Комбинированный клеточный трансплантат на основе лимфокинактивированных киллеров и дендритных клеток, способ его получения и способ лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний
Настоящее изобретение относится к области биофармакологии и медицины. Предложен способ получения мононуклеарных клеток крови: активированных лимфоцитов (ЛАК) и ДК, предусматривающий: а) выделение мононуклеарных лейкоцитов (МНК) из крови или костного мозга человека, нуждающегося в лечении или профилактике злокачественного новообразования, или инфекционного заболевания, или иммунодефицитного состояния; б) инкубацию выделенных мононуклеарных лимфоцитов в культуральной среде; в) разделения прилипающих и не прилипающих к пластику культурального флакона МНК; д) обработку ростовыми факторами прилипающих МНК для получения из них дендритных клеток; е) обработку ДК лизатом опухоли больного; ж) культивирование не прилипших к пластику лимфоцитов с интерлейкином-2 для генерации ЛАК-клеток. Предложен способ лечения и профилактики злокачественных и инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний у больных, нуждающихся в этом, заключающийся в комбинированном использовании дендритных клеток и ЛАК-клеток. Изобретение обеспечивает сочетанное воздействие на врожденный и адаптивный иммунитет. 3 н.п. ф-лы.
Настоящее изобретение относится к области медицины, связано с получением лимфокин-активированных киллеров и дендритных клеток и может быть использовано с целью профилактики и лечения онкологических заболеваний особенно у «групп риска» и при «семейных формах» рака, иммунодефицитных состояний как врожденных, так и приобретенных, в частности при вирусных и бактериальных инфекциях.
История исследований роли иммунной системы в противоопухолевой защите организма насчитывает около 40 лет. Многочисленные исследования, проведенные в течение этого периода, показали, что важная роль в этой защите отведена клеточному звену иммунитета, представленному в организме человека и животных рядом эффекторных клеток. Среди этого ряда особый интерес традиционно вызывали НК-клетки, относящиеся к лимфоидным клеткам, но отличающиеся фенотипически от Т и В лимфоцитов [Давыдов М.И., Нормантович В.А., Киселевский М.В., Волков С.М. и др. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование. - Российский онкологический журнал. 2000. - №6 - с.14-17].
Особая роль НК в противоопухолевом иммунитете подтверждена как способностью этих клеток лизировать опухолевые клетки in vitro, так и подтвержденной корреляцией между количественным уровнем этих клеток в организме и его способностью развивать противоопухолевую защиту. В частности, наблюдения за мышами инбредных линий показали, что различные линии этих животных характеризуются различными количественными уровнями НК. У мышей с высоким уровнем НК спонтанные или индуцированные опухоли встречаются редко, у мышей с низким уровнем частота спонтанных опухолей, наоборот, высокая. Трансплантация клеток от линий мышей с высоким уровнем НК линиям с низким уровнем этих клеток в эксперименте повышает резистентность рецепиентов к некоторым формам опухолей [Давыдов М.И., Нормантович В.А., Киселевский М.В., Волков С.М. и др. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование. - Российский онкологический журнал. 2000. - №6 - с.14-17].
Следует отметить, что одной из особенностью НК-клеток является присутствие на их поверхности киллинг-ингибирующего рецептора (KIR). Этот рецептор распознает антигены главного комплекса гистосовместимости I класса (MHC-I), представленные практически на всех нормальных клетках организма, и останавливает лизис клетки-мишени. Опухолевые клетки могут отличаться от нормальных отсутствием или снижением экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости, и тогда такие клетки становятся мишенями для НК. Если на опухолевых клетках экспрессируется MHC-I и уровень этой экспрессии нормальный, лизис НК-клеткой такой опухолевой клетки будет, вероятно, невозможен.
Изучение активности клеток лимфоидного ряда под воздействием различных цитокинов показало, что важную роль в активности как Т-лимфоцитов, так и НК-клеток играет интерлейкин-2 (ИЛ-2), активный компонент фактора роста Т-клеток (ФРТК). В 1980 году Yron и соавторы опубликовали сообщение о том, что в культуре нормальных спленоцитов мыши, содержащей ФРТК, генерируются клетки, способные лизировать свежевыделенные или культивируемые клетки сингенной саркомы. В дальнейшем эти результаты были подтверждены в опытах на мышах и лимфоцитах человека, и описанное явление получило название ЛАК-феномена, определяемого как «лизис свежевыделенных или культивированных опухолей in vitro лимфоидными клетками, активированными в культуре ИЛ-2». ЛАК-клетки отличаются от НК-клеток, присутствующих в образцах свежевыделенной лимфоидной ткани, как фенотипически, так и своей способностью лизировать свежевыделенные НК-резистентные опухолевые клетки-мишени [Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Основные свойства дендритных клеток. - Иммунология. 2001. - с.7-16].
