Способ флуоресцентной наноскопии (варианты)

Изобретение относится к анализу объектов, покрашенных флуоресцентными красителями, с помощью модифицированного флуоресцентного микроскопа. В способе используется флуоресцентный микроскоп, видеокамеры, компьютер. Микроскоп содержит цифровые видеокамеры с запирающими фильтрами для выделения света флуоресценции. Структуры объекта или его среза прокрашивают одним или различными нефлуоресцирующими красителями. При освещении объекта с помощью УФ-вспышки часть нефлуоресцирующих молекул красителя превращается во флуоресцирующие. Регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, которые передаются в компьютер. Флуоресцирующие молекулы обесцвечиваются в процессе или после регистрации. Кадры с остаточным флуоресцентным излучением передаются в компьютер. По разностным кадрам осуществляют поиск центров пятен, представляющих координаты молекул флуоресцирующего красителя. Процесс повторяется до вычисления координат молекул красителя в освещаемой части объекта. Осуществляют компьютерную реконструкцию изображения объекта или его среза. Объекты могут быть прокрашены флуоресцентными наночастицами одного или разных видов. Технический результат - получение двух- и трехмерного изображения с разрешением лучше 20 нм, возможность регистрации цветного изображения при прокраске различными красителями белков, нуклеиновых кислот, липидов и пр. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 3 ил.

 

Изобретение относится к оборудованию для научных исследований, в частности к линзовым флуоресцентным микроскопам, предназначенным для получения изображения иммобилизованных на стекле флуоресцирующих объектов, точнее к флуоресцентно-микроскопическому компьютеризованному способу реконструкции изображения объектов с разрешением до нескольких нанометров (нм).

Известны оптические микроскопы, производящие увеличенное изображение объекта с помощью линзовых объективов, которые могут воспроизвести изображения двух соседних точек объекта порознь только тогда, когда расстояние между ними превышает так называемый дифракционный предел, определяемый по формуле r=0.61λ/A (1), где λ - длина волны света, собираемого объективом с апертурой А=n*sin(φ), n - показатель преломления света для среды, окружающей рассматриваемые точки, φ - угол между осью объектива и крайними лучами, улавливаемыми объективом и проходящими к регистратору. В настоящее время для флуоресцентной микроскопии с использованием линзовых объективов применяются различные по конструкции устройства, в которых источником света служит мощная дуговая лампа, лампа накаливания, лазер или солнечный свет. Флуоресценция возбуждается сразу во всех имеющихся в освещенной зоне молекулах красителя либо через объектив с использованием светоделительного дихроичного зеркала, пропускающего возбуждающий свет на объект и отражающего флуоресцентный свет на регистратор, либо сбоку с помощью лазеров, освещающих объект на всю глубину, или через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения. В последнем случае свет проникает на глубину менее 0,3 длины световой волны через границу между стеклом и объектом, имеющим меньший показатель преломления света, чем стекло. Свет флуоресценции объекта собирается объективом, который передает изображение объекта для визуального наблюдения и регистрации с помощью фотоумножителя, фотопленки или цифровой видеокамеры. Основным недостатком всех созданных до сих пор линзовых микроскопов является наличие предела разрешения двух соседних точек, вычисляемого по формуле (1).

Объявлено о зарождении микроскопии с использованием суперлинз из пленки серебра толщиной менее 50 нм, способных обеспечить разрешение двух точек, находящихся на расстоянии около 50 нм (N. Fang and X. Zhang, Imaging properties of a metamaterial superlens, 2003, App Phys Let, v. 82, 2, 161-163; Nicholas Fang, Zhaowei Liu, Ta-Jen Yen and Xiang Zhang. Regenerating evanescent waves from a silversuperlens, 2003, OPTICS EXPRESS, Vol.11, № 7, 682-687). Перспективы применения таких микроскопов для биологических объектов пока неясны, достигнутое разрешение у построенного образца в несколько раз хуже, чем у предлагаемого нами устройства.

Известны устройства с предельным разрешением лучше 1 нм, например электронные, туннельные и силовые микроскопы. Следует заметить, что они обладают наряду с очевидными достоинствами и существенными недостатками: сложность и дороговизна их устройства и работы с объектами; невозможность получения цветного изображения для того, чтобы различить разнотипные молекулы; объекты, обычно, должны быть высушены и обработаны веществами, изменяющими взаимное положение деталей объекта. В силовом и туннельном микроскопе, кроме того, невозможно регистрировать структуры в глубине объекта; лишь одна точка может регистрироваться в каждый момент времени, и скорость сканирования не превышает 1 мкм²/мин; конец иглы легко загрязняется и после этого не может приблизиться к поверхности объекта.

