Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза
Изобретение относится к медицине, а именно к способам анализа биологических материалов. Сущность способа: пробу половых и соматических клеток для анализа берут из осадка центрифугированного эякулята. Приготавливают цитологические препараты нативных половых клеток обработкой их в течение часа раствором 0,55-0,56% хлористого калия при температуре 37,0-37,1°С; их последующей фиксацией в смеси метанолового спирта и ледяной уксусной кислоты с добавлением 0,1-0,2 мл хлороформа. Раскапывают на предметные стекла. Препарат высушивают и окрашивают красителем Гимза. Подсчитывают количество различных типов соматических клеток и, в основном, половых клеток на этапах их развития: сперматогониев, сперматоцитов1-первичных в профазе 1 мейоза, на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, лептотены, зиготены, пахитены, диплотены, диакинеза. Подсчитывают гаметы: число сперматоцитов 1 и 2 на стадиях метафазы 1 и 2 мейоза; сперматид и сперматозоидов; число неразошедшихся при делениях митоза и мейоза гамет, число дегенерирующих гамет. Сравнивают полученные числовые данные в виде индекса по каждой стадии с таковыми от контрольной группы, установленными по результатам обследования. Использование способа обеспечивает повышение точности и эффективности диагностики; расширение количества диагностируемых заболеваний - состояний. Неинвазивность способа исключает травму яичка и риск развития аутоиммунных осложнений. 2 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 ил.
Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза относится к медицине, к способам анализа биологических материалов, и может быть использован для диагностики нарушений сперматогенеза и бесплодия в урологии, андрологии, онкологии, ветеринарии и животноводстве. Традиционно для оценки состояния сперматогенеза известно использование 2-х подходов: спермиологический анализ эякулята, при котором практически характеризуют концентрацию, двигательную активность и морфологию сперматозоидов, наличие лейкоцитов, иных соматических клеток; округлых клеток сперматогенеза, но без их морфологической постадийной характеристики [1]. Недостатком способа является отсутствие количественного анализа по стадиям развития незрелых половых клеток и сперматозоидов эякулята, т.е. невозможность при выполнении спермиологического анализа эякулята получить информацию о физиологичности или нарушении прохождения половых клеток через все последовательные стадии сперматогенеза в целом.
Вторым традиционным подходом оценки разных этапов сперматогенеза является гистологический анализ препаратов срезов биоптата яичка с определением характеристики цикла сперматогенного эпителия, по расчету индекса половых клеток относительно числа клеток Сертоли [2].
Анализ проводят после изъятия фрагмента яичка (биопсия) и его фиксации, после обезвоживания кусочка биоптата яичка по спиртам восходящей концентрации и ксилолу, заливки в парафин, приготовления срезов и их окрашивания с последующим микроскопированием гистологических препаратов биоптата яичка. Недостатком способа является: травма яичка при хирургическом получении биоптата, развитие аутоиммунного процесса в яичке и нарушение сперматогенеза и плодовитости; время приготовления гистопрепаратов биоптата яичка составляет 3-5 дней; результаты анализа сперматогенеза получают на локальном участке яичка (биоптате), и их нельзя экстраполировать на все яичко в целом или на оба яичка, поскольку в них часто протекают локальные процессы. Кроме того, проведение биопсии яичка допускается только для пациентов с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени (ВОЗ, 1982, 1999, 1). Такие пациенты составляют не более 30% от числа мужчин, обращающихся к специалистам по поводу нарушения сперматогенеза и бесплодия. Т.е. около 70% мужчин не имеют возможности получения квалифицированной информации о причинах и степени нарушения сперматогенеза до его конечного этапа - до сперматозоидов.
Известен способ морфологической оценки клеточного состава какого-либо биологического материала, например половых клеток, в котором готовят мазки и анализируют их после окрашивания [3].
Данный «Способ количественной оценки эффективности сперматогенеза» из суспензии клеток биоптата яичка является наиболее близким техническим решением, принятым за прототип.
