Способ стандартизации данных полимерной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флуоресценции непосредственно во время реакции (пцр "в реальном времени")
Владельцы патента RU 2294532:
Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (RU)
Изобретение относится к области медицины, биологии и биотехнологии. До начала детекции сигнала о накоплении продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) для каждой из реакционных смесей определяют калибровочный коэффициент за счет измерения при двух разных температурах интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочным веществом, обладающим зависимостью интенсивности флуоресценции от температуры и добавленным в каждую реакционную смесь до начала реакции в равных конечных концентрациях. Указанный коэффициент используют для коррекции данных об увеличении интенсивности флуоресцентного излучения при накоплении продукта ПЦР. Технический результат - применение изобретения обеспечивает надежную стандартизацию (нормализацию) данных ПЦР "в реальном времени" как в одном, так и в разных экспериментах с возможностью стандартизации непосредственно в ходе ПЦР. 5 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Предложенный способ относится к области медицины, биологии и биотехнологии и может быть использован при выявлении, идентификации и количественной оценке нуклеиновых кислот в исследуемых образцах методом полимеразой цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции "в реальном времени" (ПЦР "в реальном времени").
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) широко используется для амплификации нуклеиновых кислот и позволяет, в частности, выявить присутствие и определить количество нуклеиновой кислоты с определенной последовательностью нуклеотидов в ДНК - или РНК-образце.
Результаты полимеразой цепной реакции анализируют либо по окончании реакции, либо непосредственно в ходе реакции. В первом случае детекцию продукта ПЦР осуществляют, например, с помощью электрофореза или гибридизации с меченными олигонуклеотидными пробами. Для регистрации результатов ПЦР в ходе процесса ее проводят в детектирующем амплификаторе в присутствии либо флуоресцентных интеркалирующих красителей, либо флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных праймеров или проб.
В присутствии флуоресцентных интеркалирующих красителей, а также флуоресцентно-меченых олигонуклеотидных праймеров или проб увеличение количества продукта ПЦР в реакционной смеси приводит к возрастанию интенсивности флуоресценции, что регистрируется детектирующим амплификатором [1]. Однако регистрируемые данные невозможно использовать для анализа результатов ПЦР непосредственно. На практике всегда существует неоднородность уровня регистрируемой интенсивности флуоресценции в одном эксперименте или в разных экспериментах, возникающая за счет неоднородности температуры термоблока, неоднородностей оптического тракта прибора, разброса оптических параметров реакционных пробирок, погрешностей при приготовлении реакционной смеси и т.д. (неоднородности небиологической природы). В связи с этим, данные ПЦР с регистрацией накопления продуктов реакции по интенсивности флуоресцентного излучения во время реакции нуждаются в дополнительной обработке (стандартизации).
Ранее уже предпринимались попытки стандартизации данных, получаемых в ходе ПЦР "в реальном времени". Например, известен способ обработки данных ПЦР "в реальном времени", включающий процесс коррекции уровня интенсивности флуоресценции в реакции гибридизации [2]. Однако указанный способ предусматривает проведение дополнительных экспериментов и может быть осуществлен только по окончании ПЦР.
Наиболее близким к предложенному изобретению является способ обработки данных ПЦР "в реальном времени", который предусматривает устранение "шума" путем сглаживания кривых, отражающих зависимость интенсивности флуоресцентного излучения от количества циклов ПЦР, вычитания интенсивности базовой флуоресценции и нормализации амплитуды с последующим определением оптимального порогового уровня интенсивности флуоресценции и точек пересечения его линии с полученными кривыми [3]. Данный способ, как и предложенное изобретение, предусматривает определение разницы между интенсивностью фонового излучения (В) и интенсивностями флуоресцентного излучения (F(n)), измеренными на каждом цикле ПЦР и в каждой реакционной смеси, с последующим построением для каждой реакционной смеси стандартизованной (нормализованной) кривой, отражающей зависимость интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла ПЦР. Однако этот способ также не может быть реализован непосредственно в ходе ПЦР "в реальном времени". Кроме того, используемая в данном способе амплитудная нормализация в ряде случаев существенно искажает результаты ПЦР.