Изучение ЛАК-феномена быстро перешло из лабораторий в клиник: у попытки использовать ЛАК-клетки в качестве терапевтического агента в лечении рака стали предприниматься Национальным онкологическим институтом США (NCI) уже с 1980-1981 года [Ярилин А.А. Основы иммунологии. - М.: Медицина, 1999. - стр.247-278]. За двадцать лет изучения феномена использовались как аутологичные, так и аллогенные ЛАК-клетки, ЛАК-клетки с различными фенотипами, инкубированные в течение разных сроков, предпринимались попытки использования для индукции активности различных цитокинов, изучались особенности опухолей, лизирующихся при воздействии ЛАК-клеток, использовались различные дозы и режимы введения ЛАК-клеток при различных опухолях.
Данные клинических исследований показали, что ЛАК-феномен, продемонстрировавший высокую противоопухолевую активность в преклинических исследованиях in vitro и in vivo на животных, впоследствии не оправдал возложенных на него надежд в лечении онкологических заболеваний человека. Многочисленные клинические исследования, проводимые на протяжении более чем 20 лет, показали, что эффективность системного применения ЛАК-клеток в отношении таких опухолей как меланома и рак почки не превышает эффективности стандартных методов лечения [Fernandez N.С., Flament С., Crepineau F., Angevin E., Vivier E., Zitovgel L. Dendritic cells (DC) promote natural killer (NK) cell functions: dynamics of the human DC/NK cross talk. - Eur. Cytokine Netw. 2002. - vol.13. - p.17-27].
При применения ИЛ-2/ЛАК-терапии были отмечены отдельные успехи при применении ЛАК-клеток в локорегионарном режиме, в частности при метастатических поражениях печени и легких [Freedman R.S., Platsoncas C.D. // Immunotherapy for peritonel ovarian carcinoma metastasis using ex vivo expanded tumorinfiltrating lymphocytes. // 1996. - Vol. 82. - p.115-116]. Также была отмечена эффективность данной терапии в лечении опухолевых плевритов при введении ИЛ-2/ЛАК в плевральную полость. Традиционно эту относительно более высокую эффективность связывают с тем, что локорегионарное применение ЛАК-клеток позволяет добиться более высокой концентрации ЛАК-клеток в области опухоли. Тем не менее, результаты применения локорегионарной терапии, так же как и системной, невозможно считать удовлетворительными, так как нет достаточно убедительных, статистически достоверных данных, свидетельствующих о постоянстве достигаемого в некоторых исследованиях противоопухолевого эффекта данной терапии. Также имеются сообщения, в которых отмечены неудовлетворительные результаты данного вида терапии [Ferlazzo, G., Wesa, A., Wei, W.Z., Guli, A. Dendritic cells generated from CD34+ progenitor cells or from monocytes differ in their ability to activate antigen-specific CD8+ Т cells. - J. Immunol. 1999. - vol.163. - p.3597]. Однако наличие отдельных успехов в применении ИЛ-2/ЛАК-терапии стимулировало интерес к изучению закономерностей распределения ЛАК-клеток in vivo с целью выяснения причин относительной эффективности локорегионарной терапии. Эти работы показывают, что при системном введении лишь очень незначительная часть клеток достигает опухоли-мишени.
В 1991 году Basse P. et all исследуют меченные флюоресцирующим соединением НК-клетки и устанавливают, что спустя некоторое время после введения они способны накапливаться в 10-кратных концентрациях в ткани метастазов в легких и печени [Ardavin С., Martinez del Hoyo G., Martin P., Anjuere P., Arias С.P., Marin A.R., Ruiz S., Parrillas V., Hemandes H. Origin and differentiation of dendritic cells. - Trends in Immunology. 2001. - vol.22. - p.691-700].
В 1999 году J.Kjaergaard et all публикуют исследование «Биораспределение и опухолевая локализация лимфокинактивированных Т-киллеров в зависимости от пути их введения животным-опухоленосителям» [Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. - Nature. 1998. - vol.392. - p.245-252].
Данное исследование продемонстрировало, что накопление меченых Т-ЛАК-клеток в органных метастазах прямо зависит от пути введения клеток в организм. При внутривенном введении интенсивность накопления ЛАК-клеток в метастазах, расположеных в легких, была в 5 раз интенсивней, чем в окружающей легочной ткани. В метастазах и здоровой ткани других органов накопления ЛАК-клеток при данном пути введения практически не наблюдалось. Напротив, при внутрипортальном пути введения наибольшее накопление ЛАК-клеток отмечалось именно в печени, а в легких и других органах клетки не определялись. При внутрисердечном (левожелудочковом) введении ЛАК-клеток отмечалось незначительное их накопление в тканях надпочечников, а при внутриперитонеальном введении было установлено, что ЛАК-клетки накапливаются в тех метастазах, которые не отделены от вводимых ЛАК-клеток тканью брюшины. Исследователи делают вывод, что на пути ЛАК-клеток существуют практически непреодолимые препятствия в микроциркуляторном русле таких органов, как печень и легкие.
