Способ криосохранения in vitro меристем, изолированных из растений земляники садовой (fragaria l.)

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к сохранению генетических ресурсов вегетативно размножаемых растений, и может использоваться в садоводстве для создания криобанка оздоровленных клонов ценных сортов земляники садовой (Fragaria L.). Подготавливают растения - доноры меристем в течение 2-8 недель на твердой агаровой питательной среде, дополненной 5-10% сахарозы, а предкультивирование изолированных из них апексов проводят в присутствии 0,79-0,81М сахарозы и 0,5-1,0 мг/л паклобутразола ([1-(4-хлорофенил)-4,4-диметил-2(1,2,4-триазол-1-ил) пентан-3-ол]) перед высушиванием и быстрым замораживанием. Изобретение позволяет эффективно осуществить криосохранение земляники садовой и посткриогенную регенерацию растений земляники. 2 ил., 2 табл.

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к сохранению генетических ресурсов вегетативно размножаемых растений, и может использоваться в садоводстве для создания криобанка оздоровленных клонов ценных сортов земляники садовой (Fragaria L.).

Долговременное хранение изолированных меристем в криобанках - один из перспективных методов сохранения генетических ресурсов вегетативно размножаемых растений, в частности оздоровленных клонов ценных сортов ягодных и плодовых культур. Использование эффективного и современного способа криосохранения меристем земляники, позволяющего отказаться от программируемых замораживателей, необходимых для медленного замораживания растительного материала, может интенсифицировать создание криобанков ценных отечественных и районированных в России иностранных сортов земляники садовой.

Известен способ криосохранения (О.Н.Высоцкая, А.С.Попов. Способ криосохранения меристем, изолированных из растений земляники садовой (Fragaria L.) in vitro. Патент на изобретение №2220563, приоритет от 24.05.2002.), где использован прием медленного криогенного охлаждения образцов с помощью программируемого замораживателя.

Этот способ включает последовательно выполняемые этапы: 1) закаливание растений-доноров 1-2 месяца на твердой агаризованной питательной среде, дополненной 6% сахарозой или глюкозой; 2) обработку изолированных меристем перед замораживанием - 18-19 часов на жидкой питательной среде с криопротекторами - 6% сахарозы или глюкозы и 5-7% диметилсульфоксида (ДМСО), 3) медленное охлаждение апексов в криоампулах, заполненных раствором 6% сахарозы или глюкозы и 7-9% ДМСО, содержащим лед, в программном замораживателе по оригинальной программе со скоростью 0,3-0,33°С/мин до -38-40°С, затем со скоростью 9-11°С/мин до -75°С с погружением в жидкий азот (-196°С) на срок не менее часа; 4) посткриогенное восстановление растений из меристем, первый этап которого проходит на модифицированной питательной среде с 0,5-1 мг/л бензиламинопурина и 3%-ными глюкозой или сахарозой при 19-20°С, 16-часовом дне и освещенности 0,5-1 клк. Данный способ позволяет после криогенного хранения восстанавливать растения различных сортов из 62,5±9,0% криосохраненных меристем земляники.

Однако для осуществления этого метода необходимо использовать программируемый замораживатель, что существенно ограничивает применение этого способа на практике. Именно это ограничение является существенным недостатком указанного способа.

Известен способ криосохранения апексов земляники садовой (Clavero-Ramhrez, J.Gσlvez-Farfσn, J.M.Lypez-Aranda, M.E.Gonzσlez-Benito Apex cryopreservation of several strawberry by two encapsulation-dehydration methods // CryoLetters, 2005 V.26, №1, Р.17-24), в котором не использовали программируемый замораживатель, а применяли прием быстрого криогенного замораживания апексов, заключенных в альгинатные капсулы.

В этом способе растения земляники культивировали in vitro и без предварительной подготовки растений-доноров из них сразу выделяли меристематические верхушки (апексы). Затем апексы инкапсулировали альгинатом кальция, предкультивировали на среде, дополненной 0,8 М сахарозы или 0,4 М сахарозы и 2 М глицерина, высушивали и быстро замораживали в жидком азоте. После сохранения в жидком азоте из 23-63% апексов семи клонов культурных и дикорастущих видов земляники (Fragaria L.) получали регенеранты.

