип) | 2,4-Д | Кинетин | Гиббереллиновая кислота | ||||||
| 0,1 | 0,5 | 1,0 | 0,1 | 0,5 | 1,0 | 0,1 | 0,5 | 1,0 | ||
| Karat | 0,9 | 2,7 | 5,5 | 5,6 | 2,7 | 5,5 | 3,9 | 7,4 | 5,4 | 1,8 |
| Hanna | 1,8 | 2,8 | 5,6 | 6,6 | 2,0 | 3,5 | 2,0 | 5,5 | 5,1 | 3,3 |
| К-4285 | 1,8 | 2,5 | 4,1 | 4,3 | 2,1 | 3,7 | 2,7 | 5,3 | 4.3 | 2,8 |
Оценивая в целом эффективность использования фитогормонов для проведения предобработки бутонов ярового рапса в культуре пыльников, можно сделать вывод, что наибольший эффект получен при использовании ГК, затем 2,4-Д и кинетина.
| Таблица 2 | ||
| Состав питательных сред, используемых в культуре пыльников ярового рапса | ||
| Компоненты | Концентрации, мг/л | |
| среда 1 | среда 2 | |
| 1 | 2 | 3 |
| NaH2PO4·H2O | 150 | - |
| KNO3 | 2500 | 1900 |
| NH4NO3 | - | 1650 |
| (NH4)2SO4 | 134 | 170 |
| MgSO4·7H2O | 250 | 370 |
| CaCl2·2H2O | 750 | 440 |
| Н3ВО3 | 3,0 | 6,3 |
| MnSO4·H2O | 10,0 | - |
| MnSO4·4H2O | - | 22,3 |
| CoCl2·6Н2О | 0,025 | 0,025 |
| CuSO4·5H2O | 0,025 | 0,025 |
| ZnSO4·7H2O | 2,0 | 8,6 |
| Na2MoO4·2H2O | 0,25 | 0,25 |
| KI | 0,75 | 0,83 |
| Fe-хелат: | ||
| FeSO4·7H2O | 27,8 | 27,8 |
| Na2ЭДТА·2H2O | 37,3 | 37,3 |
| Тиамин-HCl | 10,0 | 10,0 |
| Пиридоксин-HCl | 1,0 | 1,0 |
| Никотиновая кислота | 1,0 | 1,0 |
| Мезоинозит | 100,0 | 100,0 |
| L-глутамин | 800,0 | - |
| L-серин | 100,0 | - |
| 2,4-Д | 0,1 | - |
| НУК | 0,1 | - |
| Сахароза | 10-12% | 2% |
| рН | 5,6-5,8 | 5,6-5,8 |
1. Способ культивирования изолированных пыльников растений ярового рапса путем помещения пыльников на искусственную питательную среду и выращивания до образования эмбриоидов, отличающийся тем, что перед помещением пыльников на питательную среду бутоны помещают в водный раствор гиббереллиновой кислоты, или в водный раствор 2,4-дихлорфеноуксусной кислоты, или в водный раствор кинетина и выдерживают в течение 2-3 суток в холодильнике при температуре 4-5°С.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация гиббереллиновой кислоты составляет до 0,1 мг/л.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация 2,4-дихлорфеноуксусной кислоты составляет не менее 1,0 мг/л.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрация кинетина составляет 0,4-0,6 мг/л.