Следует отметить, что несмотря на то, что ЛАК-клетки накапливаются в метастазах печени и легких при соответствующих путях введения, их концентрация для осуществления лизиса опухоли, по всей видимости, недостаточна. Таким образом, можно предположить, что эффективность ИЛ-2/ЛАК-терапии зависит не только от пути введения, но и от количества вводимых ЛАК-клеток и величины опухолевой массы. Кроме того, при избытке опухолевых клеток возможна обратная ситуация.
Приведенные данные и выводы этих исследований согласуются с результатами отдельных клинических исследований, продемонстрировавших эффективность локорегионарной ИЛ-2/ЛАК-терапии в адьювантном и лечебном режимах при метастатических поражениях легких и печени. Feuerstein В. et all в 2000 году публикуют результаты небольшого клинического исследования по адьювантной локорегионарной терапии метастазов рака поджелудочной железы в печень [Feuerstein В., Berger Т.G., Maczek С., Roder С., Schreiner D., Hirsch U., Haendle I., Leisgang W., Glaser A., Kuss O., Diepgen T.L., Schuler G., Schuler-Thurner B. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. - J. Immunol. Methods. 2000, vol.245, p.15-29]. 29 пациентов с раком поджелудочной железы III и IV ст. (по Japan Pancreas Society) были разделены на две группы, в обеих группах проводилась радикальная резекция рака поджелудочной железы и интраоперационная радиотерапия, в исследуемой группе дополнительно проводилась внутрипортальная ИЛ-2/ЛАК-терапия. Обе группы сравнивали впоследствии по выживаемости и частоте возникновения метастазов в печени. Спустя 3 года в опытной группе (n=12) выживших - 36% (n=4), в контрольной (n=17) - 0%, результат статистически недостоверен (р=0,082). Частота возникновения метастазов в печень была достоверно ниже в опытной группе, чем в контрольной: 2 из 12 против 10 из 15 (p<0,05).
Исследователи, получившие эффект от данной терапии, также отмечают необходимость применения высоких доз вводимых ЛАК-клеток, длительного режима терапии и максимальной предварительной циторедукции опухолевой массы с целью достижения оптимального соотношения ЛАК-клетки/опухолевые клетки.
Следующий трудноразрешимый вопрос, связанный с проблемами эффективности ЛАК-терапии, заключается в механизме узнавания опухолевой клетки клеткой-киллером и ее лизиса. Узнавание клетки-мишени клеткой-киллером может быть или не быть связанным с представлением на поверхности клетки-мишени чужеродных антигенов в комплексе с молекулами белков I класса МНС. Согласно классическим представлениям в иммунологии, цитотоксические лимфоциты лизируют клетки, представляющие на своей поверхности такие комплексы, а лизис, осуществляемый НК-клетками, не связан с MHC-I, т.к. НК-клетки экспрессируют киллингингибирующий рецептор, блокирующий лизис клетки-мишени при наличии на ее поверхности аутологичного МНС [Киселевский М.В., Блюменберг А.Г. Адоптивная иммунотерапия рака яичников. - Сборник статей, приуроченный к Европейской школе по онкологии, 2001, с.164-176].
Было показано, что при опухолевых плевритах эффективность введения ЛАК-клеток в плевральную полость составляет порядка 90%. Экспрессия MHC-I на опухолевых клетках в данном исследовании не определялась, однако, можно предположить, что вряд ли она была близкой к 0% у всех пациентов [Bindon J., Ruell P. et al. //. J. Immunol. 1984. - vol.3. - p.475-478].
Данные факты гипотетически могут свидетельствовать о том, что фенотип ЛАК не аналогичен фенотипу НК-клеток и что цитотоксичность ЛАК-клеток может быть не ограничена MHC-I32 ни в плане представления антигена, ни в плане торможения киллинга через киллингингибирующий рецептор (KIR). Возможно также, что цитотоксичность ЛАК-клеток зависит от еще каких-либо факторов, в настоящий момент неизвестных.
В любом случае в связи с вышеизложенным представляется необходимым фенотипирование используемых ЛАК-клеток, а также выяснение наличия корреляции между их цитотоксичностью и экспрессией на уже фенотипированых опухолевых клеточных линиях тех или иных антигенов.
Помимо этого несомненно важную роль в осуществлении противоопухолевого эффекта играют другие свойства опухоли: выраженность экспрессии сигнальных молекул, молекул адгезии, целого ряда ферментов, которые могут не экспрессироваться вообще или экспрессироваться в недостаточном количестве для осуществления контакта между киллером и мишенью. Также, возможно, играют роль факторы, выделяемые опухолью, - иммуносупрессивные и другие.
