Способ одновременного люминесцентного определения концентрации нескольких соединений, использующий различия во временах затухания их люминесценции
Изобретение относится к аналитической химии. В способе люминесцентного анализа для одновременного определения концентрации нескольких химических соединений в пробе, имеющих различные времена затухания люминесценции, измеряют интенсивность люминесценции пробы посредством спектрофлуориметра с импульсным частотным возбуждением, обеспечивающим измерение указанной интенсивности с регулируемой задержкой по времени после возбуждающего импульса и с регулируемой длительностью строба, в течение которого интегрируется сигнал люминесценции, после заданной задержки его включения. Используют длительность строба и величину задержки, позволяющие разделить сигналы от химических соединений, обладающих различными временами затухания люминесценции при сопоставимых квантовых выходах люминесценции, и обеспечить селективное определение концентрации указанных соединений в одной пробе. Технический результат - повышение точности одновременного определения концентрации нескольких химических соединений в пробе. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.
Изобретение относится к люминесцентным методам анализа, которые являются одними из самых чувствительных методов. Они позволяют обнаруживать наличие многих токсичных люминесцирующих примесей на уровне ПДК, определять микроконцентрации вредных примесей в сверхчистых материалах, широко применяются с использованием различных люминесцентных меток в иммуноанализе в медицине и биологии.
Известен способ люминесцентного анализа, применяемый в иммуноанализе, который позволяет за счет использования в качестве люминесцентных меток комплексы ионов европия или тербия, обладающих длительностью люминесценции порядка сотен микросекунд, повысить чувствительность определения ряда белков гормонов и др. В этом методе используется тот факт, что большинство люминесцирующих органических примесей, создающих паразитный фон люминесценции, который снижает чувствительность определения флуоресцирующих меток в иммуноанализе, имеют при комнатной температуре короткое время затухания свечения. Поэтому, заменяя в метках флуоресцирующие красители, длительность свечения которых составляет менее 20 нс, на комплексы европия и тербия, обладающие люминесценцией с длительностью сотни микросекунд, и, фиксируя только длительное свечение ионов редкоземельных элементов, удается повысить чувствительность метода на порядок. (Флуоресцентный иммуноанализ с временным разрешением. Д.Д.Р.Барнард, Д.Л.Уильяме, А.К.Пейтон, Г.П.Шах. С.150-167 в кн. Новые методы иммуноанализа. Ред. У.П.Коллинз. М.: Мир. 1991. перевод Complementary immunoassays. Ed. W.P. Collins. J. Wiley&Sons, Chichester - N.Y., 1988).
Наиболее близким к предлагаемому способу техническим решением является изобретение SU 1755130 А1. Способ определения металлов. Способ заключается в том, что в исследуемую водяную пробу, содержащую определяемые металлы, добавляют натриевую соль порфирина и путем кипячения проводят синтез комплексов порфиринов с определяемыми металлами. Добавление в пробу поверхностно-активных веществ и удаление из пробы растворенного кислорода обеспечивает регистрацию длительной люминесценции полученных металлопорфиринов и кинетику ее затухания. О наличии искомого металла в пробе судят по характеристическим спектрам возбуждения и длительной люминесценции соответствующих металлопорфиринов.