Известно также устройство, в котором возбуждение флуоресценции объекта осуществляют лазером через отверстие в торце стеклянного волокна, передвигаемого моторами в трех направлениях так, чтобы конец волокна оказался вблизи светоотражающей, светорассеивающей или покрытой флуоресцирующими молекулами поверхности. В этой безлинзовой модели микроскопа удается получать изображение с разрешением, на порядок превосходящим достигаемое в обычных оптических микроскопах, если окошко на конце стекловолокна имеет диаметр намного меньше длины световой волны. Свет проникает через такое окошко в объект на глубину, много меньшую, чем длина световой волны, и возвращается в стекловолокно почти полностью за исключением той его части, которую перехватят объекты снаружи от окошка. Интенсивность флуоресценции, светорассеивания или отраженного света, перехваченного в близкой к окошку области объекта, измеряют с помощью фотоумножителя и реконстрируют изображение поверхности объекта с помощью компьютера, собирающего информацию об интенсивности измеренного света и координатах конца стекловолокна. Основными недостатками этой системы являются: необходимость применения дорогих высокоточных и быстродействующих механических узлов, отвечающих за перемещение конца стекловолокна по отношению к объекту; процесс изготовления стекловолокна с окошком на конце диаметром менее 50 нм оказался очень дорогим, трудным и плохо воспроизводимым; окошко на конце стекловолокна легко загрязняется и после этого не может приблизиться к поверхности объекта; лишь ничтожная часть света способна выйти наружу из стекловолокна в область ближнего поля через окошко с диаметром, много меньшим длины волны света, а увеличение интенсивности вводимого в стекловолокно света может вызвать локальное нагревание конца стекловолокна и его разрушение; невозможно регистрировать флуоресценцию в областях объекта, не доступных для конца стекловолокна; лишь одна точка может регистрироваться в каждый момент времени и скорость сканирования поверхности не превышает 1 мкм²/мин.

Описан еще один тип нового микроскопа, сканирующего поверхность объекта одновременно с помощью нескольких световых пучков, для 5-летних исследований которого выделен грант в National Institute of Standards and Technology (NIST), http://www.betterhumans.com/News/news.aspx?articleID=2005-02-11-4, "Optical Microscopes Enter the Nano Age. Hybrid system being developed to image and measure features smaller than the wavelength of visible light". В статье говорится лишь о том, что с помощью данной методики можно обнаружить наночастицу размером 40 нм; нет упоминаний, удавалось ли авторам в уже проведенных экспериментах различить две частицы на расстоянии менее 40 нм друг от друга. По приведенным авторами рисункам и описаниям неясно, как предлагаемая методика позволит наблюдать изображения двух частиц, находящихся на расстоянии r<0.61λ/A раздельно, и, по нашему мнению, предлагаемое авторами устройство не сможет достичь разрешения деталей объекта, находящихся на расстоянии, много меньшем длины световой волны.

Наиболее близким аналогом данного изобретения может служить метод использования обычного флуоресцентного микроскопа (Erwen, A Sharonov, JH Ferris, RM Hochstrasser: Direct visualization of nanopatterns by single-molecule imaging. App Phys Let 2005, 86: 043102), в котором образец - тонкая пленка полимера с пустыми открытыми сферическими ячейками диаметром 1 мкм - прокрашен раствором флуоресцирующего белка в очень низкой концентрации, позволяющей видеть раздельно молекулы белка, способные перемещаться в Броуновском движении внутри полых микросфер. Образец освещается через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения лазерным лучом, возбуждающим флуоресценцию в слое объекта толщиной 150-200 нм рядом со стеклом. Положение нескольких десятков молекул флуоресцирующего белка, каждая из которых покрашена множеством одновременно флуоресцирующих молекул, регистрировали на высокочувствительную видеокамеру (Roper Scientific, Cascade 512F с умножителем электронов, встроенным в ПЗС) в 500 последовательных кадрах, каждый из которых записывали в память компьютера. Все накопленные изображения, каждое содержащее множество пятен с диаметром около 0,5 мкм, умноженным на увеличение системы, складывали и получали суммарное изображение с разрешением не лучше, чем у обычного флуоресцентного микроскопа. Основными недостатками этой системы являются: нет никаких упоминаний в статье о возможности вычислять положение центров регистрируемых пятен и строить изображение из точек, соответствующих центрам пятен, с разрешением, более высоким, чем обусловлено диффракционным пределом (ф-ла 1); не описаны подходы к избирательной окраске различных структур самого объекта; не описано решение следующей проблемы: после неизбежного обесцвечивания красителей в процессе их регистрации уже нефлуоресцирующие молекулы белка останутся в зоне наблюдения, будут увеличивать вязкость раствора и не позволят заменять их на свежие флуоресцирующие молекулы белка, что препятствует накоплению значительно большего чем 500 числа кадров, необходимых для получения изображений с разрешением, лучшим, чем обусловлено диффракционным пределом (ф-ла (1)).