С нашей точки зрения, недостатком этого способа является необходимость создания защитного слоя из альгината кальция с помощью инкапсуляции апексов, которая представляет собой длительный трудоемкий процесс. Наши попытки использовать альгинатное покрытие для защиты изолированных апексов в процессе высушивания и замораживания не привели к положительным результатам (Приложение, фиг.1, фиг.2). Кроме того, в описании метода отсутствует упоминание этапа подготовки растений-доноров меристем к криосохранению, который позволяет увеличить уровень криоустойчивости сохраняемого материала и процент посткриогенной регенерации растений.

Наиболее близким технологическим решением, из известных нам, является способ криосохранения аксилярных меристем растений горечавки (Mitsuteru Suzuki, Masaya Ishikawa, Tomoya Akihama A novel preculture method for the induction of dessication tolerance in gentian axillary buds for cryopreservation // Plant Science 1998, V.135. - P.69-76), в котором для замораживания образцов не используют программируемый замораживатель, а изолированные аксилярные почки без альгинатного покрытия быстро замораживают в жидком азоте.

В данном способе, который можно считать прототипом, аксилярные почки изолировали из растений горечавки (Gentiana scabra Bunge, var. Buergeri Maxim.), культивированных in vitro в течение 8-13 дней при 25°С и 16-часовом дне на 1/2 питательной среды Мурасиге и Скуга (МС), дополненной 0,1 М сахарозы. Изолированные почки предкультивировали один день на агаровой среде МС, дополненной 0,4 М сахарозы, а затем один день на среде, дополненной 0,7 М сахарозы. После этого почки, без инкапсуляции, высушивали в потоке воздуха до состояния 10% влажности (рассчитанной от сырого веса) и затем погружали в жидкий азот в центрифужных пробирках. Для рекультивирования растений размороженные почки переносили на полную питательную среду МС и после 20 дней культивирования регистрировали количество регенерированных растений. Данный метод позволял получить 78-90% посткриогенных регенерантов горечавки.

Недостатком данного способа мы считаем то, что он не обеспечивает достаточно высокого уровня криоустойчивости, необходимого для успешного перенесения глубокого криогенного стресса меристемами земляники.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является создание нового способа криосохранения меристем земляники, который обеспечит стабильное получение посткриогенных регенерантов различных сортов земляники садовой из каждой криоампулы, содержащей не менее 20 апикальных верхушек, без использования программируемого замораживателя и инкапсуляции апексов альгинатом кальция. Поставленная задача решается тем, что в способе криосохранения методом быстрого замораживания меристем, изолированных из растений земляники садовой (Fragaria L.) in vitro, заключающемся в подготовке растений - доноров меристем к замораживанию, выделении апексов, предкультивировании апексов, прямом погружении криоампул с апексами в жидкий азот, хранении ампул с меристемами в жидком азоте, оттаивании апексов и посткриогенной регенерации растений из меристем, проводят последовательно:

закаливание растений - доноров на твердой агаризованной питательной среде, дополненной 5-10% сахарозой в течение 2-8 недель,

предкультивирование апексов 46-50 часов на агаризованной питательной среде, дополненной 0,79-0,81 М сахарозы и 0,5-1,0 мг/л паклобутразола ([1-(4-хлорофенил)-4,4-диметил-2(1,2,4-триазол-1-ил)пентан-3-ол], фирмы Sigma-Aldrich),

высушивание, в потоке стерильного воздуха, апексов в течение 3-4 часов для удаления 70-80% воды,

погружение криоампул с апексами в жидкий азот (-196°С) на срок не менее часа,

оттаивание сначала при +38-40°С 1-5 сек в водяной бане, а затем при комнатной температуре на стерильной фильтровальной бумаге,

посткриогенное восстановление растений из оттаявших меристем на модифицированной питательной среде с 0,5 мг/л бензиламинопурина и 3% сахаров (сахароза + глюкоза) при 19-20°С, 16-часовом дне и освещенности 0,5-1 клк.

