Ингибитор дифференцировки кроветворных клеток-предшественников
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения людей с заболеваниями, связанными с дифференцировкой кроветворных клеток-предшественников. В качестве ингибитора дифференцировки кроветворных клеток-предшественников используется органическое соединение селена, а именно: 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен. Данное изобретение обеспечивает повышение эффективности применения облучения и цитостатиков за счет снижения повреждающего действия указанных агентов на процесс кроветворения, тем самым, обеспечивая более эффективную защиту нормальных тканей. 10 табл.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при лечении людей с заболеваниями, сопровождающимися дифференцировкой кроветворных клеток-предшественников, а также для их профилактики.
Кроветворение представляет собой сложный многостадийный процесс клеточных делений и дифференцировок, в результате которого образуются зрелые, функционально полноценные клетки крови. Система крови представляет собой чрезвычайно динамичную, постоянно обновляющуюся ткань, в норме быстро и точно реагирующую на изменяющиеся запросы организма.
Выделяют 6 основных классов клеток крови, из которых 3 класса включают в себя клетки-предшественницы кроветворения. Класс стволовых клеток состоит из наиболее ранних кроветворных клеток, дающих начало всем клеткам системы крови. Для дифференцировки и пролиферации стволовых клеток необходимо кроветворное микроокружение, состоящее из клеток стромы (макрофагов, фибробластов, эндотелиальных, жировых и ретикулярных клеток), микрососудов и внеклеточного матрикса (фибронектин, гемонектин, ламинин, коллаген и мукополисахариды - сульфат гепарана).
Следующий класс клеток составляют ближайшие потомки стволовой клетки - полипотентные или бипотентные (коммитированные) клетки-предшественницы, дифференцировочный потенциал которых ниже стволовых. Эти клетки образуют колонии в различных средах, поэтому их называют колониеобразующими единицами (КОЕ). Следующий класс клеток составляют унипотентные клетки предшественницы, которые могут дифференцироваться только в направлении определенного ростка.
Известные способы защиты органов кроветворения от цитотоксического действия радиации и химиотерапии включают использование различных препаратов, большинство из которых являются антиоксидантами.
Повышение устойчивости клеток к вредным агентам, вызываемое антиоксидантами обусловлено двумя различными механизмами. Основной из них, как общеизвестно, обусловлен способностью антиоксидантов связывать окислительные радикалы образующихся в клетках, главным образом в момент облучения. Указанный механизм эффективен только в тех случаях, когда антиоксидант присутствует в клетках в момент образования радикалов, например в момент действия ионизирующей радиации или цитостатиков. Эффективность защиты с помощью этого механизма в довольно широких пределах прямо пропорционально содержанию антиоксидантов в клетках. При этом радиопротекторные свойства проявляются при действии излучения и в малых и в больших дозах. Основным недостатком этого механизма действия антиоксидантов при лечении онкологических больных является то, что радиозащитный эффект при их введении в организм проявляется не только в отношении нормальных, но и злокачественно перерожденных клеток, что сильно ограничивает использование антиоксидантов для защиты кроветворных и других клеток организма при противоопухолевой терапии. Радиозащитный эффект антиоксидантов может нивелировать максимально две трети, поражающего действия ионизирующего излучения.
Второй механизм повышения радиоустойчивости описан в патенте РФ №2234918 /А61К 31/375, 2004/ и связан с прооксидантными свойствами антиоксидантов. Он обусловлен изменением биологических свойств клеток, происходящих при введении антиоксидантов, и выражающимся проявлением так называемого адаптивного ответа. Адаптивный ответ возникает при введении только определенных количеств антиоксидантов и проявляется, в основном, после элиминации введенного экзогенного антиоксиданта из клеток. Основное достоинство этого механизма повышения радиоустойчивости заключается в длительности его проявления. Он регистрируется, начиная с 4 часа после введения препарата, и длится в течение 7 и более дней. Основным недостатком этого механизма является то, что он действует в основном при облучении в небольших повреждающих дозах. При этом повышении радиочувствительности не происходит более чем в 1,3-1,5 раза.
В настоящее время исследователи сфокусировали свои усилия на изучении клеток-предшественников у животных, подвергавшихся различным онкогенным или лучевым воздействиям. Полагают, что стволовые и другие ранние клетки-предшественники гемопоэза играют важную роль в процессах злокачественного роста и метастазирования опухолей.