Данный способ включает взятие биоптата - 100 мг яичка, гомогенизацию ткани яичка и из капли полученной суспензии клеток делают на предметном стекле мазок, высушивают, окрашивают и с помощью микроскопа проводят дифференциальную диагностику и количественный подсчет отдельных групп клеток сперматогенеза. Недостатком мазков клеток является нечеткость цитологической картины состояния ядер и ядерных структур изучаемых клеток, что не позволяет идентифицировать каждую стадию профазы 1 и метафазы 1 и 2 мейоза гамет, характеризующуюся четкими отличиями по состоянию различных компонентов ядра гамет: степени конденсированности хроматина, идентифицируемости хромосом, наличию или отсутствию ядрышка, его морфологии. Кроме того, получение биопсии яичка показано лишь для ограниченной группы мужчин, менее 1/3 из большого числа тех, которым в связи с бесплодием и нарушением сперматогенеза необходимо иметь информацию о причинах нарушения детородной функции яичек.
Технической задачей предложенного способа является: исключение травматизма; повышение точности и эффективности диагностики; расширение количества диагностируемых заболеваний - состояний.
Техническая задача решена тем, что в способе цитологической диагностики нарушения сперматогенеза, включающем взятие пробы состава половых клеток-гамет, приготовление препарата половых клеток и проведение с помощью микроскопа дифференциальной диагностики и количественного подсчета различных групп клеток сперматогенеза для выявления нормы или различной формы патологии сперматогенеза, согласно изобретению пробу половых и соматических клеток для анализа берут из осадка центрифугированного эякулята, приготавливают цитологические препараты нативных половых клеток путем обработки их в течение 1 часа гипотоническим раствором 0,55-0,56% хлористого калия (KCl) при температуре 37,0-37,1°С с последующей их фиксацией в смеси метанолового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1 с добавлением 0,1-0,2 мл хлороформа, затем полученную клеточную суспензию раскапывают на влажные охлажденные предметные стекла, высушивают сухим воздухом с последующим их окрашиванием красителем Гимза и подсчитывают количество различных типов соматических клеток и в основном половых клеток на следующих этапах их развития: сперматогониев, сперматоцитов 1 - первичных в профазе 1 мейоза, на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, лептотены, зиготены, пахитены, диплотены, диакинеза; а также подсчитывают клетки: число сперматоцитов 1 и 2 на стадиях метафазы 1 и 2 мейоза; сперматид и сперматозоидов; число неразошедшихся при делениях митоза и мейоза гамет, число дегенерирующих гамет и затем сравнивают полученные числовые данные в виде индекса по каждой стадии с таковыми от контрольной группы, установленными по результатам обследования здоровых мужчин - доноров спермы, с нормальными набором хромосом - кариотипом и спермограммой; при этом контрольные индексы стадий развития половых клеток здоровых мужчин соответствуют следующим значениям: сперматогониев - 0,03-0,07%, сперматоцитов первичных на стадиях: от прелептотены до зиготены включительно - 0,57-0,81%; пахитен - 0,35-0,45%, диплотены - 1-2%, диакинеза - 0,03-0,07%, сперматоцитов в метафазе 1 и 2 - 0,03-0,07%, сперматоцитов 2 и сперматид - 91-93%, сперматоцитов 2 и сперматид, не разошедшихся в митозе гониев и в делениях созревания - 15-31%, дегенерирующих гамет - 4,9-6,9%, при этом доля незрелых половых клеток у здоровых мужчин с нормальной спермограммой не превышает 2-4%, а сперматозоидов 96-98% от общего числа половых клеток в эякуляте.
Техническая задача решена также тем, что при выявлении количества сперматогониев и сперматоцитов 1 на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, а также лептотены и зиготены для каждой стадии менее 0,01%; для достоверности анализа объединяют число клеток указанных стадий в одну группу - «допахитенные стадии», контрольный индекс которых не менее 0,7%.
Техническая задача решена также тем, что для исследования состояния хромосом гамет для остановки митоза сперматогониев или мейоза сперматоцитов 1 и 2 перед обработкой гипотоническим раствором хлористого калия, клетки из эякулята вначале обрабатывают статмокинетическими препаратами - колхицином - 0,25 мл, в концентрации 10 мгк/мл в 1 мл эякулята или колцемидом.