Суть настоящего изобретения в том, что предлагаемый способ криосохранения in vitro меристем, изолированных из растений земляники садовой (Fragaria L.), представляет собой новый способ замораживания растительного материала, использующий глубокую дегидратацию растительного материала для увеличения его криоустойчивости и основанный на закаливании растений - доноров меристем, а также введении 0,5-1,0 мг/л паклобутразола ([1-(4-хлорофенил)-4,4-диметил-2(1,2,4-триазол-1-ил)пентан-3-ол], фирмы Sigma-Aldrich) в питательную среду для предкультивирования изолированных меристем перед их высушиванием и замораживанием, позволяет получать из 75-100% криосохраненных меристем (в каждой криоампуле не менее 20 меристем) растения-регенеранты всех испытанных нами сортов земляники (Табл.2).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Растения земляники садовой сортов Пандора, Покахонтас и Зенга-Тигайга размножают in vitro на агаризованной питательной среде МС (таблица 1), дополненной 3% сахарозой, 1 мг/л бензиламинопурина и 0,1 мг/л индолил-уксусной кислотой. Растения земляники, полученные в результате размножения, закаливают 2 недели на модифицированной питательной среде (ПС-1) с 5% сахарозой (таблица 1). Затем изолированные из них апексы 46-50 часов предкультивируют на агаризованной питательной среде (ОС-1), дополненной 0,79 М сахарозы и 0,5 мг/л паклобутразола (таблица 1), высушивают до 70-80% потери веса и переносят в криоампулы. Криоампулы с апексами погружают прямо в жидкий азот (-196°С). После криогенного хранения не менее часа ампулы с меристемами на 1-2 сек помещают в водяную баню при +38°С. Размороженные меристемы извлекают из ампул на сухую стерильную фильтровальную бумагу, а затем помещают на свежую полужидкую питательную среду (МС-Р), дополненную 3% сахаров (сахароза + глюкоза) и 0,5 мг/л бензиламинопурина (таблица 1), для рекультивирования при 18°С 16-часовом дне и освещенности 0,5-1 клк. После месяца культивирования из 75-80% меристем (табл.2) были восстановлены растения с листьями и корнями.

Пример 2.

Растения земляники садовой сортов Пандора, Покахонтас и Зенга-Тигайга размножают in vitro на агаризованной питательной среде МС (таблица 1), дополненной 3% сахарозой, 1 мг/л бензиламинопурина и 0,1 мг/л индолил-уксусной кислотой. Растения земляники, полученные в результате размножения, закаливают 8 недель на модифицированной питательной среде (ПС-2) с 10% сахарозой (таблица 1). Затем изолированные из них апексы 46-50 часов предкультивируют на агаризованной питательной среде (ОС-2), дополненной 0,81 М сахарозы и 1,0 мг/л паклобутразола (таблица 1), высушивают до 70-80% потери веса и переносят в криоампулы. Криоампулы с апексами погружают прямо в жидкий азот (-196°С). После криогенного хранения не менее часа ампулы с меристемами на 1-2 сек помещают в водяную баню при +38°С. Размороженные меристемы извлекают из ампул на сухую стерильную фильтровальную бумагу, а затем помещают на свежую полужидкую питательную среду (МС-Р), дополненную 3% сахаров (сахароза + глюкоза) и 0,5 мг/л бензиламинопурина (таблица 1), для рекультивирования при 18°С 16-часовом дне и освещенности 0,5-1 клк. После месяца культивирования из 83-100% меристем (табл.2) были восстановлены растения с листьями и корнями.

