Способ оценки восстановительных процессов печени

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологической диагностике, и может быть использовано при клиническом обследовании больных с заболеваниями печени, в том числе для прогнозирования течения заболевания. Осуществляют морфологическую оценку состояния печеночной ткани на гистологических срезах. Морфометрические параметры получают при помощи калиброванной окулярной сетки, определяя следующие показатели: число митозов, число двухядерных клеток, число целых ядросодержащих клеток и число точек пересечения сетки, не попадающих на срезы гепатоцитов и их ядер. По результатам этих измерений рассчитывают: показатель функциональной клеточной массы, характеризующий паренхиматозно-стромальные отношения в единице объема ткани; показатель ядерной массы, отражающий ядерно-цитоплазматические отношения в единице объема ткани; индекс массы двухядерных клеток (ИМДК), свидетельствующий о степени реализации восстановительных резервов единицы объема печеночной ткани; масс-митотический индекс (ММИ), показывающий пролиферативную активность единицы объема печеночной ткани; показатель функционального кариоклеточного индекса, характеризующий количество ядерного материала в клетке в единице объема печеночной ткани; показатель средней площади среза гепатоцита, описывающий средний размер гепатоцита, пропорциональный его функциональной активности. Способ позволяет определить параметры, характеризующие степень и особенности текущих восстановительных (репаративных) процессов паренхимы, а также оценить потенциальные регенераторные возможности паренхимы. 3 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к морфологической диагностике, и может быть использовано при клиническом обследовании больных с заболеваниями печени, в том числе для прогнозирования течения заболевания.

Известен способ оценки морфологических изменений тканей печени при острой ишемии путем ее гистологического исследования и расчета показателя морфологических изменений гистоструктур паренхимы печени по определенным группам факторов, каждому из которых присвоен коэффициент, указывающий на значение этого фактора во всей рассматриваемой совокупности. Данными морфологическими факторами являлись: зернистая, гидропическая, балоная дистрофии, некроз, внутри- и внеклеточный холестаз, расширение синусоидов, центральных вен, желчных протоков, наличие в синусоидах стаза. Тяжесть поражения определяли сложением величин показателей информативности всех морфологических изменений ткани печени при острой гипоксии (Вятский медицинский вестник, 2002, №3, с.14-17, А.В.Муратов, В.П.Сухоруков).

Недостатками этого способа являются, во-первых, преобладающий элемент субъективности, т.к. авторами используется в основном бальная шкала оценок, известная своей условностью; во-вторых, способ ограничен оценкой паренхиматозных повреждений печеной ткани и связанной с этим сосудистой реакцией. Оценить репаративные возможности печеночной ткани невозможно, следовательно, невозможно прогнозировать течение и исход заболевания.

Задача изобретения: определение параметров, характеризующих степень и особенности текущих восстановительных (репаративных) процессов паренхимы, и оценка потенциальных регенераторных возможностей паренхимы.

Поставленная задача достигается применением морфометрической оценки функционирования гепатоцитов прямым определением на гистологических срезах ряда показателей: 1) количество ядросодержащих гепатоцитов, 2) число митозов гепатоцитов, 3) число 2-х и более ядерных клеток в срезах ткани печени и 4) число узлов (точек) стандартной окулярной морфометрической сетки (вариант сетки Г.Г.Автандилова), не попадающих в площадь среза клеток или их ядер.

Способ осуществляется следующим образом.

Определение предлагаемых показателей производится на окрашенных любым известным способом гистологических срезах ткани печени, изготовленных по стандартным методикам.

На первом этапе однократно определяются параметры окулярной сетки (вставки), с которой планируется вести исследование.

1. Подсчитывается общее число узлов (точек пересечения) сетки (Nузл);

2. С помощью объект-микрометра при различных увеличениях микроскопа определяется площадь сетки в кв.мкм (Sсет).

На следующем этапе в каждом поле зрения определяют 4 показателя:

1. Общее число целых ядросодержащих клеток, полностью укладывающихся в площадь окулярной сетки (ЧК).

2. Число митозов в площади окулярной сетки (ЧМ).

3. Число двухядерных клеток в площади окулярной сетки (ЧДК).

4. Число точек сетки, не попадающих на срезы гепатоцитов или их ядер (ЧСТ).

По результатам измерений рассчитываются следующие показатели:

1. Показатель паренхиматозной плотности (ПП) - равный (1-ЧСТ/Nузл). Этот комплексный показатель дает представление о функциональном ("полезном") объеме паренхимы на одиночном срезе ткани и характеризует, в частности, степень расширения кровеносных сосудов и желчных капилляров.

2. Функциональная клеточная масса (ФКМ) - равна (ЧК/Sсет)*ПП*10⁹ (количество гепатоцитов в 1 мм³ печени). Показатель дает представление о массоколичественных соотношениях в печени как в целом органе. Увеличение этого показателя (относительно среднестатистической нормы) свидетельствует об преобладании пролиферативных процессов, снижение - о застое крови (сердечная недостаточность - по величине снижения показателя можно судить о степени ее) или желчи. При снижении показателя и необходимости дифференцированной оценки причин можно дополнительно определить число точек сетки в площади кровеносных сосудов (Ткр) и число точек сетки в площади желчных капилляров (Тжел). Изменение соотношения Ткр/Тжел характеризует преобладающую причину снижения ФКМ.