В последние годы исследователи различных специальностей уделяют большое внимание изучению противоопухолевого действия вакцин на основе дендритных клеток (ДК). Природа этого феномена связана со способностью ДК презентировать опухолевые антигены цитотоксическим Т-лимфоцитам. К настоящему времени изучены отдельные виды биологической активности ДК. Вместе с тем многие способы получения и противоопухолевые свойства вакцин на основе ДК остаются до конца не исследованными.
Зрелые ДК для противоопухолевых вакцин чаще всего получают из CD14+ моноцитов по 2-стадийной методике. На первой стадии моноциты развиваются в незрелые ДК в присутствии гранулоцит/макрофаг колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и интерлейкина-4 (ИЛ-4). Незрелые ДК обладают высокой способностью захватывать антигены путем макропиноцитоза и фагоцитоза (Banchereau J., Steinman R.M. Dendritic cells and the control of immunity. - Nature. 1998. - vol.392. - p.245-252; Keller R. Dendritic cells: their significance in health and disease. - Immunol. Letters. 2001. - vol.78. - p.113-122). В морфологическом и фенотипическом плане это крупные, неправильной формы слабо или не прилипающие к пластику клетки, значительно экспрессирующие костимулятор CD86 (В7-2), слабо экспрессирующие маркер моноцитов/макрофагов CD14 и маркер зрелых ДК CD83 (Hasebe, H., Nagayama, H., Sato, K., Enomoto, M., Takeda, Y., Takahashi Т.A., Hasumi K., Eriguchi M. Dysfunctional regulation of the development of monocyte-derived dendritic cells in cancer patients. - Biomed. & Pharmacother. 2000. - vol.54. - p.291-298; Morse M.A., Vredenburgh J.J., Lyerly H.K. А comparative study of the generation of dendritic cells from mobilized peripheral blood progenitor cells of patients undergoing high dose chemotherapy. - J. Hematother. Stem Cell Res. 1999. - vol.8. - p.577-584). В подавляющем большинстве экспериментов другой костимулятор CD80 (В7-1) экспрессируется много слабее, чем CD86, причем уровень его экспрессии по данным разных авторов варьирует в значительных пределах - 2-87%.
На второй стадии инициируется созревание ДК. Созревание ДК может происходить под воздействием ряда факторов: бактерий (живых или мертвых), бактериальных продуктов (ЛПС), вирусов, двунитевой РНК или ее аналога поли-I:C, провоспалительных факторов и их комбинаций (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6, простагландин-Е2 (ПГЕ-2)) и лиганда CD40 (CD40L) (Dhodapkar М.V., Steinman R.M., Sapp M., Desai H., Fossella С., Krasovsky J., Donahoe S.M., Dunbar P.R., Cerundolo V., Nixon D.F., Bhardwaj N. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. - J. Clin. Invest. 1999. - vol.104. - p.173-180; Keller R. Dendritic cells: their significance in health and disease. - Immunol. Letters. 2001. - vol.78. - p.113-122). По мере созревания они в значительной степени теряют способность эндоцитировать и процессировать антигены. Однако зрелые ДК сохраняют способность презентировать иммуногенные пептиды, не требующие предварительного процессинга внутри клетки (Sallusto F., Nicolo С., De Maria R., Corinti S., Testi R. Ceramide inhibits antigen uptake and presentation by dendritic cells. - J. Exp. Med. 1996. - vol.184. - N 6. - p.2411-2416). Зрелые ДК стабильно экспрессируют на своей поверхности комплексы молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) с пептидами (Cella M., Engering A., Pinet V., Pietras Т., Lanzavecchia A. Inflammatory stimuli induce accumulation of MHC class II complexes on dendritic cells. - Nature. 1997. - vol.388. - p.782-787). От незрелых ДК они отличаются также экспрессией характерных маркеров зрелых ДК - CD83 и DC-LAMP - члена семейства мембранных гликопротеинов, ассоциированных с лизосомами, кроме того, в значительной степени возрастает количество костимулирующих молекул. На поверхности зрелых ДК увеличивается количество адгезивных молекул CD54 и CD58, способствующих взаимодействию с Т-лимфоцитами (Keller R. Dendritic cells: their significance in health and disease. - Immunol. Letters. 2001. - vol.78. - p.113-122). Созревание в различных условиях может значительно повлиять на существенные функциональные характеристики ДК, такие как секреция ИЛ-12 (Ebner S., Ratzinger G., Krosbacher В., Schmuth M., Weiss A., Reider D., Kroczek R.A., Herold M., Heufler C., Fritsch P., Romani N. Production of IL-12 by human monocyte-derived dendritic cells is optimal when the stimulus is given at the onset of maturation and is further enhanced by IL-4. - J. Immunol. 2001. - vol.166 - p.633-641) и способность мигрировать (Luft Т., Jefford M., Luetjens P., Toy Т., Hochrein H., Masterman K.A., Maliszewski С., Shortman K., Cebon J., Maraskovsky E. Functionally distinct dendritic cell (DC) populations induced by physiologic stimuli: prostaglandin E2 regulates the migratory capacity of specific DC subsets. - Blood. 2002 - vol.100. - p.1362-1372). Как CD40L, так и убитые бактерии в значительной степени стимулируют образование ИЛ-12. Причем максимальное количество цитокина продуцируется в начальные моменты созревания. В то же время среда, кондиционированная моноцитами, ведет к созреванию ДК, не синтезирующих функциональный ИЛ-12 (Ebner S., Ratzinger G., Krosbacher В., Schmuth M., Weiss A., Reider D., Kroczek R.A., Herold M., Heufler C., Fritsch P., Romani N. Production of IL-12 by human monocyte-derived dendritic cells is optimal when the stimulus is given at the onset of maturation and is further enhanced by IL-4. - J. Immunol. 2001. - vol.166 - p.633-641).