Спецификой изучения биологических объектов, например мышц, является наличие множества совершенно различных типов молекул, находящихся на расстоянии, значительно меньшем, чем разрешающая способность обычных оптических микроскопов, в которых увеличенное изображение объекта строится с помощью объектива в плоскости регистратора - глаза, фотоаппарата или видеокамеры. При этом диффракционный предел разрешения микроскопа (ф-ла 1) ограничивает разрешение как в микроскопах с одновременным наблюдением всех точек в поле зрения, так и в микроскопах с последовательным просмотром точек объекта с помощью сфокусированного в одну точку луча света (конфокальный и др. сканирующие линзовые микроскопы). В этой связи желательно, чтобы все достоинства оптических микроскопов и применяемых для них методов избирательного окрашивания различных типов молекул в поле зрения можно было бы совместить с таким улучшением разрешающей способности, которое позволило бы видеть раздельно молекулы, находящиеся на расстоянии менее 10-20 нм друг от друга.

Задачей настоящего изобретения является разработка способов окрашивания объектов, их подготовка к исследованию, компьютерная обработка результатов, позволяющих получить изображение объектов с разрешением лучше 20 нм, в результате чего флуоресцентный микроскоп превращается в «наноскоп». Данная задача решается за счет многократной съемки слабоокрашенного объекта (в котором все флуоресцирующие молекулы видны раздельно как пятна с диаметром 2r=1,22λ/A, занимающие разные места в десятках тысяч последовательных кадров), последующей обработки всех полученных кадров с целью вычисления положений центров зарегистрированных пятен (соответствующих реальным координатам флуоресцирующих молекул) и трехмерной реконструкции положений всех молекул красителя с разрешением, сравнимым с размером самих флуоресцирующих молекул, причем разные структуры объекта могут быть окрашены в различные цвета. Флуоресцентный наноскоп может базироваться на стандартных конструкциях, используемых во флуоресцентной микроскопии. Он должен содержать, как минимум, оптическую систему для визуального наблюдения и проецирования изображения образца на цифровую видеокамеру, способную регистрировать и оцифровывать с низким уровнем шума изображения одиночных флуоресцирующих молекул и наночастиц; компьютер для записи и обработки изображений; держатель образца, расположенный напротив объектива; набор сменных запирающих светофильтров для выделения света флуоресценции образца; два источника света, установленных сбоку от держателя образца и под углом к нему, при этом угол установки источников выбран из условия обеспечения освещения либо по всей глубине среза образца, либо в слое объекта толщиной менее 150 нм, прилегающем к стеклу, где флуоресцентные молекулы могут поглощать энергию световых волн, проникающих через границу при освещении под углом полного внутреннего отражения. Объект для наблюдения должен быть предварительно окрашен в растворе с насыщающей концентрацией «запертого красителя» (caged dye (англ.)), начинающего флуоресцировать только после того, как импульс УФ-света оторвет от молекул красителя блокирующие флуоресценцию группы. Избыток красителя должен быть тщательно отмыт. Для объектов, изучаемых прямо в свежем отмывающем растворе, сложно обеспечить неподвижность их молекулярных структур в течение длительного времени вдали от стекла призмы и покровного стекла, между которыми зажат объект, поэтому наилучшее разрешение наноскопа может быть получено только для тех слоев объекта, которые отстоят от стекла призмы не далее 150 нм, - глубины, на которую в объект проникает свет, падающий на границу раздела под углом полного внутреннего отражения. В случае неживого, фиксированного, объекта обычно допустимо многочасовое наблюдение при почти абсолютной неподвижности различных структур, близких к стеклу подложки, сохраняющих свое положение в пространстве за счет множества стабильных взаимных связей и связей с подложкой, несмотря на то, что порядка 80% объема занято водными растворами солей. Чтобы раствор не пересыхал, щели на краях стекла должны быть герметично закрыты (например, парафином).