Известно, что регулируют пролиферацию и дифференцировку клеток-предшественниц кроветворения, а также функцию зрелых клеток крови гемопоэтические факторы роста, такие как эритропоэтин и фактор роста - ликвер, которые сейчас используются в клинической практике. Данные факторы являются естественными стимуляторами роста и дифференциации кроветворных клеток и используются при различного рода иммунных нарушениях.
В то же время существенное значение имеют и ингибиторы указанных функций кроветворных клеток. В частности, было показано, что коррекция пролиферации и дифференцировки СКК in vitro с помощью ингибирующего воздействия может создать условия для более эффективной аутотрансплантации гемопоэтических клеток при аутоиммунной патологии.
В качестве ближайшего аналога может быть указан способ дифференциальной защиты нормальных стволовых клеток млекопитающего от воздействия химиотерапии или излучения, заключающийся в назначении защищающей стволовые клетки ингибирующей их пролиферацию композиции, полипептида, выбранного из группы, включающей альфа-глобиновую цепь гемоглобина, бета-глобиновую цепь гемоглобина, гамма-глобиновую цепь гемоглобина, дельта-глобиновую цепь гемоглобина, ипсилон-глобиновую цепь гемоглобина и зета-глобиновую цепь гемоглобина, и (b) фармацевтически приемлемый носитель (RU 2186579 С1, 2002.08.10). Данное решение касается регуляции путем воздействия на пролиферацию стволовых клеток, которые относятся к одному из типов кроветворных клеток-предшественников.
Однако о средствах для лечения состояний, сопровождающихся дифференцировкой, вызывающих временное блокирование дифференцировки кроветворных клеток-предшественников и тем самым обеспечивающих протекцию нормальных тканей, нам не известно.
Задача настоящего изобретения заключается в создании способа временного ингибирования дифференцировки кроветворных клеток-предшественников.
Предложено ингибирование дифференцировки кроветворных клеток-предшественников осуществлять введением в организм больного органического соединения селена, а именно 9-фенил-симметричного-октагидроселеноксантена формулы
В частности, применение 9-фенил-симметричного-октагидроселеноксантена в качестве ингибитора дифференцировки позволяет защитить клетки-предшественники костного мозга от действия радиации в дозе до 1,5 Гр и от действия цитостатиков.
В случае, если дифференцировка клеток-предшественников связана с опухолью, на которую воздействуют радиацией или химиотерапевтическим препаратом, за 5-9, предпочтительно за 7 суток до момента воздействия в организм однократно вводят 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен, вызывающий блокирование дифференцировки стволовых кроветворных клеток. Введение в организм может быть произведено перорально или инъекционно в предпочтительной дозе от 0,1 до 5 мг на кг массы тела.
В момент применения радиационного воздействия или введения цитостатиков дифференцирующиеся клетки-предшественники находятся на стадии дифференцировки, которая более устойчива к действию цитотоксических агентов.
Биологическая активность обусловлена главным образом не самим селеном, а молекулярным строением соединения в целом. В пользу такого утверждения свидетельствует следующее.
Соединения ксантенового ряда, к которым относится заявляемое вещество, обладают достаточно широким спектром биологических свойств. Причем их активность напрямую связана с химическим строением. Так, некоторые тиоксантены и тиоксантоны обладают высокой активностью в отношении шистоматоз, но замена метальной группы в них на метоксильную или атом хлора приводит к полной утрате их биологической активности / В.Г.Харченко, Т.И.Крупина, А.Ф.Блинохватов. Тиоксантены, гидротиоксантены и их производные. Издательство Саратовского университета, 1979, с.68-71/.
Далее, среди соединений этой группы имеются вещества, обладающие антимикробным, депрессивным и антидепрессивным действием, антигистаминной и жаропонижающей активностью, противоопухолевым действием. Следовательно, химическая природа данных соединений является определяющей.
Отметим, что в соединениях, о которых идет речь, селен отсутствует. Оказалось, что ксантеновые соединения являются хорошим предшественником для создания биологически активных соединений.