ДК, обработанные опухолевым антигеном в присутствие факторов, повышающих его иммуногенность (ФНО-α; ИЛ-1β; CD40L; ЛПС; среда, кондиционированная моноцитами; аналог вирусной РНК - полиинозиновая-цитидиловая кислота), способны эффективно презентировать антиген и вызывать развитие Т-клеточного иммунного ответа на него, что было показано в ряде исследований in vitro, в экспериментах на животных и даже в опытах на здоровых добровольцах (Chen Z., Dehm S., Bonham К., Kamencic H., Juurlink В., Zhang X., Gordon J.R., Xiang J.S. DNA array and biological characterization of the impact of the maturation status of mouse dendritic cells on their phenotype and antitumor vaccination efficacy. - Cell Immunol. 2001. - vol.214. - p.60-71; Dhodapkar, M.V., Bhardwaj, N. Active immunization of humans with dendritic cells. - J. Clin. Immunol. 2000. - vol.20. - p.167-173; Nouri-Shirazi M., Banchereau J., Fay J., Palucka K., Dendritic cell based tumor vaccines. - Immunol. Letters. 2000. - vol.74. - p.5-10; Sallusto F., Lanzavecchia A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin-4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. - J. Exp. Med. 1994. - vol.179. - p.1109-1118). Эксперимент на добровольцах показал, что иммунный ответ на ДК развивался быстро, в течение 7 дней, но пик как CD4+, так и CD8+ Т-клеточных реакций на презентируемый антиген отмечался лишь через 1-3 месяца. Наблюдалось развитие Т-клеточной памяти. Однако при естественной вирусной инфекции возникает гораздо более сильный и прочный иммунный ответ (Dhodapkar М.V., Steinman R.M., Sapp M., Desai Н., Fossella С., Krasovsky J., Donahoe S.M., Dunbar P.R., Cerundolo V., Nixon D.F., Bhardwaj N. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. - J. Clin. Invest. 1999. - vol.104. - p.173-180).
Кроме типа используемых ДК, очевидно, важную роль также играют источник опухолевого антигена и способ введения ДК. В клинической практике до сих пор использовались, главным образом, белки и пептиды, а также в несколько меньшей степени опухолевые лизаты (Dhodapkar M.V., Bhardwaj N. Active immunization of humans with dendritic cells. - J. Clin. Immunol. 2000. - vol.20. - p.167-173; Keller R. Dendritic cells: their significance in health and disease. - Immunol. Letters. 2001. - vol.78. - p.113-122). Недостаток вакцин на основе конкретных пептидов или белков заключается, во-первых, в том, что не все ОАА уже идентифицированы. Кроме того, популяция клеток опухоли гетерогенна и часть клеток может не экспрессировать отдельный антиген (Dhodapkar M.V., Bhardwaj N. Active immunization of humans with dendritic cells. - J. Clin. Immunol. 2000. - vol.20. - p.167-173). Опухолевый лизат, очевидно, содержит широкий спектр различных антигенов, в том числе и неизвестные ОАА. Недавно появилось предварительное сообщение о применении ДК, трансфецированных тотальной опухолевой РНК, для лечения распространенных форм рака толстой кишки и легких (Nair S. K., Morse M., Boczkowski D., Cumming R.I., Vasovic L., Gilboa E., Lyerly H.K. Induction of tumor-specific cytotoxic Т lymphocytes in cancer patients by autologous tumor RNA-transfected dendritic cells. - Ann. Surg. 2002. - vol.235. - p.540-549). ДК индуцировали развитие ЦТЛ, способных специфически лизировать опухоль.