Для трехмерной наноскопии необходимо обеспечить полную неподвижность объекта и его частей относительно объектива, поэтому после окраски «запертым (caged)» красителем и отмывки объект должен быть проведен через обезвоживающие растворы, заключен в полимерную нефлуоресцирующую среду (например, эпоксидную смолу) и его срезы толщиной до нескольких мкм могут быть использованы для трехмерной реконструкции объекта с разрешением до 10-20 нм по всем трем координатам. Такой объект в твердой фазе можно освещать так, как это принято в обычной флуоресцентной микроскопии, с тем усовершенствованием, что дополнительная лампа-вспышка должна быть использована для превращения нескольких сотен нефлуоресцирующих молекул красителя во флуоресцирующие в каждом кадре. Как для объекта в жидкости, так и для среза объекта в полимерной пленке УФ-вспышка с λ<360 нм периодически освещает объект, прокрашенный нефлуоресцирующими молекулами, и каждый раз превращает несколько сотен (и даже тысяч) молекул в поле зрения во флуоресцирующие за счет фотолиза специальных блокирующих флуоресценцию химических групп, а лазер освещает объект постоянно и возбуждает флуоресценцию вновь образованных флуоресцентных молекул с такой интенсивностью, что каждая из них испустит несколько десятков тысяч квантов света за доли секунды и обесцветится сразу после регистрации ее флуоресценции на оцифрованном кадре с невысоким уровнем шума. Чередование процессов генерации флуоресцентных молекул, их возбуждения, регистрации и обесцвечивания может повторяться десятки тысяч раз и каждый раз будут создаваться, регистрироваться и обесцвечиваться все новые флуоресцентные молекулы, а еще не преобразованные нефлуоресцентные молекулы не будут обесцвечиваться, так как они не поглощают лазерный свет. Пользуясь описанным способом, можно зарегистрировать десятки тысяч кадров с сотнями и даже тысячами флуоресцирующих молекул в каждом кадре и вычислить положение всех десятков миллионов флуоресцирующих молекул, покрывающих поверхности структур, находящихся в поле зрения. При этом для цветной окраски структур различной природы можно использовать красители с различными активными группировками, связывающимися либо с белками, либо с нуклеиновыми кислотами, либо с жирами и т.д. (Предлагаемое название метода - «цветная наноскопия»).

Вторая модификация метода наноскопии основана на том, что внутри значительной части объема биологического образца с продырявленными мембранами, заполненного раствором солей, возможно Броуновское движение очень ярко флуоресцирующих и устойчивых к отбеливанию наночастиц (молекул фикобилипротеинов или флуоресцентных микросфер с диаметром 10-40 нм), которое может регулироваться дополнительно с помощью электрофореза током, подаваемым через несколько чередующихся пар электродов так, чтобы ток направлял движение частиц в различных направлениях и частицы таким образом сканировали все доступное им пространство. Если в каждом кадре будут регистрироваться несколько сотен одних и тех же (или обмениваемых с находящимися вне освещенной зоны) флуоресцентных частиц, плавающих на расстоянии больше 1-2 мкм друг от друга, то возможно вычислить их положение с точностью до нескольких нанометров (как координаты центров соответствующих им пятен) и использовать полученные во всех кадрах координаты для определения всех мест, где могут оказаться частицы за длительное время, то есть весь объем, занятый жидкостью. Ту часть объема, где частицы не смогли побывать, можно считать занятой плотными структурами различного происхождения - белками, хромосомами, остатками неповрежденных мембран и т.д. Возможные флуктуации положения частицы несколько увеличат размер светового пятна за время его регистрации на кадре, но положение центра пятна все же можно считать усредненной координатой положения частицы в объекте. Следует отметить, что нейтральные, положительно и отрицательно заряженные флуоресцентные наночастицы смогут посетить различные области объекта из-за взаимодействия с локальными зарядами биоструктур, поэтому этот метод полезен для изучения поверхностных зарядов структур объекта. (Предлагаемое название метода - «черно-белая наноскопия»).