Заявленное соединение, относящееся к ксантеновому ряду, помимо всего прочего характеризуется тем, что в него введен селен. Установлено, что данное соединение способно активизировать некоторые системы организма. Однако о заявленных в изобретении свойствах ничего ранее не сообщалось. Разумеется, исключить то, что наблюдаемые эффекты отчасти связаны с селеном нельзя, но в то же время, очевидно, что в данном случае целое больше частей, т.е. мы имеем дело с соединением с новыми свойствами.
9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен может быть получен описанными ранее известными способами, например, по способу согласно RU 2221793, опубл. 2004.01.20.
Для доказательства соответствия изобретения условию применимости выполнены эксперименты на мышах с целью определения чувствительности к различного рода воздействий клеток костного мозга после введения препарата в оптимальных дозах.
Пример 1.
Изучение влияния 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантена на популяцию ранних кроветворных клеток-предшественников при различных повреждающих воздействиях.
Использовали 950 мышей двух линий - (СВАх С 57 В1/6) F1 самок. Облучение проводили на радитерапевтической установке «Луч-1» гамма-лучами 60Со при мощности дозы 0,9 Гр/мин. 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен вводили мышам-донорам костного мозга per os, в дозе 5,0 мг/кг в 0,2 мл масляного раствора за 1 или 3 или 7 суток до облучения повреждающий дозой 1,5 Гр, через 10-15 мин после облучения извлекали костный мозг, готовили суспензию клеток и вводили летально облученным мышам-реципиентам (8 Гр) той же линии для определения их колониеобразующей активности методом экзогенных селезеночных колоний. Через 9 суток мышей умерщвляли, извлекали селезенки и подсчитывали число колоний.
| Таблица 1 Влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена (5 мг/кг), введенного в различные сроки до облучения в дозе 1,5 Гр, на относительное содержание КОЕ-С в костном мозге. | ||||
| Облучение 1,5 Гр | Срок введения препарата до облучения, сут | Число мышей | Количество колоний на 105 клеток костного мозга М±m | Р |
| - | - | 30 | 10,5±0,6 | |
| - | 1 | 30 | 12,5±0,6 | |
| - | 3 | 30 | 10,7±0,4 | |
| - | 7 | 30 | 11,1±0,7 | |
| + | - | 30 | 3,6±0,3** | |
| + | 1 | 30 | 6,4±0,5 | р<0,001 |
| + | 3 | 30 | 9,1±0,5 | р<0,0001 |
| + | 7 | 30 | 12,7±0,7 | р<0,0001 |
| ** - достоверность рассчитана по отношению к данной группе |
Усредненные результаты трех независимых экспериментов по влиянию 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена на относительное содержание КОЕ-С в костном мозге, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что его введение мышам-донорам в дозе 5,0 мг/кг за 1 или 3 или 7 суток перед облучением в дозе 1,5 Гр приводит к тому, что выживаемость клеток данного компартмента значительно превышает таковую в облученном контроле. Эффект сохраняется в течение 7 суток. При этом отмечена выраженная зависимость от сроков введения препарата: минимальное действие (увеличение относительного содержания КОЕ-С в 2 раза по сравнению с облученным контролем) наблюдается при применении его за 1 сутки до облучения, а максимальный - за 7 суток, когда повреждающее действие ионизирующей радиации на популяцию КОЕ-С ослабляется почти в три раза. Следует заметить, что препарат, введенный в дозе 5 мг/кг в различные сроки до взятия костного мозга, сам по себе практически не влияет на относительное содержание КОЕ-С в костном мозге мышей-доноров.
Для того чтобы оценить возможность 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена восстанавливать популяцию стволовых кроветворных клеток при большей степени их повреждения, изучено его влияние на относительное содержание КОЕ-С в костном мозге при облучении в различных повреждающих дозах.
В экспериментах использовали 300 мышей линии (СВА × С57В1/6) F1 самок. Облучение проводили на радиотерапевтической установке «Луч-1» гамма-лучами 60Со при мощности дозы 0,9 Гр/мин. Препарат вводили мышам-донорам костного мозга per os, в дозе 5,0 мг/кг в 0,2 мл масляного раствора за 7 суток до облучения повреждающими дозами: 1,5, 2,0, 3,0 или 5,0 Гр. Через 10-15 мин после облучения извлекали костный мозг, готовили суспензию клеток и вводили летально облученным мышам-реципиентам (8 Гр) той же линии для определения их колониеобразующей активности методом экзогенных селезеночных колоний. Через 9 суток мышей умерщвляли, извлекали селезенки и подсчитывали число колоний.