Способ введения ДК может существенно повлиять на их миграцию в лимфоидную ткань и их иммуногенность. Как было показано, ДК успешно добирались до лимфатических узлов при введении внутрикожно, но не внутривенно (Morse M.A., Coleman R.E., Akabani G., Niehaus N., Coleman D., Lyerly H.K. Migration of human dendritic cells after injection in patients with metastatic malignancies. - Cancer Res., 1999, vol.59, p.56-58). Однако сведения об иммуногенности ДК человека, введенных различными способами, отсутствуют. Сравнительное исследование на мышах позволяет предположить, что ДК, введенные внутривенно, менее иммуногенны, чем те, что были введены подкожно (Lappin M.В., Weiss J.M., Delattre V., Mat В., Dittmar H., Maier С., Manke K., Grabbe S., Martin S., Simon J.C. Analysis of mouse dendritic cell migration in vivo upon subcutaneous and intravenous injection. - Immunology. 1999. - vol.98. - p.181-188).
К данному моменту времени был проведен ряд клинических испытаний противоопухолевых вакцин на основе ДК. Hsu et al. (Hsu F.J., Benike C., Fagnoni F., Liles T.M., Czerwinski D., Taidi В., Englemann E.G., Levy R. Vaccination of patients with B-cell lymphoma using autologous antigen-pulsed dendritic cells. - Nature. 1996. - vol.392. - p.245-252) вводили 4 пациентам с фолликулярной лимфомой ДК крови, нагруженные специфичным для опухоли идиотипическим белком. Регрессия лимфомы наблюдалась у 3 пациентов. Nestle et al. использовали для лечения пациентов с распространенной формой меланомы моДК (Nestle F.О., Alijagic S., Gilliet M., Sun Y., Grabbe S., Dummer R., Burg G., Schadendorf D. Vaccination of melanoma patients with peptide-or tumor lysate-pulsed dendritic cells. - Natur. Med. 1996. - vol.2. - p.328-332). В качестве опухолевого антигена были использованы либо определенные меланомные пептиды либо опухолевый лизат. ДК были введены 16 пациентам в здоровые лимфатические узлы. У 11 пациентов наблюдалась реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в ответ на ДК, нагруженные пептидами, а у 5 пациентов наблюдалась объективная регрессия опухоли. В другом исследовании участвовало 11 пациентов с распространенной формой меланомы на IV стадии (Thurner В., Haendle I., Roder С., Dieckmann D., Keikavoussi P., Jonuleit H., Bender A., Maszek С., Schreiner D., von den Driesh P., Brocker E.B., Steinman R.M., Enk A., Kampgen E., Schuler G., Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte derived dendritic cell expands specific cytotoxic Т cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. - J. Exp. Med. 1999. - vol.190. - p.1669-1678). Использовались зрелые ДК, полученные из моноцитов, нагруженные меланомным пептидом MAGE-3A1. ДК вводили 5 дозами: 3 - подкожно и 2 - внутривенно. Наблюдались развитие иммунных реакций на антиген и экспансия цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), специфичных к MAGE-3A1. У 6 из 11 пациентов происходила регрессия отдельных метастазов. Интересно, что нерегрессирующие метастазы не экспрессировали мРНК MAGE-3A1. Имеются также сходные данные о перспективности применения ДК для лечения распространенных форм рака простаты, почек, щитовидной железы, молочной железы, толстой кишки, шейки матки, миеломы (Dhodapkar M.V., Bhardwaj N. Active immunization of humans with dendritic cells. - J. Clin. Immunol. 2000. - vol.20. - p.167-173; Jefford M., Maraskovsky E., Cebon J., Davis I.D. The use of dendritic cells in cancer therapy. - Lancet Oncol. 2001. - vol.2. - p.343-353; Keller R. Dendritic cells: their significance in health and disease. - Immunol. Letters. 2001. - vol.78. - p.113-122; Nouri-Shirazi M., Banchereau J., Fay J., Palucka K., Dendritic cell based tumor vaccines. - Immunol. Letters. 2000. - vol.74. - p.5-10).
В качестве прототипа может рассматриваться вакцина на основе ДК, полученная в результате пульсации зрелых ДК лизатом опухоли, активированные ИЛ-2 лимфоциты человека (ЛАК). Вместе с тем, каждый из этих методов имеет свои недостатки, поскольку воздействет лишь на одно из звеньев (врожденного или приобретенного) иммунитета. Кроме того, при совместном введении ДК и ЛАК способны повысить длительность существования друг друга в активном состоянии.
Задачей настоящего изобретения является получение трансплантата для осуществления комбинированной иммунотерапии, характеризующейся тем, что она сочетает одновременное воздействие на врожденный и адаптивный иммунитет и могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии онкологических и инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.