3. Ядерная масса (ЯМ) - равна ((ЧК+ЧДК)/Sсет)*ПП*10⁹ (количество ядер гепатоцитов в 1 мм³ печени). Показатель дополняет ФКМ и уточняет, за счет какого количества ядерной массы (пропорционального объему ДНК) осуществляется функционирование печеночной ткани. Увеличение этого показателя происходит за счет формирования двух и более ядерных гепатоцитов, т.е. имеется прямая корреляция с изменением индекса двухядерных клеток. Если в просматриваемых препаратах встречаются в заметных количествах 3-х (ЧТК) и многоядерные (ЧМК) клетки, то расчет ЯМ следует проводить по более общей формуле: ЯМ=((ЧК+ЧКД+2*ЧТК+...+(Nяд-1)*ЧМК)/Sсет)*ПП*10⁹, где Nяд - число ядер в многоядерной клетке. Увеличение ЯМ (относительно среднестатистической нормы) свидетельствует о нарастании интенсивности функционирования ткани печени, снижение - о преобладании дегенеративных, деструктивных процессов. Количественная степень изменения показателя в ту или другую сторону пропорциональна интенсивности происходящих процессов.

4. Индекс массы двухядерных клеток (ИМДК) - равен ((ЧДК/ЧК)/Sсет)*ПП*10⁹ (средний индекс двухядерных клеток в 1 мм³ печени). Характеризует глубину репаративных резервов печеночной ткани. Уменьшение этого показателя (относительно среднестатистической нормы) свидетельствует о нарастании текущей интенсивности репаративных процессов (за счет "расходования двухядерных резервов") и, наоборот, увеличение показателя говорит о "накапливании потенциальных репаративных резервов печени". Таким образом, если ЯМ характеризует общую тенденцию развития процесса, то ИМДК оценивает глубину репаративного резерва при данном процессе. Крайне резкое снижение ИМДК характеризует декомпенсацию системы (выход за пределы "точки возврата").

5. Масс-митотический индекс (ММИ) - равен ((ЧМ/ЧК)/Sсет)*ПП*10⁹ (средний митотический индекс в 1 мм³ печени). Уточняет характеристику тенденции развития репаративных процессов. Увеличение показателя (относительно среднестатистической нормы) проходит, как правило, параллельно снижению количества ИМДК, что характерно для увеличения текущей (относительно кратковременной) интенсивности функционирования и снижения глубины репаративных резервов печеночной ткани.

6. Функциональный кариоклеточный индекс (ФККИ) - равен ЯМ/ФКМ. Характеризует среднее количество ядерного материала, приходящегося на 1 клетку в единице объема ткани печени. Увеличение показателя (относительно среднестатистической нормы) свидетельствует об интенсификации процессов при одновременном увеличении репаративного резерва печеночной ткани и наоборот, снижение показателя характерно для снижения репаративного резерва печени.

7. Средняя площадь среза гепатоцита (СПСЛ) - равна (Sсет/ЧК)*ПП (кв.мкм). Снижение показателя (относительно среднестатистической нормы) свидетельствует о высокой степени пролиферативной активности гепатоцитов (при одновременном повышении ММИ), повышение показателя - степень гипертрофических процессов, увеличение глубины репаративных резервов печени (при одновременном увеличении ИМДК).

Пример конкретного применения.

Первый этап:

Определям число точек сетки - нами использована сетка с количеством точек (узлов) Nузл=289, что соответствует 256 ячейкам (16×16 ячеек).

Определяем геометрические параметры сетки с использованием стандартного объект-микрометра (ОМПУ 4.2 1 деление = 0.01 мм) при различных увеличениях микроскопа:

Микроскоп - Axiostar-plus

Насадка - МФН-11, увел. 2.5х

Окуляры - К7х

Таблица 1
Увеличение	Число	Число	Сторона	Сторона	S одной	S всей
объектива	делений	ячеек	ячейки	сетки	Ячейки	сетки
	объект-мкм	сетки	(мкм)	(мкм)	(кв.мкм)	(кв.мкм)
10х	52	16	32.5	520.0	1056.3	270400.0
40х	11	15	7.3	117.3	53.3	13767.1
100х	3	10	3.0	48.0	9.0	2304.0

Второй этап:

Подсчет в последовательных полях зрения при микроскопии препарата печени следующих четырех показателей:

Увеличение объектива выбрано = 40х;

Таблица 2
№п/п	Число клеток в площади сетки	Число митозов в площади сетки	Число двухядерных клеток в площади сетки	Число свободных точек сетки
1	29	0	2	128
2	25	0	4	132
3	17	0	5	170
4	32	0	3	156
5	24	0	3	161
6	27	0	4	142
7	28	0	5	161
8	23	0	3	142
9	31	0	2	114
10	28	1	3	137
11	27	0	3	144
12	33	0	4	128
13	30	0	1	164
14	30	0	3	173
15	28	0	6	191