Усредненные результаты трех независимых экспериментов представлены в таблице 2 и свидетельствуют, что через 7 суток после введения 9-фенил-симметричного - октагид-роселеноксантена мышам-донорам в дозе 5,0 мг/кг наблюдается статистически значимое повышение устойчивости КОЕ-С к воздействию ионизирующей радиации в дозах 1,5, 2,0, 3,0 и 5,0 Гр. Выживаемость клеток при всех повреждающих дозах, кроме 1,5 Гр, вдвое превышают значения облученного контроля, а при облучении 1,5 Гр - выживаемость КОЕ-С практически не отличается от значения интактного контроля.
Проведена оценка способности 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена восстанавливать популяцию КОЕ-С в костном мозге после действия цитостатиков.
В экспериментах использовали 150 мышей линии (СВА × C57B1/6)F1 самок. Облучение реципиентов проводили на радиотерапевтической установке «Луч-1» гамма-лучами 60Со при мощности дозы 0,9 Гр/мин. 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантен вводили мышам-донорам костного мозга per os, в дозе 5,0 мг/кг в 0,2 мл масляного раствора за 7 суток до инъекции цисплатина (цисплатин-лэнс, «ЛЭНС-ФАРМ» Москва) в дозах: 2,5, 5,0 и 7,5 мкг/кг. Через 24 часа после цисплатина извлекали костный мозг, готовили суспензию клеток и вводили летально облученным мышам-реципиентам (8 Гр) той же линии для определения их колониеобразующей активности методом экзогенных селезеночных колоний. Через 9 суток мышей умерщвляли, извлекали селезенки и подсчитывали число колоний.
Результаты экспериментов представлены в таблице 3 и свидетельствуют, что через 7 суток после введения 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена мышам-донорам в дозе 5,0 мг/кг наблюдается статистически значимое повышение устойчивости КОЕ-С к воздействию цисплатина в дозах 2,5, 5,0 и 7,5 мкг/кг. Выживаемость клеток при всех повреждающих дозах статистически значимо превышают значения цисплатинового контроля, а при дозе препарата 2,5 мкг/мышь выживаемость КОЕ-С практически не отличается от значения интактного контроля.
| Таблица 2 Влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена, введенного мышам за 7 суток до облучения в интервале доз, на относительное содержание КОЕ-С в костном мозге. | ||||
| Доза облучения Гр | Препарат 5 мг/кг | Число мышей | Количество колоний на 105 клеток костного мозга М±m | Р |
| - | - | 30 | 10,3±0,7 | |
| 1,5 | - | 30 | 3,5±0,2 | р<0,00001 |
| 1,5 | + | 30 | 9,2±0,2 | |
| 2,0 | - | 30 | 2,7±0,1 | р=0,016 |
| 2,0 | + | 30 | 3,6±0,3 | |
| 3,0 | - | 30 | 1,4±0,1 | р=0,009 |
| 3,0 | + | 30 | 2,1±0,1 | |
| 5,0 | - | 30 | 0,3±0,05 | р=0,01 |
| 5,0 | + | 30 | 0,6±0,06 |
| Таблица 3 Влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена, введенного мышам за 7 суток до инъекции цисплатина в интервале доз, на относительное содержание КОЕ-С в костном мозге. | ||||
| Доза цисплатина мг/кг | Препарат 5 мг/кг | Число мышей | Количество колоний на 105 клеток костного мозга M±m | P |
| - | - | 24 | 10,4±0,5 | |
| - | + | 24 | 10,5±0,5 | |
| 2,5 | - | 24 | 7,1±0,7 | |
| 2,5 | + | 24 | 9,9±0,6 | p=0,007 |
| 5,0 | - | 24 | 5,3±0,5 | |
| 5,0 | + | 24 | 8,1±0,3 | p=0,0004 |
| 7,5 | - | 24 | 4,1±0,3 | |
| 7,5 | + | 24 | 5,6±0,4 | p=0,02 |
Пример 2
Модифицирующее действие заявленного ингибитора при облучении животного организма неионизирующим излучением.