Раскрытие изобретения
Задача, решаемая предложенным изобретением, заключается в устранении указанных недостатков.
Предложенный способ стандартизации данных полимеразной цепной реакции с регистрацией накопления продуктов реакции по флуоресценции непосредственно во время реакции (ПЦР "в реальном времени") предусматривает:
- помещение до начала реакции в каждую i-тую реакционную смесь, по крайней мере, одного калибровочного вещества, содержащего флуорофор;
- определение на начальных циклах ПЦР (до начала детекции прибором накопления ампликона) средней интенсивности флуоресцентного излучения (F), испускаемого, по крайней мере, одним калибровочным веществом, содержащим флуорофор, при двух разных температурах Т1 и Т2 для каждой i-той реакционной смеси;
- вычисления коэффициента, учитывающего зависимость интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого, по крайней мере, одним калибровочным веществом, содержащим флуорофор, от температуры, по формуле:
Ki=1/(Fi(T2)-Fi(T1))
где:
Ki - коэффициент зависимости флуоресценции интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого по крайней мере одним калибровочным веществом, содержащим флуорофор, от температуры;
Fi(T2) - средняя интенсивность флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочным веществом, содержащим флуорофор, в i-той реакционной смеси при температуре Т2;
Fi(T1) - средняя интенсивность флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочным веществом, содержащим флуорофор, в i-той реакционной смеси при температуре Т1;
- i - координата реакционной смеси в термоблоке детектирующего амплификатора;
- определение интенсивности фоновой флуоресценции (Bi);
- коррекцию данных о регистрируемой на каждом из последующих циклов ПЦР для каждой i-той реакционной смеси интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого флуоресцирующим веществом, используемым для детекции накопления ампликона, по формуле:
Fi(n)норм=Ki·(Fi(n)-Bi)
где:
Fi(n)норм - нормированная интенсивность флуоресцентного излучения в i-той реакционной смеси для n-ного цикла ПЦР;
Ki - коэффициент зависимости интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого по крайней мере одним калибровочным веществом, содержащим флуорофор, от температуры;
Fi(n) - регистрируемая интенсивность флуоресцентного излучения в i-той реакционной смеси для n-ного цикла ПЦР, испускаемая флуоресцирующим веществом, используемым для детекции накопления продукта ПЦР;
Bi - интенсивность фонового флуоресцентного излучения;
i - координата реакционной смеси в термоблоке детектирующего амплификатора; и
- построение стандартизованных кривых, отражающих зависимость нормированной интенсивности флуоресценции в i-той реакционной смеси от номера цикла ПЦР, непосредственно в ходе процесса.
Температуры Т1 и Т2 выбирают таким образом, чтобы Т1 была ниже, чем Т2. Т1 выбирают из интервала 50-70°С, а Т2 - из интервала 70-95°С.
В качестве калибровочного вещества, содержащего флуорофор, используют любое флуоресцирующее вещество, не мешающее протеканию ПЦР и имеющее выраженную и однозначную зависимость интенсивности флуоресценции от температуры. В частности, могут быть использованы:
1) флуоресцирующие химические соединения с выраженной зависимостью эффективности флуоресценции от температуры в несвязанной с ДНК форме (например, 6-FAM, HEX, Су3, Су5 и т.д.);
2) молекулы, меченые флуорофорами и гасителями флуоресценции и меняющие пространственную структуру в зависимости от температуры (например, олигонуклеотидные пробы или праймеры, меченные 6-FAM и BHQ1);
3) химические соединения, изменяющие эффективность флуоресценции при связывании с молекулами ДНК (например, SYBRgreen I, бромистый этидий и т.д.);
4) другие вещества с выраженной температурной зависимостью флуоресценции от температуры (например, зеленый флуоресцирующий белок (GPF), силикат цинка, борат кадмия и т.д.).
Концентрация калибровочного вещества, содержащего флуорофор, в каждой реакционной смеси должна быть одинаковой. Калибровочное вещество может использоваться не только для калибровки, но и для детекции накопления целевого продукта реакции (ампликона). Если калибровочное вещество, содержащее флуорофор, используют только для калибровки (и не используют для детекции накопления ДНК), оно должно подбираться так, чтобы не искажать измерения накопления ДНК.