Положительный результат, получаемый при реализации предложенного способа, заключается в следующем:
- исключается травма яичка, отсутствует риск развития аутоиммунных осложнений;
- доступность, безопасность и простота получения клеточного материала;
- затрачивается в два раза меньше времени на приготовление препаратов клеток и проведение анализа;
- в 2-3 раза удешевляется выполнение всех этапов анализа;
- расширяется число диагностируемых заболеваний и состояний;
- определены эталонные значения соотношения разных стадий сперматогенеза в норме у здоровых мужчин детородного возраста, для сравнения патологии у обследуемых пациентов с установленной этим способом нормой;
- осуществляется возможность многократного проведения данного неинвазивного забора биоматериала и выполнения количественного анализа у одного мужчины;
- осуществляется возможность проведения данного неинвазивного забора материала и выполнения количественного цитологического анализа состояния сперматогенеза у любого лица мужского пола при достижении им полового созревания и осуществлении эякуляции, что ранее ограничивалось лишь получением биопсии яичка у лиц с азооспермией или олигозооспермией тяжелой степени
По сравнению с прототипом предложенный способ отличается операциями забора биопробы; приготовления препарата нативных половых клеток разных типов для анализа и операций количественного исследования сперматогенеза по разным последовательным стадиям развития гамет, что подтверждает критерий изобретения: «новизна».
Предлагаемый способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза апробирован на эякуляте 23 здоровых мужчин - доноров спермы, и у 627 пациентов с проблемами деторождения и с различными нарушениями сперматогенеза для выявления причин его нарушения и мужского бесплодия.
Во всех проведенных испытаниях результаты анализа положительные, и в каждом случае выявлены причины нарушения сперматогенеза. Это позволяет считать предложение заявителя соответствующим критерию «промышленная применимость».
Суть изобретения заключается в следующем: при реализации известного способа количественного анализа незрелых половых клеток из эякулята по стадиям их развития анализ и оценка сперматогенеза по биоптату яичка по рекомендациям ВОЗ выполняется лишь примерно для одной трети мужчин, только при азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени, которым такой анализ необходимо провести для диагностики и выявления причин бесплодия и нарушения сперматогенеза. В настоящее время предлагаемый способ позволяет оценить состояние сперматогенеза по цитологическому анализу клеточного состава эякулята, т.е. по анализу половых клеток на всех последовательных стадиях их развития, при отсутствии риска травматизации яичка, в любое время, для каждого мужчины. Кроме того, в предлагаемом способе проводят детальный и количественный анализ сперматогенеза по эякуляту, идентифицируя по цитологической картине хроматина, хромосом, ядрышка, ядер половых клеток разные стадии сперматогенеза.
Предложенный и отработанный способ позволяет проводить анализ состояния половых клеток на всех стадиях их развития количественным путем, получая пробу половых и соматических клеток для анализа из осадка центрифугированного эякулята. Автором впервые для половых клеток предложено приготовление цитологических препаратов нативных половых клеток не в виде мазков, а методом, отработанным для приготовления тотальных препаратов хромосом, но модифицированным для препаратов гамет. Обработка суспензии клеток в течение 1 часа гипотоническим раствором 0,55-0,56% хлористого калия (KCl) при температуре 37,0-37,1°С позволяет им обводняться и набухать. Последующая их фиксация в смеси метанолового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, в объеме 4 мл с добавлением 0,1-0,2 мл хлороформа создает определенное осмотическое состояние в клетке. Это позволяет гаметам при раскапывании 1-3 капель полученной клеточной суспензии с высоты 20 см от поверхности влажного охлажденного в морозильной камере до -1°С предметного стекла в максимальной степени распластываться на поверхности влажного стекла. Высушивание затем раскапанного препарата тотальных гамет под сухим воздухом позволяет достигать высокой степени прикрепления клеток к стеклу без использования специальных реактивов. Подсушивание стекол с клетками над пламенем горелки или спиртовки надо проводить с осторожностью при температуре 30-40°С, «на счет раз-два», сохраняя клетки от сжигания. Последующее их окрашивание ядерным красителем Гимза обеспечивает прокрашивание хроматина, хромосом и идентификацию их состояния при микроскопировании препарата. Микроскопический цитологический анализ проводят с использованием объектива 40 или при масляной иммерсии, при объективе 90 или 100 и окуляре 10 или 15. Такое увеличение обеспечивает идентификацию клеток по размерам и состоянию их ядерных структур. Кульминационный этап способа - проведение анализа различных типов соматических клеток и в основном - половых клеток на следующих этапах их развития. Схема сперматогенеза указана на фиг.1. Фотографии гамет на различных стадиях развития даны на фиг.2 и 3.