В предлагаемом способе можно осуществить одновременное определение нескольких химических люминесцирующих соединений в пробе или нескольких соединений, помеченных различными люминесцирующими метками, если они имеют различные времена затухания свечения, с помощью спектрофлуориметра с импульсным частотным возбуждением, позволяющим измерять интенсивность люминесценции с определенной регулируемой задержкой во времени после импульса возбуждающего света и регулируемой длительностью строба, в течение которого интегрируется сигнал люминесценции. Длительность затухания люминесценции определяемых соединений и люминесцирующих меток, кроме одного соединения или метки, должна быть больше чем длительность импульса возбуждающей лампы в спектрофлуориметре и временного разрешения регистрирующей системы в нем. Такой способ позволяет существенно увеличить точность одновременного определения нескольких соединений, если они имеют различные времена затухания люминесценции, по сравнению с измерениями только спектров люминесценции и возбуждения на спектрофлуориметрах с непрерывным источником возбуждения. В качестве наиболее универсальной среды для проведения измерений удобнее всего использовать твердые растворы при низкой температуре, для чего можно брать либо водный раствор, загрязненный токсичными соединениями, либо исследуемую пробу растворять в одном из следующих растворителей: вода, этанол, толуол, изопентан. Полученные растворы замораживают. В этих условиях у большого количества органических соединений и комплексов металлов наблюдается люминесценция различной длительности (флуоресценция с длительностью от сотен пикосекунд до сотен наносекунд, фосфоресценция и замедленная флуоресценция с длительностью от микросекунд до десятков секунд, люминесценция комплексов переходных металлов и лантанидов с длительностью от микросекунд до миллисекунд). В случае использования в иммунофлуоресцентном анализе комплексов ионов лантанидов Eu(III), Tb(III), Dy(III), Sm(III) можно работать в жидких растворах, поскольку длительности свечения комплексов с указанными ионами составляют десятки и сотни микросекунд.
См. справочники: Landolt-Bömstein. Zahlewerte und Funktion aus Naturwissenschaften und Technik. Neue Serie. Band 3. Lumineszenz organischer Substanzen. Springer Verlag. Berlin - N.Y. 1967.
St. L. Murov. Handbook of Photochemistry. Sec. 3. Marcel Dekker, Inc. New York. 1973.
И обзорные статьи: P.D.Fleischauer, P. Fleischauer. Photoluminescence of transition metal coordination compounds. Chem. Rev., 1970. V.70. No 2. P.199-230.
В.Л.Ермолаев, Е.Б.Свешникова, Е.Н.Бодунов. Индуктивно-резонансный механизм безызлучательных переходов в ионах и молекулах в конденсированной фазе. Успехи физ. наук. 1996. Т.166. №3. С.279-302.
Следует отметить, что чем больше различие во временах затухания определяемых веществ при сопоставимых квантовых выходах люминесценции, тем точнее будут измерения. Точность измерений также будет зависеть от того, насколько далеко на хвосте более длительного свечения можно проводить измерения в зависимости от соотношения сигнал шум.
При двухкратной разнице во временах затухания τ двух измеряемых веществ (первое вещество τ1, второе вещество τ2), одинаковых квантовых выходах их люминесценции, совпадающих спектрах люминесценции и поглощения, при длительности строба измерения до точки пересечения кривых затухания люминесценции обеих веществ - 1.368τ1 соотношение измеряемых сигналов первого и второго (τ2=2τ1) будет 0.75 к 0.5. После точки пересечения 0.25 к 0.5. Соответственно, при задержке в 5τ1 соотношение интенсивностей будет до 5τ1 0.9933 к 0.918, а после 0.0067 к 0.082, т.е. более чем десятикратное. В случае же заметного различия в спектрах поглощения (возбуждения) и люминесценции точность измерений будет выше.
Спектрофлуориметры, в которых возбуждение люминесценции осуществляется импульсным источником (лампой или лазером) в частотном режиме, выпускаются рядом фирм. В частности, такой прибор разработан и выпускается в России фирмой OOO «ЛЮМЭКС» под маркой ФЛЮОРАТ-Т. В нем в качестве источника возбуждения используется импульсная лампа с длительностью около одной микросекунды и частотой повторения 25 Гц. Излучение импульсной лампы выделяется монохроматором и направляется на объект для возбуждения. Излучение люминесценции также регистрируется через монохроматор. Прибор позволяет осуществлять задержку регистрации сигнала после импульса возбуждения и регулировать длительность строба, в течение которого интегрируется сигнал люминесценции. Используя такую систему по нашему методу можно с высокой точностью разделять сигналы люминесценции от веществ, время затухания свечения которых заметно отличается, а квантовый выход люминесценции соизмерим. Дополнительные возможности по разделению многокомпонентной смеси создает наличие монохроматоров, позволяющих оптимизировать возбуждение и регистрацию каждого люминесцирующего компонента смеси.
