Способ получения толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии. Проводят культивирование каллуса однодольных растений в течение одного пассажа при концентрации кадмия 5-10 мг/л, цинка 100-200 мг/л, свинца 325-650 мг/л. Затем проводят регенерацию и укоренение на среде при концентрации кадмия 10-18 мг/л, цинка 200-300 мг/л, свинца 650-1100 мг/л. Изобретение позволяет эффективно получить растения-регенеранты, обладающие повышенной комплексной устойчивостью к тяжелым металлам. 1 табл.

 

Область применения

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к клеточной инженерии, и может быть использовано как в городском хозяйстве, так и для фундаментальных исследований в области общей экологии, физиологии и биотехнологии растений.

Уровень техники

Действие тяжелых металлов на культивируемые клетки растений мало исследовано, отсутствуют исследования по комплексному воздействию тяжелых металлов, а именно кадмия, свинца и цинка.

Известен способ выделения клеточной линии дурмана, устойчивой к хлориду кадмия, устойчивость к кадмию сохранилась у клеток дурмана после 400 генераций в неселективных условиях (Jackson P.J., Roth E.J., McClure P.R., Naranjo C.M. Selection, isolation and characterization of cadmium-resistant Datura innoria suspension culture // Plant Phys., 1984, v.75, P.914-918).

Еще в одном способе были получены клетки, устойчивые к ионам цинка (Gilissen L.J.W., van Staveren M. J. Zinc-resistant cell lines of Haplopapput gracilis// J.plant Physiol. v.125, P.95-103, 1986).

Недостатком данных методов являлось использование в этих работах суспензионных культур и длительной селекции.

Известен способ получения растений, устойчивых к меди, состоящий из получения каллуса из семян, затем культивирование каллуса проводят в течение 2-3 пассажей на среде Мурасиге-Скуга с 1-3 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой и с 100-200 мг/ л меди до получения регенерирующих каллусов, затем проводят регенерацию на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/ л меди и укоренение растений на среде Мурасиге-Скуга с 100-150 мг/ л меди (Гладков Е.А., Долгих Ю.И., Бирюков В.В., Гладкова О.В. Патент РФ №2260937 «Способ получения толерантных к ионам меди однодольных растений in vitro»).

Недостатком данного метода являлось относительно длительное культивирование.

Задачей нашего метода было разработать способ получения толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro, а именно получить устойчивые растения.

Раскрытие изобретения

Данная задача была решена созданием нового способа толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro, состоящего из получения каллуса из семян, культивирования, регенерации и укоренения на питательной среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование каллуса проводят в течение одного пассажа при концентрации кадмия 5-10 мг/л, цинка 100-200 мг/л, свинца 325-650 мг/л, затем проводят регенерацию и укоренение на среде при концентрации кадмия 10-18 мг/л, цинка 200-300 мг/л, свинца 650-1100 мг/л.

Сущность изобретения

По мнению авторов, сущность нашего метода заключается в коротком периоде культивирования и использовании нескольких токсикантов на каждом периоде культивирования, что позволяет сохранить регенерационную способность клеток и приводит к получению устойчивых растений.

Вероятно, адаптация растений к избыткам металлов связана с задержкой тяжелых металлов за пределами метаболически важных органов и со снижением активности избыточных ионов благодаря переводу их в физиологически инертные формы и созданием альтернативных реакций обмена.

Заявленные пределы определены следующим образом: при концентрации на стадии культивирования кадмия более 10 мг/л, цинка более 200 мг/л, свинца более 650 мг/л прирост каллуса незначительный и большая часть каллусов погибает, концентрации кадмия менее 5 мг/л, цинка менее 100 мг/л, свинца менее 325 мг/л не являются эффективными.

При концентрации тяжелых металлов на стадии регенерации и укоренения кадмия выше 18 мг/л кадмия, цинка выше 300 мг/л, свинца выше 1100 мг/л наблюдалась крайне низкая регенерационная способность и незначительное укоренение. Концентрация свинца -1300 мг/л, кадмия - 20 мг/л, цинка - 350 мг/л являлась практически летальной на стадии регенерации и укоренения. Концентрации кадмия менее 10 мг/л, цинка менее 200 мг/л, свинца менее 650 мг/л не являются существенными для городских условий.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами, результаты по примерам представлены в таблице.

Пример 1.