Таблица 1. Питательные среды использованные при криосохранении меристем земляники садовой Fragaria*ananassa Duch.
Вещество, мг/л	Питательные среды
МС	МС-Р	ПС-1	ПС-2	ОС-1	ОС-2
Аммоний азотнокислый NH4NO3	1650	1650	1650	1650	1650	1650
Калий азотнокислый KNO3	1900	1900	1900	1900	1900	1900
Магний сернокислый MgSO4­7H2O	370	370	370	370	370	370
Калий фосфорнокислый КН2PO4	170	170	170	170	170	170
Кальций хлористый CaCl2­2H2O	440	440	-	-	440	-
Кальций азотнокислый Са(NO3)2­6Н2O	-	-	708	708	-	708
Железо сернокислое FeSO4­7H2O	55.6	55.6	27.8	27.8	55.6	27.8
Трилон Б Na2ЭДТА	74.6	74.6	37.3	37.3	74.6	37.3
Марганец сернокислый MnSO4­7H2O	370	370	370	370	370	370
Натрий молибденовокислый Na2MoO4­2H2O	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25	0.25
Борная кислота Н3ВО3	6.2	6.2	6.2	6.2	6.2	6.2
Цинк сернокислый ZnSO4­7H2O	8.6	8.6	8.6	8.6	8.6	8.6
Калий йодистый KI	0.83	0.83	0.83	0.83	0.83	0.83
Кобальт хлористый COCl­6Н2O	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025
Медь сернокислая CuSO4­5Н2O	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025	0.025
Тиамин	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Пиридоксин	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Никотиновая кислота	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Аскорбиновая кислота	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
Глицин	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0	2.0
Мезоинозитол	100	100	100	100	100	100
Глюкоза	-	10000	-	-	-	-
Сахароза	30000 (0,09 М)	20000 (0,06 М)	50000 (0.15 М)	100000 (0,3 М)	270587 (0,79 М)	277425 (0,81 М)
Бензиламинопурин (БАП)	1-2	0,5	-	-	-	-
Индолил-масляная кислота (ИМК)	0,1	-	-	-	-	-
Паклобутразол	-	-	-	-	0,5	1,0
Агар-агар	7000	7000	9000	9000	-	-
Бидистиллированную воду добавляли до 10000 мл, рН=5,6, до автоклавирования

Таблица 2. Посткриогенная регенерация растений земляники садовой (Fragaria L.) из меристем криосохраненных методом быстрого замораживания с помощью дегидратации
сорт	% посткриогенной регенерации растений в методе без применения паклобутразола*	% посткриогенной регенерации растений в примере №1	% посткриогенной регенерации растений в примере №2
Пандора	60	80	100
Покахонтас	67	75	83
Зенга-Тигайга	50	78	100
* Метод криогенного хранения без применения паклобутразола позволяет восстанавливать растения трех различных сортов земляники из 50-67% криосохраненных меристем.

Заявленный способ отличается от прототипа тем, что растения - доноры меристем закаливают в присутствии 5-10% сахарозы, а изолированные апексы предкультивируют на питательной среде, содержащей 0,79-0,81 М сахарозы и 0,5-1,0 мг/л паклобутразола.

Технологический результат настоящего изобретения заключается в том, что посткриогенная регенерация растений земляники увеличивается до 75-100% (таблица 2).

Использование нового метода криосохранения позволяет отказаться от дорогостоящих программируемых замораживателей и может помочь интенсифицировать создание криобанков ценных отечественных и районированных в России иностранных сортов земляники садовой.

Способ криосохранения in vitro меристем, изолированных из растений земляники садовой (Fragaria L.), заключающийся в подготовке растений - доноров меристем к замораживанию, выделении апексов, предкультивировании апексов, погружении криоампул с апексами в жидкий азот, хранении ампул с меристемами в жидком азоте, оттаивании апексов и посткриогенной регенерации растений из меристем, отличающийся тем, что растения-доноры меристем подготавливают 2-8 недель на твердой агаровой питательной среде, дополненной 5-10% сахарозы, а предкультивирование изолированных из них апексов проводят в присутствии 0,79-0,81 М сахарозы и 0,5-1,0 мг/л паклобутразола ([1-(4-хлорофенил)-4,4-диметил-2(1,2,4-триазол-1-ил)пентан-3-ол]) перед высушиванием и быстрым замораживанием.