Определение коэффициентов Ki и Bi выполняется непосредственно в ходе ПЦР "в реальном времени" на первых циклах реакции (до начала детекции прибором накопления ДНК). Например, определение коэффициентов Ki и Bi можно проводить на первых 5-20 циклах ПЦР. Соответственно, при появлении сигнала о начале накопления ампликона, его сразу используют для получения нормированной интенсивности флуоресцентного излучения для каждой реакционной смеси в термоблоке детектирующего амплификатора.
Таким образом, непосредственно в ходе ПЦР "в реальном времени" получают стандартизованные зависимости интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла полимеразной цепной реакции для каждой i-той реакционной смеси без риска искажения экспериментальных данных о накоплении ампликона.
Технический результат, достигаемый при осуществлении предложенного изобретения, заключается в надежной стандартизации (нормализации) данных ПЦР "в реальном времени" как в одном, так и в разных экспериментах с возможностью стандартизации непосредственно в ходе ПЦР.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 приведен график изменения интенсивности флуоресценции в двух реакционных смесях для одного эксперимента. На всех циклах реакции измерение уровня флуоресценции проводят при температуре Т1. Для циклов с 5 по 20 выполняют дополнительные измерения при температуре Т2. Различие в форме графиков вызвано неоднородностью уровня регистрируемой интенсивности флуоресценции (например, за счет неоднородности температуры термоблока, неоднородностей оптического тракта прибора, разброса оптических параметров реакционных пробирок, погрешностей при приготовлении реакционной смеси и т.д).
На фиг.2 показано определение величин, используемых при расчете коэффициента Ki и Fi(n)норм, на основании зависимостей интенсивности флуоресцентного излучения, полученных для двух реакционных смесей в детектирующем амплификаторе.
На фиг.3 представлены зависимости регистрируемой интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла ПЦР, проводимой в 32 пробирках, расположенных в одном детектирующем амплификаторе и содержащих флуоресцирующее калибровочное вещество. На первых 20 циклах осуществляли регистрацию интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочным веществом, содержащим флуорофор, при двух разных температурах (Т1 и Т2).
На фиг.4 представлены зависимости интенсивности флуоресцентного излучения, не нормализованной согласно предлагаемой методике, от номера цикла ПЦР, проводимой в 32 пробирках, расположенных в одном детектирующем амплификаторе и содержащих флуоресцирующее калибровочное вещество.
На фиг.5 представлены зависимости интенсивности флуоресцентного излучения, нормализованной согласно предлагаемой методике, от номера цикла ПЦР, проводимой в 32 пробирках, расположенных в одном детектирующем амплификаторе и содержащих флуоресцирующее калибровочное вещество.
Осуществление изобретения
Калибровочное вещество, представляющее собой олигонуклеотид, несущий короткий инвертированный концевой повтор и меченый по концам флуорофором и гасителем флуоресценции, добавляется перед началом ПЦР в каждую реакционную смесь в количестве, примерно равном количеству пробы.
Состав реакционной смеси в пробирке:
- бидистиллированная вода - 25,37 мкл
- реакционный буфер* - 3,5 мкл
- смесь дезоксирибонуклеотидтрифосфатов четырех типов в концентрации 25 мкМ каждого дезоксирибонуклеотидтрифосфата - 0,24 мкл
- праймер №1 в концентрации 100 мкМ - 0,125 мкл
- праймер №2 в концентрации 100 мкМ - 0,125 мкл
- детектирующая проба в концентрации 50 мкМ - 0,07 мкл
- калибровочная проба в концентрации 50 мкМ - 0,07 мкл
- Taq - полимераза в концентрации 5 международных единиц активности - 0,5 мкл
- исследуемый образец ДНК - 5 мкл
* - состав реакционного буфера: 100 мМ Tris-HCl (pH 8.8 при 25°С), 500 мМ KCl, 0,8% Р40, 20 мМ MgCl2
Пробирки помещают в детектирующий амплификатор (прибор, позволяющий одновременно проводить ПЦР и регистрировать флуоресцентное излучение в пробирке), например, детектирующий амплификатор ДТ-322 (производства ЗАО "НПФ ДНК-Технология", Россия) и проводят ПЦР с регистрацией результатов "в режиме реального времени". На циклах с 5 по 10 ПЦР для калибровочного вещества в каждой пробирке определяют интенсивности флуоресцентного излучения при температуре Т1 и Т2 (Т1=62°С и Т2=94°С). Как видно из фиг.1 и 2 для каждой из пробирок получают набор значений интенсивности флуоресцентного излучения для каждой из температур. Их используют для определения, соответственно, Fi(T2) и Fi(T1) и вычисления коэффициента Ki по формуле:
Ki=1/(Fi(T2)-Fi(T1)).