Первичный каллус получают из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга, концентрация 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты составляла 3 мг/л. Культивирование каллуса овсяницы красной (Festuca rubra) проводят в течение 1 пассажа при концентрации кадмия - 5 мг/л, цинка - 100 мг/л, свинца - 325 мг/ л. Первичный каллус массой 20 мг высаживают на селективную среду, содержащую в качестве токсиканта - тяжелые металлы. После культивирования в течение 1 месяца отбирают светлые экспланты, увеличившиеся в размере. Продолжительность пассажа составляла 1 месяц. При культивировании некоторые каллусные клетки существенно отличаются друг от друга по окраске (часть каллусов приобретал более темную окраску) и по росту (интенсивность роста отдельных клеток различалась в полтора раза). Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л.

Пример 2.

Первичный каллус получают из семян на агаризованной среде Мурасиге-Скуга, концентрация 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты составляла 3 мг/л. Культивирование каллуса полевицы побегоносной (Agrostis stolonifera) проводят в течение 1 пассажа при концентрации кадмия - 7 мг/л, цинка - 150 мг/л, свинца - 500 мг/л. При культивировании некоторые каллусные клетки, так же как и у овсяницы, существенно отличаются друг от друга по окраске и по росту. Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л.

Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, с той лишь разницей, что культивирование овсяницы красной проводят при концентрации кадмия - 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л. Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 14 мг/л, цинка - 250 мг/л, свинца - 950 мг/л.

Пример 4. Проводят аналогично примеру 2, с той лишь разницей, что культивирование полевицы побегоносной проводят при концентрации кадмия - 10 мг/л, цинка - 200 мг/л, свинца - 650 мг/л. Регенерацию и укоренение проводят при концентрации кадмия 18 мг/л, цинка - 300 мг/л, свинца - 1100 мг/л.

Таблица 1.
Влияние комплексного действия тяжелых металлов на рост и регенерационную способность каллусных тканей
№ при Мера	Концентрация кадмия на стадиях культивирования/регенерации и укоренения, мг/л	Концентрация цинка на стадиях культивирования/регенерации и укоренения, мг/л	Концентрация свинца на стадиях культивирования/регенерации и укоренения, мг/л	Процент прироста каллуса по отношению к контролю	% регенерации по отношению к контролю	% укоренения по отношению к контролю
1	5/10	100/200	325/650	58,6±5,0	40,0±2,6	50±5,0
2	7/10	150/200	500/650	50,0±3,3	22,9±1,6	50,0±4,0
3	10/14	200/250	650/950	33,0±1,8	14,0±2,0	43,3±2,8
4	10/18	200/300	650/1100	33,0±1,8	10,0±0,8	33,3±3,0

Примечание: прирост каллуса в контроле - 5,8 раз, регенерация в контроле составляла - 90%, укоренение - 86%.

Обсуждение результатов

Техническим результатом изобретения является - прирост каллусной ткани составлял от 33,0% до 58,6%; регенерационная способность от 10,0% до 40,0%; укоренение 33,0%-50,0%. Результаты изобретения показывают высокую эффективность данного метода, который позволил получить высокий процент регенерации и растения, обладающие комплексной устойчивостью.

Для проверки устойчивости к высоким концентрациям тяжелых металлов регенераты полевицы были высажены в почву при содержании свинца - 650 мг/л, кадмия - 10 мг/л, цинка - 200 мг/л. 90% растений, полученных из устойчивых к тяжелым металлам клеток, росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве.

При концентрации кадмия - 18 мг/л кадмия, цинка - 300 мг/л, свинца - 1100 мг/л - 50% растений росли при этой дозе металла так же интенсивно, как в чистой почве.

Кроме того, неожиданным образом было показано, что при взаимодействии тяжелых металлов не всегда происходит усиление токсического действия, цинк уменьшает токсическое действие кадмия и свинца, но в то же время кадмий и свинец усиливают токсическое действие друг друга.

Т.о. большинство растений-регенерантов, полученных из устойчивых к тяжелым металлам клеточных линий, обладает повышенной комплексной устойчивостью.

Следовательно, данный метод можно рекомендовать для получения растений, устойчивых к комплексному воздействию токсикантов - солям кадмия, свинца и цинка.

Способ получения толерантных к комплексному воздействию тяжелых металлов однодольных растений in vitro, предусматривающий получение каллуса из семян, культивирование, регенерацию и укоренение на питательной среде Мурасиге-Скуга, причем культивирование каллуса проводят в течение одного пассажа при концентрации кадмия 5-10 мг/л, цинка 100-200 мг/л, свинца 325-650 мг/л, затем проводят регенерацию и укоренение на среде при концентрации кадмия 10-18 мг/л, цинка 200-300 мг/л, свинца 650-1100 мг/л.