Исследовали защитные свойства 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена при облучении животного организма неионизирующим излучением на модели изучения образования микроядер в полихроматофильных эритроцитах периферической крови мышей линии С57 В1. Микроядра в интерфазном ядре, как правило, представляет собой ацентрические фрагменты хромосом. Животных подвергали воздействию электромагнитного излучения (ЭМИ) миллиметрового диапазона волн, частота 39,5 ГГц, длина 7,5 мм в течение 1 часа. Плотность потока энергии (ППЭ) составляла около 3 мкВт/см2, что в 300 раз меньше уровней, при которых возможен перегрев биообъекта из-за поглощения энергии поля.
Одной из групп мышей (n=5) за 7 суток до облучения вводили 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен из расчета 5 мг/кг массы тела перорально в 0,2 мл подсолнечного масла. Второй группе мышей (n=5) за 7 суток до облучения вводили исключительно 0,2 мл подсолнечное масло. В качестве контроля использовали интактных мышей. Через сутки после облучения животных забивали и определяли количество микроядер в полихроматофильных эритроцитах периферической крови. Из каждого образца проанализировано по 150 тыс. полихроматофильных эритроцитов.
Результаты исследования представлены в таблице 4.
| Таблица 4 Изменение частоты встречаемости полихроматофильных эритроцитов в периферической крови с микроядрами у мышей получивших и не получивших 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен, подвергнутые облучению ЭМИ. | |
| Воздействие | Частота микроядерных полихроматофильных эритроцитов × 103 |
| Интактные | 2,8±0,48 |
| Облучение | 12,2±1,28 |
| Ингибитор + облучение | 6,0±2,10 |
Таким образом, ингибитор дифференцировки клеток обуславливает не только радио-протекторное действие, но и защиту от любого другого рода облучения.
Пример 3.
Исследование влияния 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена на относительное количество низкодифференцированных предшественников клеток (CD34+) крови нормальных мышей, а также на состояние периферической крови у мышей на 2-ые сутки после облучения в дозе 1,5 Гр.
Проведено 4 серии экспериментов. Работа выполнена на 170 мышах гибридах (СВА × C57B1/6)F1 самках. При исследовании на нормальных мышах 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен вводили per os в дозе 5 мг/кг за 7 суток до взятия органов. В экспериментах на облученных мышах препарат вводили за 7 суток до облучения в дозе 1,5 Гр. Органы брали через 2 суток после облучения. Анализ периферической крови проведен на гемоцитометре. Аликвоты образцов периферической крови и костного мозга были исследованы с помощью проточной цитометрии на содержание низкодифференцированных CD34+ предшественников клеток крови мышей. Для этого доля CD34+клеток и плотность этого поверхностного маркера определены одновременно в периферической крови и костном мозге. В каждом образце крови проанализировано 80 тыс. клеток, в костном мозге - 40 тыс. В таблицах представлены усредненные результаты 4-х опытов.
Оценивали относительное количество CD34+ клеток и плотность этого поверхностного маркера в периферической крови и костном мозге. Введение препарата не влияет на относительное количество низкодифференцированных клеток стволового типа (CD34+). Однако к 7-м суткам после введения препарата увеличивается плотность этого маркера на поверхности клеток (р<0,05), свидетельствуя о перераспределении клеток по степени дифференцировки за счет увеличения доли наименее дифференцированных клеток. Аналогичная картина наблюдается и в периферической крови: по данным 4-х опытов доля CD34+ клеток в крови не меняется после введения 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена, но на 7-е сутки более дифференцированных предшественников становится меньше (Таблица 5).
| Таблица 5 Влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена на относительное содержание и интенсивность флюоресценции CD34+ клеток костного мозга и периферической крови мышей | ||||
| Воздействие | Периферическая кровь | Костный мозг | ||
| CD34+ клетки, % | Средняя интенсивность флюоресценции CD34+ клеток, отн.ед. | CD34+ клетки, % | Средняя интенсивность флюоресценции CD34+ клеток, отн.ед. | |
| Контроль | 0,25±0,04 | 199,1±25,2 | 0,85±0,1 | 105,8±7,2 |
| Введение препарата за 7 суток до анализа | 0,29±0,05 | 518,0±41,0 р=0,0000001 | 0,88±0,3 | 190,0±10,8 р=0,00001 |
Анализ качественных и количественных показателей клеточного состава периферической крови и костного мозга у облученных животных позволяет предположить, что 9-фенил-симметричный-октагидроселеноксантен вызывает блок дифференцировки кроветворных клеток-предшественников гранулоцитарно-макрофагального ростка, т.е. через 7 суток после введения препарата, к моменту облучения, в костном мозге накапливаются низкодифференцированные предшественники, более устойчивые к повреждающему действию радиации. Вероятно, облучение и последующее опустошение кроветворных органов отменяют блок дифференцировки, что приводит к увеличению численности в периферической крови уже на 2-е сутки после облучения лейкоцитов, гранулоцитов и моноцитов.