Третий этап:

По результатам измерений рассчитываем показатели по предлагаемым формулам:

Таблица 3
№ п/п	ПП	ФКМ*105	ЯМ*105	ИМДК*105	ММИ*105	ФККИ	СПСГ
1	0.56	11.8	12.6	0.03	0	1.07	265.8
2	0.54	9.8	11.4	0.06	0	1.16	297.4
3	0.41	5.1	6.6	0.09	0	1.29	332.0
4	0.46	10.7	11.7	0.03	0	1.09	197.9
5	0.44	7.7	8.6	0.04	0	1.11	252.4
6	0.51	10.0	11.5	0.05	0	1.15	260.0
7	0.44	8.9	10.5	0.06	0	1.18	216.3
8	0.51	8.5	9.6	0.05	0	1.13	305.3
9	0.61	13.7	14.6	0.03	0	1.07	270.9
10	0.53	10.8	11.9	0.04	0.01	1.10	260.6
11	0.50	9.8	10.9	0.04	0	1.11	254.9
12	0.56	13.4	15.1	0.05	0	1.13	233.6
13	0.43	9.4	9.7	0.01	0	1.03	197.3
14	0.40	8.7	9.6	0.03	0	1.10	183.6
15	0.34	6.9	8.4	0.05	0	1.22	167.2

Четвертый этап: стандартная статистическая обработка материала по стандартным методикам, требующимся в исследованиях конкретного применения.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что он предполагает определение всего четырех параметров при использование минимума стандартного оборудования, имеющегося в любой гистологической лаборатории (микроскоп, окулярная сетка и объект-микрометр), с последующим простым расчетом морфометрических показателей, характеризующих восстановительные процессы в объеме печеночной ткани. Предлагаемая методика обладает более высокой чувствительностью, чем известные, и позволяет обнаруживать изменения печеночной ткани в более ранних стадиях.

Способ оценки восстановительных процессов печени, включающий морфологическую оценку состояния печеночной ткани на гистологических срезах, отличающийся тем, что морфометрические параметры получают при помощи калиброванной окулярной сетки, определяя минимальное количество простых показателей: число митозов, число двухядерных клеток, число целых ядросодержащих клеток и число точек пересечения сетки, не попадающих на срезы гепатоцитов и их ядер и по результатам этих измерений рассчитывают: показатель функциональной клеточной массы, характеризующий паренхиматозно-стромальные отношения в единице объема ткани, по формуле ((общее число целых ядросодержащих клеток, полностью находящихся в площади окулярной сетки: площадь сетки)·ПП·10⁹), причем увеличение этого показателя, относительно среднестатистической нормы, свидетельствует о преобладании пролиферативных процессов, а снижение - о застое крови или желчи; показатель ядерной массы, отражающий ядерно-цитоплазматические отношения в единице объема ткани, по формуле: (((общее число целых ядросодержащих клеток, полностью находящихся в площади окулярной сетки + число двухядерных клеток в площади окулярной сетки): площадь сетки)·ПП·10⁹), причем увеличение этого показателя, относительно среднестатистической нормы, свидетельствует о нарастании интенсивности функционирования ткани печени, снижение - о преобладании дегенеративных, деструктивных процессов; индекс массы двухядерных клеток (ИМДК), свидетельствующий о степени реализации восстановительных резервов единицы объема печеночной ткани, по формуле ((число двухядерных клеток в площади окулярной сетки: общее число целых ядросодержащих клеток, полностью находящихся в площади окулярной сетки)·ПП·10⁹), причем уменьшение этого показателя, относительно среднестатистической нормы, свидетельствует о нарастании текущей интенсивности репаративных процессов; масс-митотический индекс (ММИ), показывающий пролиферативную активность единицы объема печеночной ткани, по формуле (((число митозов в площади окулярной сетки: общее число целых ядросодержащих клеток, полностью находящихся в площади окулярной сетки):площадь сетки)·ПП·10⁹), причем увеличение этого показателя, относительно среднестатистической нормы, свидетельствует об увеличении текущей интенсивности функционирования и снижении глубины репаративных поцессов печеночной ткани; показатель функционального кариоклеточного индекса, характеризующий количество ядерного материала в клетке в единице объема печеночной ткани, по формуле (показатель ядерной массы: показатель функциональной клеточной массы), причем увеличение этого показателя, относительно среднестатистической нормы, свидетельствует об интенсификации процессов при одновременном увеличении репаративного резерва печеночной ткани, а снижение - о снижении репаративного резерва печени; показатель средней площади среза гепатоцита, описывающий средний размер гепатоцита, пропорциональный его функциональной активности, по формуле ((площадь сетки: общее число целых ядросодержащих клеток, полностью находящихся в площади окулярной сетки)·ПП·10⁹), причем снижение этого показателя, относительно среднестатистической нормы, свидетельствует о высокой степени пролиферативной активности гепатоцитов при одновременном повышении ММИ, а повышение - увеличении глубины резервов печени при одновременном увеличении ИМДК.