Оба предлагаемых метода способны обеспечить разрешение наноскопа до нескольких нанометров, зависящее не от предела разрешающей способности (ф-ла 1), а от внутренней подвижности структур в наблюдаемой части объекта за длительное время и соотношения сигнал-шум в видеосигнале, которые поддаются регуляции с помощью различных модификаций приведенных методов. Например, можно ввести в объект немного ярко светящихся «опорных» флуоресцентных частиц и отсчитывать координаты сменяемых частиц с учетом смещений в поле зрения жестко связанных с объектом опорных частиц. Такой подход позволит достичь двумерное разрешение деталей объекта, находящихся на расстоянии всего несколько нанометров.

Следует отметить, что ряд параметров изображения флуоресцирующих частиц (диаметр пятен и распределение интенсивности света вдоль сечения каждого пятна) может меняться по мере удаления частицы из фокусной плоскости объектива микроскопа, поэтому предлагается проводить вычисление и этих параметров с целью вычисления третьей координаты положения светящихся частиц. Для повышения точности определения третьей координаты предлагается изображение объекта проецировать на две видеокамеры, расщепляя свет после объектива на два пучка и разместив камеры так, чтобы на них проецировались через один и тот же объектив две соседние фокусные плоскости внутри объекта. Распределение интенсивности флуоресцентного света для каждой частицы будет отличаться при регистрации через разные камеры и может быть проградуировано в зависимости от третьей координаты и использовано для построения трехмерного изображения объектов. На фиг.3. приведена иллюстрация принципа трехмерной наноскопии. Диаметр и интенсивность пятен от флуоресцентных частиц, проецируемых на ПЗС, зависит от расстояния между частицей и объективом. Две камеры, сфокусированные на различные фокальные плоскости, воспроизводят одну и ту же частицу с разными диаметрами и распределением интенсивности вдоль диаметра. Диаграммы в верхнем правом углу рисунка иллюстрируют различие между диаметрами и распределением интенсивности вдоль диаметров в зависимости от положения видеокамер и флуоресцентных частиц.

Кроме того, в ряде случаев наноскоп поможет определить положение центров пятен, создаваемых флуоресцирующими частицами в двух-трех разных длинах волн при одном и том же возбуждении. На практике это можно осуществить с помощью светоделительных дихроичных зеркал, пропускающих свет на одной длине волны на одну из видеокамер и отражающих свет с другой длиной волны на другую видеокамеру. В соответствии с изложенным в настоящем изобретении может одновременно реконструироваться с наноразрешением положение нескольких различных типов молекул объекта, прокрашенных красителями с различающимися длинами волн излучения, и может умножаться число одновременно видимых и регистрируемых порознь пятен от флуоресцирующих частиц, так как они могут быть видны порознь на разных длинах волн, даже если соответствующие им пятна разных цветов видны перекрывающимися.

Очень полезным может оказаться сочетание описанных вариантов работы наноскопа с дополнительным превращением «запертых» молекул в объекте из нефлуоресцирующих во флуоресцирующие в результате химических реакций или различных физических воздействий, отрывающих блокирующие флуоресценцию химические группы, например, в результате АТФ-азных реакций, работы эстераз, перекисного окисления, радиоактивного распада и т.д. Полученные в результате таких модификаций флуоресцентные молекулы можно возбуждать с помощью лазера и регистрировать с помощью тех же видеокамер, которые используются для вычисления координат поверхности структур объекта описанными ранее способами, их координаты могут быть определены как вычисленные центры соответствующих им пятен на видеокадрах, после чего можно «наложить» их изображение на реконструированный ранее описаннами методами объект как положение реакционно-активных групп этого же объекта с разрешением лучше 20 нм.

Для специалиста является очевидным, что изобретение, охарактеризованное в прилагаемой формуле изобретения, может быть модифицировано различными способами без отхода от основных идей изобретения.

Работа устройства в режиме наноскопа может чередоваться с использованием флуоресцентного микроскопа в обычном режиме с возможностью прямого визуального наблюдения объекта в реальном времени при обычном разрешении (ф-ла (1)), возможностью регистрации изображения с помощью цифровой видеокамеры сверхвысокой чувствительности в память компьютера с целью обработки кадров для измерения геометрических параметров и интенсивности света в разных местах кадра, например в биолюминесцентных и хемилюминесцентных исследованиях.