Анализ качественных и количественных показателей клеточного состава периферической крови и костного мозга свидетельствует, что 9-фенил-симметричный-октагидроселеноксантен вызывает блок дифференцировки кроветворных клеток-предшественников, т.е. через 7 суток после введения препарата, к моменту облучения, в костном мозге происходит перераспределение стволовых клеток в пуле по степени дифференцировки: а именно, увеличивается количество низкодифференцированных предшественников, более устойчивых к повреждающему действию радиации. Вероятно, облучение и последующее опустошение кроветворных органов отменяет блок дифференцировки, что приводит к увеличению численности лейкоцитов, гранулоцитов и моноцитов в периферической крови уже на вторые сут после облучения (Таблица 6).
| Таблица 6 Влияние 9-фенил-симметричного-октагидроселеноксантена, введенного за 7 суток до облучения в дозе 1,5 Гр, на численность клеток в периферической крови мышей | ||||||
| Облучение 1,5 Гр | Препарат 5 мг, кг | Лейкоциты | Гранулоциты | Моноциты | Лимфоциты | Тромбоц. |
| - | - | 5736±353 | 1478±275 | 1321±141 | 3092±354 | 635±20 |
| + | - | 1380±79* | 344±25* | 338±24* | 711±51 | 631±34* |
| + | + | 1875±200 р=0.025 | 486±54 р=0.02 | 460±49 р=0.02 | 796±146 | 675±27 р=0.009 |
| * - стастическая достоверность рассчитана по отношению к этой группе |
Накопление низкодифференцированных предшественников в костном мозге под действием 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена через 7 суток после введения препарата должно приводить к увеличению численности КОЕ-12, которые формируют селезеночные колонии на 12-е сутки роста. КОЕ-12 - низкодифференцированные, полипотентные предшественники, которые способны дать начало всем рядам кроветворения.
В экспериментах использовали 120 мышей линии (СВА × C57B1/6)F1 самок. Облучение проводили на радиотерапевтической установке «Луч-1» гамма-лучами 60Со при мощности дозы 0,9 Гр/мин. 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен мыши-доноры получали per os, в дозе 5,0 мг/кг в 0,2 мл масляного раствора за 7 суток до извлечения костного мозга. Суспензию клеток вводили летально облученным мышам-реципиентам (8 Гр) той же линии для определения их колониеобразующей активности методом экзогенных селезеночных колоний. Через 8 или 12 суток мышей умерщвляли, извлекали селезенки и подсчитывали число колоний.
Усредненные результаты двух независимых экспериментов, представленные в таблице 7, свидетельствуют, что через 7 суток после введения 9-фенид-симметричного-октагидроселеноксантена мышам-донорам в дозе 5,0 мг/кг в костном мозге последних происходит увеличение относительного количества низкодифференцированных КОЕ-С-12 при отсутствии влияния препарата на число более коммитированных КОЕ-С-8. Полученные данные свидетельствуют о накоплении в костном мозге на 7-ые сутки после действия 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена низкодифференцированных клеток-предшественников кроветворения.
| Таблица 7 Влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена, введенного мышам за 7 суток до извлечения костного мозга на формирование селезеночных колоний КОЕ-С-8 и КОЕ-С-12 | |||
| Препарат 5 мг/кг | Число мышей | Количество колоний на 105 клеток костного мозга на 8 сут (КОЕ-С-8) М±m | Количество колоний на 105 клеток костного мозга на 12 сут (КОЕ-С-12) М±m |
| - | 20 | 11,0±0,8 | 9,7±0,7 |
| + | 20 | 11,3±0,4 | 13,9±0,2 р=0,00004 |
Пример 4.
В следующей серии экспериментов исследовано влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена на опухолевые клетки при воздействии стандартного химиотерапевтического препарата - платидиама.