Интенсивность фоновой флуоресценции (Bi) определяют путем усреднения измерений при температуре Т1 для первых 20 циклов, как это показано на фиг.2. Вычисляют нормированную интенсивность флуоресцентного излучения для каждой пробирки на последующих циклах ПЦР по формуле:
Fi(n)норм=Ki·(Fi(n)-Bi).
На основании полученных расчетных данных в ходе процесса амплификации строят кривые зависимости нормированной интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла.
На фиг.4 и 5 показаны графики данных ПЦР с применением предлагаемого метода (фиг.5) и без такой нормализации (фиг.4). Образцы, установленные в прибор, представляют собой две группы дублей, для каждой из которых были определены коэффициенты вариации рассчитанного количества исходных копий. Без использования предлагаемого метода они составили 19,3 и 29,3%, а с его применением - 10,9 и 14,8%, что демонстрирует заметное улучшение статистических показателей, соответствующее визуальной оценке приведенных графиков.
Принципиальным отличием предлагаемого метода является то, что нормализующий сигнал измеряется одновременно и в том же канале, что и исследуемый сигнал, таким образом полностью устраняется фактор зависимости метода от различия характеристик измерительных каналов.
Источники информации
1. US 2002123062, 2002-09-05.
2. JP 2001-286300, 16.10.2001.
3. Larionov A., Krause A., Miller W., A standard curve based method for relative real time PCR data processing, BMC Bioinformatics. 2005 Mar 21; 6(1):62.
Способ стандартизации (нормализации) данных полимеразной цепной реакции (ПЦР) с регистрацией накопления продуктов реакции по флуоресценции непосредственно во время реакции, предусматривающий определение разницы между интенсивностью фонового излучения (В) и интенсивностями флуоресцентного излучения (F(n)), измеренными на каждом цикле ПЦР и в каждой реакционной смеси, с последующим построением для каждой реакционной смеси стандартизованной (нормализованной) кривой, отражающей зависимость интенсивности флуоресцентного излучения от номера цикла ПЦР, отличающийся тем, что стандартизованную кривую для каждой реакционной смеси получают непосредственно в ходе ПЦР путем
(a) добавления до начала реакции в каждую реакционную смесь калибровочного вещества, содержащего флуорофор и обладающего зависимостью интенсивности испускаемого флуоресцентного излучения от температуры, в равных конечных концентрациях;
(b) измерения интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого указанным калибровочным веществом, до начала детекции сигнала о накоплении продукта ПЦР при температурах Т1 и Т2 в каждой реакционной смеси, причем температура Т1 должна быть ниже, чем Т2;
(c) определения калибровочного коэффициента для каждой реакционной смеси (Ki) по формуле
Ki=1/(Fi(T2)-Fi(T1)),
где Fi(T2) и Fi(T1) - интенсивности флуоресцентного излучения, испускаемого калибровочным веществом, содержащим флуорофор, при температурах Т1 и Т2 соответственно в i-той реакционной смеси;
(d) построения стандартизованной кривой на основании нормированных интенсивностей флуоресцентного излучения для каждой реакционной смеси (Fi(n)норм), вычисленной для каждого цикла полимеразной цепной реакции по формуле
Fi(n)норм=Ki·(Fi(n)-Bi),
где (Fi(n)-Bi) разница между измеренными в i-той реакционной пробирке интенсивностями флуоресцентного излучения на n-ном цикле ПЦР, испускаемого флуоресцирующим веществом, используемым для регистрации накопления продукта ПЦР, (Fi(n)) и фоновой флуоресценции (Bi).