На представленных чертежах изображена схема модификации флуоресцентного микроскопа для реализации способа наноскопии согласно данному изобретению.

Флуоресцентный микроскоп-наноскоп, как показано на фигурах 1 и 2, имеет: одну (фиг.1) или две (фиг.2) монохромные видеокамеры 1 с цифровым видеовыходом и запирающими светофильтрами перед их сенсорами (ПЗС), пропускающими только флуоресцентный свет на камеры; убираемую светоделительную призму 2; объектив 3 с увеличением до 100х и апертурой до А=1,4; объект 4, прижатый к стеклянному держателю образца 5 со скошенными в виде усеченной призмы краями; лазер 6 с линзовой системой для возбуждения флуоресценции через грани призмы; импульсный УФ-источник 7 с линзовой системой для фотолиза имеющихся на молекулах красителя блокирующих флуоресценцию групп; компьютер 8 с програмой записи и обработки оцифрованных изображений, используемой одновременно для управления источником питания УФ-импульсов и электрофоретического устройства; окуляр микроскопа 10 (фиг.1) для визуального наблюдения 9. Установка должна быть помещена в звукоизолирующий шкаф, установленный на антивибрационный стол. Устройство подачи электрического напряжения на электрофоретические электроды, управляющие движением подвижных флуоресцентных наночастиц внутри объекта, заполненного солевым раствором, будет описано отдельно.

Рассмотрим, как пример, способ получения изображения с помощью наноскопа, в котором используются высокочувствительные камеры Cascade 1K, производимые компанией Photometrics, или камеры SIS1_t285EM, производимые компанией Theta-system, со встроенным ПЗС TC285SPD, производимым компанией Texas Instruments, с умножителем электронов, встроенным на кристалле ПЗС, который имеет квантовую эффективность до 63% и имеет 1004 активных горизонтальных квадратных пикселя со стороной 8 мкм в 1002 строках на светочувствительной площади размером около 8 мм × 8 мм. Если изображение объекта проецируется непосредственно на ПЗС видеокамеры с помощью объектива 100х, то площадь, освещаемая лазером с его линзовой системой на объекте, должна иметь размеры несколько большие чем 80 мкм х 80 мкм, при этом кажый пиксель ПЗС соответствует площадке объекта размером 80 нм × 80 нм. Каждая светящаяся частица или молекула видна на объекте как пятно с диаметром 2r=1,22λ/A, то есть около 560 нм, и будет проецироваться на площадку ПЗС с диаметром около 7 пикселей. Чтобы почти все хаотически распределенные флуоресцентные частицы были видны раздельно, достаточно, чтобы среднее расстояние между ними в каждом кадре было больше 2000 нм. Тогда по крайней мере 40×40=1600 пятен могут одновременно проецироваться на ПЗС в каждом кадре так, что почти все они будут видны раздельно. Чтобы достичь такой концентрации одновременно флуоресцирующих частиц, можно использовать различные методы. Во-первых, можно покрасить объект ярко флуоресцирующими частицами в достаточно низкой концентрации так, что они смогут смещаться в поле зрения под действием Броуновских сил и смогут дополнительно перемещаться с помощью электрофореза током, подаваемым через несколько чередующихся пар электродов так, чтобы ток направлял движение частиц в различных направлениях. Во-вторых, объект может быть покрашен специальными красителями типа 5-карбоксифлуоресцеин-бис-(5-карбоксиметокси-2-нитробензил) эфир, бета-аланин-карбоксамид, суксинимидиловый эфир (CMNB-caged carboxyfluorescein, SE), производимым компанией Molecular Probes, США. После освещения УФ-вспышкой света с длиной волны 310-365 нм (с заранее подобранной экспозицией) около 1000-1600 молекул этого нефлуоресцирующего красителя в зоне наблюдения потеряют специальные группы, блокирующие флуоресценцию, и смогут при освещении голубым светом произвести несколько десятков тысяч квантов зеленого света перед тем, как будут обесцвечены. При апертуре объектива А=1,1-1,3 более 10% света от каждой флуоресцирующей частицы будут направлены на видеокамеру и примут участие в формировании пятна, покрывающего около 40 пикселей ПЗС с интенсивностью до 100 квантов в центре пятна, что вполне достаточно для получения видеосигнала с достаточно хорошим соотношением сигнал-шум (при использовании вышеуказанных камер), которое позволит вычислить координаты центра пятна с точностью лучше 20 нм. Данный краситель не поглощает лазерный свет и не обесцвечивается до тех пор, пока на нем находятся блокирующие флуоресценцию группы, поэтому возможно десятки тысяч раз циклически повторять один и тот же процесс: сначала ПЗС регистрирует изображение объекта с остаточной флуоресценцией, оцифровывает его в видеокамере и передает в компьютер, затем УФ-вспышка создает 1000-1600 флуоресцентных молекул в поле зрения, лазер возбуждет в них флуоресценцию, ПЗС регистрирует изображение флуоресцирующих молекул и частиц, наложенное на остаточную флуоресценцию, изображение оцифровывается в видеокамере и передается в компьютер, где из него вычитается предыдущий кадр с остаточной флуоресценцией. Полученный разностный кадр сохраняется в памяти компьютера для дальнейшей обработки с целью вычисления координат центра пятна, его усредненного диаметра и интенсивности. Некоторое время объект освещается лазером без регистрации изображения для максимально полного обесцвечивания уже зарегистрированных молекул и цикл повторяется. В каждом цикле будут создаваться, регистрироваться и обесцвечиваться все новые флуоресцентные молекулы до тех пор, пока координаты всех молекул красителя не будут зарегистрированы. Кроме указанного красителя, компания Molecular Probes производит подобные красители по заказу, а также она производит набор реактивов для самостоятельного изготовления подобных красителей "caging kit" (D-2516).