Измерения на спектрофлуориметрах ФЛЮОРАТ-Т проще всего проводить при температуре жидкого азота (77 К), когда многие органические соединения и комплексы металлов обладают не только коротко живущей флуоресценцией, но и фосфоресценцией, длительность которой больше длительности источника возбуждения ˜1 мкс в указанных спектрофлуориметрах. Длительность строба, интегрирующего сигнал люминесценции, ограничивается частотой повторения импульсов в спектрофлуориметрах (в ФЛЮОРАТЕ-Т 25 Гц). Экспериментальное подтверждение заявленного способа выполнено следующим образом. На аппаратуре фирмы ЛЮМЭКС, состоящей из спектрофлуориметра ФЛЮОРАТ-Т и криоприставки КРИО-2, соединенной со спектрофлуориметром по волоконно-оптической линии связи, при замораживании пробы до температуры жидкого азота были проведены по описанному выше методу одновременные измерения концентрации трех токсичных ионов тяжелых металлов в водном растворе 6 М соляной кислоты. Ионы токсичных тяжелых металлов шестого периода таблицы Менделеева таллия (I), свинца (II) и висмута (III) в присутствии высокой концентрации анионов хлора образуют в воде комплексы, которые люминесцируют с высоким квантовым выходом при температуре жидкого азота, и имеют времена затухания люминесценции, различающиеся на три порядка, что мы и использовали для селективного определения их концентрации в одной пробе наряду с использованием разницы в спектральных характеристиках люминесценции объектов. Данные о положении максимумов полос поглощения и испускания люминесценции, квантовых выходах люминесценции и о временах ее затухания для указанных ионов в 6 М растворе соляной кислоты в воде собраны в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||||||
| Ион | λmax поглощения, нм | ε·10-4 М-1 см-1 в максимуме | λmax испускания, нм | q | τ, мкс | |||||
| 293 К | 77 К | 293 К | 77 К | 293 К | 77 К | 293 К | 77 К | 293 К | 77 К | |
| Tl (I) | 240 | - | 0,76 | - | 430 | 390 | 0,5 | 0,8 | 0,3 | 1,0 |
| Pb (II) | 272 | 272 | 1,8 | 3,6 | 485 | 385 | 0,002 | 0,4 | <0,1 | 40 |
| Bi (III) | 325 | 325 | 3,8 | - | - | 415 | <0,0001 | 0,8 | - | 4500 |
| q - квантовый выход люминесценции, τ - время затухания люминесценции. |
На фиг.1 приведены измеренные спектры поглощения при комнатной температуре и люминесценции, как при комнатной температуре, так и при температуре жидкого азота (77К) трех указанных ионов в 6 М водном растворе соляной кислоты.
Из фиг.1 видно, что спектр поглощения таллия заметно перекрывается со спектром висмута, а спектры люминесценции всех трех исследуемых ионов в воде при низкой температуре налагаются друг на друга. Использование задержки по времени и различной длительности строба наблюдения позволяет надежно разделить свечение всех трех токсичных ионов.
Расчеты при предположении об одинаковом количестве квантов, поглощенных каждым из ионов, показали, что при интегрировании сигнала с помощью задержки и длительности строба наблюдения в интервале от 0 до 5 мкс фиксируется 95% суммарного излучения таллия и вносится погрешность от свинца около 4%, погрешность от излучения висмута порядка 0.1%. В следующем временном интервале от 5 до 200 мкс измеряется сигнал люминесценции свинца, при этом погрешность, вносимая люминесценцией таллия, составляет около 5%, а люминесценцией висмута около 3%. Чтобы корректно с точностью около 5% измерить люминесценцию висмута, необходимо интегрировать сигнал в интервале от 200 мкс до 10 мс, что даст погрешность за счет свинца около 5%.