Предложен способ получения мононуклеарных клеток крови: активированных лимфоцитов (ЛАК) и ДК, предусматривающий следующие стадии:
а) выделение мононуклеарных лейкоцитов (МНК) из крови или костного мозга человека, нуждающегося в лечении или профилактике злокачественного новообразования, или инфекционного заболевания, или иммунодефицитного состояния;
б) инкубацию выделенных мононуклеарных лимфоцитов в культуральной среде;
в) разделение прилипающих и неприлипающих к пластику культурального флакона МНК;
д) обработку ростовыми факторами прилипающих МНК для получения из них дендритных клеток;
е) обработку ДК лизатом опухоли больного;
ж) культивирование не прилипших к пластику лимфоцитов с интерлейкином-2 для генерации ЛАК.
Предложен способ лечения и профилактики злокачественных и инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний у больных, нуждающихся в этом, заключающийся в комбинированном использовании противоопухолевой вакцины и ЛАК.
Предложен способ получения клеточного трансплантата, характеризующийся тем, что выделение МНК из периферической крови или костного мозга проводится центрифугированием в одноступенчатом градиенте фиколла.
Предлагаемый способ позволяет получать достаточное количество МНК из 100-400 мл периферической крови.
Культивирование МНК происходит в среде RPMI 1640 или DMEM с 5% человеческой сыворотки пациента (или АВ сыворотки донора) в одноразовых пластиковых флаконах, объемом 250 мл фирмы «Costar» или аналогичных флаконов других фирм. Для разделения клеток на моноциты /макрофаги (клетки, прикрепляющиеся к подложке) и лимфоциты (клетки, не прикрепляющиеся к подложке) МНК помещают в культуральные флаконы с питательной средой на время от 2 часов до суток и затем сливают неприкрепившиеся лимфоциты в другой флакон. Для получения незрелых ДК к оставшимся во флаконе прикрепившимся клеткам (моноцитам/макрофагам) добавляют гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4 (10 нг/мл). Для стимуляции созревания незрелых ДК в зрелые ДК могут использоваться провоспалительные факторы ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6 (10 нг/мл). Предпочтительным в соответствии с настоящим изобретением является созревание под действием ФНО-α (20 нг/мл). ДК, полученные из моноцитов/макрофагов периферической крови при инкубации с ростовыми факторами, имеют характерные особенности морфологической структуры и ультраструктуры. Для этих целей полученные в экстракорпоральных условиях незрелые ДК дендритные клетки (СD83low, СD86low, СD80low) инкубируют с лизатом опухоли вирусными и бактериальными антигенами и факторами индукции созревания ДК в течение 1 суток и получают зрелые пульсированные антигенами ДК (СD83high, CD86high, CD80high). Во флакон с лимфоцитами (неприкрепившиеся клетки) добавляют ИЛ-2 в концентрации 1000 МЕ/мл.
Способ лечения и профилактики злокачественных и инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний у больных, нуждающихся в этом, заключающийся в комбинированном использовании дендритных клеток и ЛАК-клеток, характеризуется тем, что полученная вакцина вводится подкожно, внутривенно, интраартериально или регионально (внутрибрюшинно, интраплеврально и другие полости). Настоящее изобретение эффективно для профилактики и лечения онкологических заболеваний, особенно у «групп риска» и при «семейных формах» рака, иммунодефицитных состояний как врожденных, так и приобретенных, в частности при вирусных и бактериальных инфекциях.
Опыты на мышах свидетельствуют о том, что эффективность защиты вакцины ослабевает через 3 мес. и требуется ревакцинация. С учетом разницы в продолжительности жизни мыши и человека можно рекомендовать для последнего повторные вакцинации с интервалом в 5-7 лет.
Для применения в клинике метод является эффективным и безопасным.
Клинический пример
Пациент Б., 36 лет.
Диагноз: метастазы рака ободочной кишки в печень, забрюшинные лимф. узлы. Состояние в процессе комплексного лечения. Группа крови: 0(1) положит.
22.11.02 правосторонняя гемиколэктомия по поводу рака восходящего отдела толстой кишки (гистология - умереннодифференцированная аденокарцинома, метастазы в лимф. узлы). В процессе операции выявлены множественные метастазы в обеих долях печени от 1 до 3.5 см, по поводу чего 27.12.02 произведена химиоэмболизация (доксорубицин - 70 мг + липиодол 10 мл) в правую печеночную артерию.
22.01.03 произведена левосторонняя гемигепатэктомия; высокочастотная термабляция оставшихся доступных метастатических узлов. Гистол. иссл 1028/03 - в печени метастазы малодифференцированного аденогенного рака. Ткань опухоли отрицательна по тимидин-фосфорилазе и тимидилат-синтетазе.