Указанные в примере камеры позволяют записывать с хорошим соотношением сигнал-шум изображения отдельных флуоресцирующих молекул с частотой до 10 кадров в секунду, поэтому, в принципе, возможно зарегистрировать за несколько часов, например, 40000 кадров, содержащих каждый до 1600 изображений молекул. Тогда полное число зарегистрированных координат флуоресцентных молекул может достичь 64 миллионов и среднее расстояние между видимыми порознь молекулами может быть всего 10 нм, что в десятки раз лучше, чем в любых других линзовых микроскопах. Для наиболее точного вычисления координат молекул кадры с их изображениями следует сохранять в формате без сжатия или со сжатием без потери информации. Даже в случае сохранения всех кадров без сжатия суммарный объем памяти для их записи в одном эксперименте может достигать десятков гигабайт, что вполне реализуемо с современными жесткими дисками компьютеров. В литературе описаны различные алгоритмы для вычисления центров пятен и нами написана компьютерная программа для подобных вычислений и реконструкции полного изображения на основе таблицы координат вычисленных центров пятен.

1. Способ наноскопии окрашенных объектов, в котором используется флуоресцентный микроскоп, содержащий цифровые видеокамеры с запирающими фильтрами для выделения света флуоресценции, способные регистрировать с низким уровнем шума изображение отдельных флуоресцирующих молекул красителя, возбуждаемых лазерным источником света, компьютер для записи поступающих от видеокамер изображений, отличающийся тем, что объекты представляют собой объекты, находящиеся в растворе, или их срезы, фиксированные и заключенные в полимер, структуры объекта или его среза прокрашивают одним или различными не флуоресцирующими красителями, такими, что при освещении объекта с помощью УФ вспышки часть не флуоресцирующих молекул красителя превращается во флуоресцирующие за счет отрыва от них блокирующих флуоресценцию химических групп, изображения образовавшихся флуоресцирующих молекул, возбуждаемых лазерным источником света, регистрируется в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, которые передаются в компьютер, флуоресцирующие молекулы обесцвечиваются в процессе или после регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением также передаются в компьютер для последующего вычитания из кадров, содержащих смесь изображений флуоресцентных молекул и остаточной флуоресценции, по разностным кадрам осуществляют поиск центров пятен, представляющих координаты молекул флуоресцирующего красителя, процесс повторяется до вычисления координат молекул красителя в освещаемой части объекта или его среза, после чего осуществляют компьютерную реконструкцию изображения объекта или его среза.

2. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что разные структуры объекта или его среза окрашиваются различными красителями, а для избирательного проецирования изображения разных структур на две или более видеокамеры используется набор дихроичных зеркал и светофильтров.

3. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что используют две видеокамеры, одна из которых расположена так относительно объектива микроскопа, что на ее сенсоре фокусируется изображение плоскости объекта или его среза, сдвинутое по глубине на 50-2000 нм относительно плоскости, которая фокусируется на другую видеокамеру, при этом различие в распределении интенсивности света в пятнах, полученных через обе видеокамеры, используется для вычисления третьей координаты положения молекул красителя в объекте и для построения трехмерного изображения объекта, причем объект в растворе предпочтительно освещается через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения, а срез объекта толщиной от долей микрометра до нескольких микрометров освещается через объектив на всю глубину среза или через предметное стекло под углом полного внутреннего отражения.

4. Способ наноскопии по п.1, отличающийся тем, что в объект дополнительно вводятся различные дополнительные молекулы, способные превращаться из не флуоресцирующих во флуоресцирующие в результате химических реакций или различных физических воздействий, отрывающих блокирующие флуоресценцию химические группы, с такой скоростью, что все образовавшиеся дополнительные флуоресцентные молекулы регистрируются в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, которые передаются в компьютер, дополнительные флуоресцирующие молекулы обесцвечиваются в процессе или после регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением также передаются в компьютер для последующего вычитания из кадров, содержащих смесь изображений флуоресцентных молекул и остаточной флуоресценции, по разностным кадрам осуществляют поиск центров пятен, представляющих координаты дополнительных молекул, процесс повторяется до вычисления координат дополнительных молекул и компьютерной реконструкции положения дополнительных молекул на ранее полученном изображении объекта.

5. Способ наноскопии окрашенных объектов, в котором используется флуоресцентный микроскоп, содержащий одну или более цифровые видеокамеры с запирающими фильтрами для выделения света флуоресценции, способные регистрировать с низким уровнем шума изображение отдельных флуоресцирующих наночастиц, возбуждаемых лазерным источником света, компьютер для записи поступающих от видеокамер изображений, отличающийся тем, что объекты представляют собой объекты, находящиеся в растворе и заполненные внутри раствором, объекты прокрашивают видимыми раздельно, устойчивыми к отбеливанию светом флуоресцентными наночастицами одного или разных видов, способными двигаться внутри объекта между его структурами в Броуновском движении или под действием двумерного электрофореза, при этом лазер возбуждает флуоресценцию наночастиц, видеокамера и компьютер регистрируют кадры с видимыми раздельно пятнами в каждом кадре, отражающими положение наночастиц, по вычисленным координатам центров пятен во всех кадрах реконструируется жидкая часть пространства в объекте, доступная для движущихся флуоресцентных наночастиц, а также недоступная для флуоресцентных наночастиц часть пространства, занятая неподвижными структурами объекта.

6. Способ наноскопии по п.5, отличающийся тем, что объект окрашивается различными видами флуоресцентных наночастиц, например нейтральными, положительно и отрицательно заряженными, способными посетить разные области объекта, отличающиеся локальными зарядами, а для избирательного проецирования изображений различных наночастиц на две или более видеокамеры используется набор дихроичных зеркал и светофильтров.

7. Способ наноскопии по п.5, отличающийся тем, что используются две видеокамеры, одна из которых расположена так относительно объектива микроскопа, что на ее сенсоре фокусируется изображение плоскости объекта, сдвинутой по глубине на 50-2000 нм относительно плоскости, которая фокусируется на другую видеокамеру, при этом различие в распределении интенсивности света в двух пятнах, полученных от каждой флуоресцирующей наночастицы через обе видеокамеры, используется для вычисления третьей координаты положения каждой флуоресцирующей наночастицы в объекте.

8. Способ наноскопии по п.5, отличающийся тем, что в объект дополнительно вводятся различные дополнительные молекулы, способные превращаться из не флуоресцирующих во флуоресцирующие в результате химических реакций или различных физических воздействий, отрывающих блокирующие флуоресценцию химические группы, с такой скоростью, что все образовавшиеся флуоресцентные молекулы регистрируются в виде раздельных пятен на кадрах видеокамеры, которые передаются в компьютер, флуоресцирующие молекулы обесцвечиваются в процессе или после регистрации, кадры с остаточным флуоресцентным излучением вычитаются из кадров, содержащих смесь изображений дополнительных флуоресцирующих молекул и остаточной флуоресценции, происходит дальнейший поиск центров пятен, являющихся координатами молекул, процесс повторяется до вычисления координат молекул красителя и компьютерной реконструкции положения молекул на ранее полученном изображении объекта.