Результаты проведенного опыта приведены в таблице 8.
| Таблица 8 Результаты опыта по изучению модифицирующего действия ингибитора на лечебное действие платидиама на рост и метастазирование опухоли LCC у мышей С57 В1/6. | |||
| Группа | Масса опухоли г, М±m | Объем опухоли см3, М±m | Среднее число метастазов в легких, М±m |
| 1. Контроль | 6,4±0,5 | 6,2±0,7 | 8,8±0,6 |
| 2. Платидиам | 4,5±0,5* | 4,6±0,6 | 6,2±0,7* |
| 3. Ингибитор + Платидиам | 5,3±0,3 | 5,1±0,4 | 5,4±0,5* |
| * - р<0,05 по отношению к контролю |
Как можно видеть из данной таблицы, воздействие платидиама оказывает относительно слабое, но достоверное противоопухолевое действие по двум показателям - масса опухоли и число метастазов в легких. Введение мышам за 30 минут до химиопрепарата 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена не оказало существенного влияния на рост опухоли и на число метастазов в легких. Таким образом, в условиях данного эксперимента препарат 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен не влияет на рост и метастазирование опухоли, подвергнутой лечебному воздействию стандартного химиопрепарата - платидиама. Так как ингибитор в примененной концентрации способен снижать вредное действие препаратов цис-платины на некоторые нормальные ткани, то это может служить обоснованием для применения его в качестве избирательного протектора нормальных тканей при проведении химиотерапии злокачественных новообразований.
Усредненные результаты 3-х экспериментов по изучению влияния 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена в комплексе с радиотерапией на рост карциномы Льюис представлены в таблицах 9 и 10. Оказалось, что, как и в предыдущих экспериментах, ингибитор практически не влияет на рост опухоли, хотя значения ИР для этой группы и несколько меньше контрольных, но различия статистически не значимы. Тот же вывод можно сделать и в результате анализа совместного действия на опухоль 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена и облучения. В этом случае значения ИР для групп «облучение» и «9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена + облучение» во все сроки наблюдения статистически значимо не отличаются.
На 21-е сутки роста опухоли у выживших экспериментальных мышей было определено число метастазов в легких. Как видно из данных, представленных в таблице 10, 9-фенил-симметричный - октагидроселеноксантен не оказывает значимого влияния на процесс метастазирования как у необлученных, так и подвергнутых лучевому воздействию мышей - опухоленосителей.
И так, сочетанием действий 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена и локального облучения препарат не защищает опухолевые клетки от воздействия радиации и статистически значимо не усиливает метастазирование опухоли.
| Таблица 9 Значения индекса роста (ИР) карциномы Льюиса после введения ингибитора и локального облучения. | ||||||
| Группа | Значения ИР | |||||
| 0 сут | 2 сут | 4 сут | 7 сут | 9 сут | 11 сут | |
| Контроль | 1 | 1,8±0,05 | 2,2±0,1 | 4,3±0,4 | 5,8±0,4 | 7,5±0,6 |
| Ингибитор | 1 | 1,6±0,1 | 1,98±0,13 | 3,6±0,5 | 5,6±0,3 | 6,4±0,7 |
| Облучение | 1 | 1,6±0,1 | 1,3±0,2 | 1,4±0,4 | 2,3±0,7 | 3,6±1,0 |
| Ингибитор + облучение | 1 | 1,4±0,1 | 1,37±0,2 | 1,8±0,3 | 3,1±0,6 | 4,2±0,7 |
| Таблица 10 Влияние 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена и локального облучения на число метастазов в легких. | ||
| Препарат | Число мышей | Среднее кол-во метастазов |
| Контроль | 7 | 30,7±4,6 |
| Ингибитор | 10 | 33,5±2,5 |
| Облучение | 9 | 11,7±1,9 |
| Ингибитор + облучение | 9 | 13,4±1,8 |
Применение изобретения позволит повысить эффективность применения облучения и цитостатиков за счет снижения повреждающего действия указанных агентов на процесс кроветворения, посредством введения 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена. Введение 9-фенил-симметричного - октагидроселеноксантена не повышает резистентность опухоли к облучению.
Применение органического соединения селена формулы
в качестве ингибитора дифференцировки кроветворных клеток-предшественников.