С 14 по 17.02.03 проведена 96-часовая инфузия в печеночную артерию 5-ФУ - 1400 мг/сут и лейковорина 50 мг/сут. В марте 2003 г. выявлены метастазы в забрюшинные лимф. узлы. С марта по август 2003 г. проведено 12 курсов химиотерапии по схеме: оксалиплатин - 170 мг - 1-й день; 5 - фторурацил - 800 мг - 1 й день в/в струйно и 5200 мг в/в капельно 46 часов. С учетом продолжающейся положительной динамики со стороны оставшихся очаговых изменений в печени и отсутствия новых очагов поражения больной переведен на длительный прием целекоксита по 200 мг 2 раза в день.
С учетом настоятельной просьбы больного и существующей целесообразности продолжения противоопухолевого лечения 14-16.10.03 произведены три болюсных введения ЛАК в СД - 920 млн клеток в печеночную артерию. В процессе лечения отмечались небольшая слабость, дискомфорт в правом подреберье, тошнота.
При контрольной МРТ от 17.11.03 положительная динамика - в правой доле печени определяется очаг 1.4×0.7 см (был 1.8×1.2 см от 03.09.03). Другие очаги не визуализируются. Забрюшинные лимф. узлы не увеличены. 15-17.12.03 внутрипеченочная ЛАК-терапия в СД - 632 млн клеток. При контрольном исследовании в результатах клинического и биохимического исследования крови отклонений от нормы не выявлено. При поступлении в феврале по данным МРТ с контрастированием (05.02) в правой доле печени участок с четкими контурами до 1.5 см - зона абляции. Убедительных данных за метастатическое поражение не получено. 16-18.02.04 в/арт., в/печеночно введено 780 млн ЛАК. При поступлении в апреле произведена пункционная биопсия оставшегося очага в печени - признаков опухолевого поражения не получено. РЭА - 0.74, СА 19.9-2.0.
19-21.04.04 в/арт, в/печеночно введено 740 млн ЛАК. При поступлении в июне признаков прогрессирования заболевания не выявлено. Попытка катетеризации печеночной артерии не удалась (облитерация и спазм). 07-09.06.04 620 млн ЛАК введено в/в. 16-18.08.04 в/в ЛАК - терапия в СД-850 млн клеток. 09-11.11.04 в/в 605 млн ЛАК. 24-26.01.05 - в/в 710 млн ЛАК. 18-20.04.05 в/в 700 млн ЛАК. 29.06-01.01.05 в/в кап 675 млн ЛАК. 19-21.09.05 в/в 485 млн ЛАК. 15-17.11.05 505 млн ЛАК. 17-19.01.06 - 605 млн ЛАК. 13-15.03.06 - 500 млн ЛАК. Реакций нет. Признаков прогрессирования заболевания нет.
1. Клеточный трансплантат для лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний, характеризующийся тем, что он содержит лимфоциты, активированные интерлейкином 2 и дендритные клетки (ДК), полученные путем инкубирования незрелых ДК с лизатом опухоли, или вирусными или бактериальными антигенами и факторами индукции созревания ДК (ФНО-α; ИЛ-1β; ИЛ-6).
2. Способ получения клеточного трансплантата для лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний, характеризующийся тем, что кровь или взвесь костного мозга центрифугируют в одноступенчатом градиенте фиколла, культивирование МНК, проводят в среде RPMI 1640 или DMEM с 5% человеческой сыворотки пациента или АВ сыворотки донора, далее клетки разделяют на моноциты/макрофаги, прикрепляющиеся к подложке и лимфоциты, не прикрепляющиеся к подложке, МНК помещают в культуральную среду на 2-4 ч и затем сливают неприкрепившиеся лимфоциты, для получения незрелых ДК, к оставшимся прикрепившимся клеткам моноцитам/макрофагам добавляют гранулоцит/макрофаг колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), далее для стимуляции созревания ДК используют провоспалительные факторы ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6 (10 нг/мл), при этом полученные в экстракорпоральных условиях незрелые дендритные клетки (CD83low, СD86low, CD80low) инкубируют с лизатом опухоли, или вирусными, или бактериальными антигенами и факторами индукции созревания ДК в течение 1 сут и получают зрелые пульсированные антигенами ДК (СВ83high, CD86high, CD80high), для получения ЛАК-клеток к лимфоцитам добавляют ИЛ-2 в концентрации 1000 МЕ/мл.
3. Способ лечения и профилактики онкологических, инфекционных заболеваний и иммунодефицитных состояний, характеризующийся тем, что клеточный трансплантат по п.1, и полученный по п.2, вводят подкожно, внутривенно, интраартериально или регионарно в дозе 50 млн - 2 млрд клеток.