Для демонстрации возможности реализации предложенного метода был измерен образец водного раствора с 6 М соляной кислоты, содержащего все три токсичных иона: таллий в концентрации 10-3 мг/см3, свинец в концентрации 3·10-5 мг/см3 и висмут в концентрации 10-4 мг/см3. Поскольку висмут и свинец люминесцируют с высоким выходом только при температуре жидкого азота, измерения проводились с помощью приставки Крио - 2 разработки OOO «ЛЮМЭКС», в которой возбуждение и регистрация люминесценции осуществляется через кварцевые волоконные жгуты. Условия возбуждения и наблюдения люминесценции в данной криоприставке таковы, что это соответствует условиям возбуждения люминесценции в тонком оптическом слое, поэтому спектры возбуждения не искажаются даже при наблюдении раствора высокой концентрации. Отсюда следует, что высота пика в спектре возбуждения люминесценции каждого из трех ионов после корректировки на чувствительность прибора пропорциональна его концентрации. Спектры возбуждения люминесценции ионов таллия измерены при длине волны наблюдения 390 нм, задержке 1.1 мкс и длине строба наблюдения 3.5 мкс, спектр возбуждения люминесценции свинца измерен при длине волны наблюдения 390 нм с задержкой регистрации 50 мкс и длительностью строба наблюдения 80 мкс. Спектр возбуждения люминесценции висмута снят при наблюдении на длине волны люминесценции 417 нм с задержкой 1 мс и длительностью строба наблюдения 6 мс. Полученные результаты приведены на фиг.2. Из полученных данных следует, что спектры возбуждения, снятые на приборе ФЛЮОРАТ - Т для смешанного раствора, аналогичны измеренным в предыдущих измерениях на других приборах для растворов индивидуальных соединений, а чувствительность одновременного определения свинца и висмута в этих условиях превышают установленные в России ПДК в 3-5 раз, в то время как для таллия чувствительность метода не достигает ПДК на 1-1.5 порядка. Таким образом, продемонстрирована возможность осуществления одновременного аналитического люминесцентного определения трех токсичных элементов, используя разницу в длительности их люминесценции.
Проверка надежности идентификации анализируемых ионов возможна с помощью измерения спектров люминесценции и возбуждения при различных временах задержки и длительности строба измерения.
На основе данного частного случая применения предлагаемого в заявке способа возможна разработка новых ускоренных методов обнаружения тяжелых металлов в воде для мониторинга питьевой воды, воды естественных источников и стоков, загрязненных промышленными отходами.
1. Способ люминесцентного анализа для одновременного определения концентрации нескольких химических соединений в пробе, имеющих различные времена затухания люминесценции, отличающийся тем, что измеряют интенсивность люминесценции пробы посредством спектрофлуориметра с импульсным частотным возбуждением, обеспечивающим измерение указанной интенсивности с регулируемой задержкой по времени после возбуждающего импульса и с регулируемой длительностью строба, в течение которого интегрируется сигнал люминесценции, после заданной задержки его включения, при этом используют длительность строба и величину задержки, позволяющие разделить сигналы от химических соединений, обладающих различными временами затухания люминесценции при сопоставимых квантовых выходах люминесценции и обеспечить селективное определение концентрации указанных соединений в одной пробе.
2. Способ люминесцентного анализа по п.1, отличающийся тем, что дополнительно посредством указанного спектрофлуориметра определяют спектр возбуждения люминесценции пробы для определенных волн регистрации, времен задержки и длительностей строба наблюдения.
3. Способ люминесцентного анализа по п.1 или 2, отличающийся тем, что дополнительно посредством указанного спектрофлуориметра определяют спектр регистрации люминесценции пробы для определенных волн регистрации, времен задержки и длительностей строба наблюдения