На фиг.1 показаны последовательные стадии развития мужских половых клеток, начиная с эмбрионального периода развития организма и самих гамет. Первичные половые клетки - гоноциты - мигрируют из эпибласта - зоны их формирования и обособления от соматических клеток в период от 15-ти дней до 4-х недель эмбрионального развития человека, делятся митозом и заселяют зачаток половых желез (гонад): яичко. В яичке гаметы определяют как сперматогонии, которые делятся митозом. Различают сперматогонии A1, A2, A3, А4, Пр (промежуточные), Б - которые превращаются в сперматоциты 1. Они проходят стадии профазы 1 мейоза: прелептотену (последний синтез ДНК), лептотену (начинают синтезироваться белки СК), зиготену (развивается конъюгация гомологичных родительских хромосом), пахитену (происходит обмен генами между гомологичными хромосомами), диплотену, диакинез. Далее протекают два деления мейоза, которые отмечают по наличию метафазы 1 и 2 мейоза. После метафазы 1, завершающейся ана- и телофазой 1 из одного сперматоцита 1 формируются два сперматоцита 2. Затем из каждого сперматоцита 2 формируются две сперматиды, из которых развиваются и созревают сперматозоиды (процесс спермиогенеза), приобретающие способность к движению (для встречи с яйцеклеткой) и проникновению в яйцеклетку (оплодотворение). Таким образом, незрелые половые клетки от гоноцитов и сперматогониев до сперматоцитов 2 и сперматид, и зрелые мужские гаметы - сперматозоиды являются предметом исследования и диагностики половых клеток.
На фиг.2 и фиг.3 приведены фото с нативных препаратов незрелых половых клеток: сперматоцитов 1 в лептотене (фиг.2а), зиготене (фиг.3ж), пахитене (фиг.2б, в, 3е), диплотене (фиг.2г, д), метафазе 1 (фиг.3з), неразошедшихся в митозе и мейозе сперматид (фиг.3и, к) и сперматозоидов (фиг.3к), полученных из эякулята доноров спермы, приготовленных и проанализированных по разработанному нами способу.
Использование индекса (числа) дегенерирующих гамет является исключительно авторским. Автор, впервые в научном мире, разработала и практически использовала схему такой оценки идентификации и количественного исследования именно всех перечисленных стадий не только в мужском, но и в женском гаметогенезе, у человека и различных видов животных, в многочисленных экспериментах и на клиническом материале. Результаты подсчета мужских гамет затем сравнивают (полученные числовые данные) в виде индекса по каждой стадии с таковыми от контрольной группы, установленными по результатам обследования 23-х здоровых мужчин - доноров спермы, с нормальными набором хромосом - кариотипом по лимфоцитам периферической крови и спермограммой. При этом контрольные индексы стадий развития половых клеток здоровых мужчин соответствуют следующим значениям: сперматогониев - 0,03-0,07%, сперматоцитов первичных на стадиях от прелептотены до зиготены включительно - 0,57-0,81%, стадия пахитены - 0,35-0,45%, диплотены - 1-2%, диакинеза - 0,03-0,07%, сперматоцитов в метафазе 1 и 2 - 0,03-0,07%, сперматоцитов 2 и сперматид - 91-93%, сперматоцитов 2 и сперматид, не разошедшихся в делениях созревания и в митозе гониев - 15-31%, дегенерирующих гамет - 4,9-6,9%. Доля незрелых половых клеток у здоровых мужчин с нормальной спермограммой не превышает 2-4%, а сперматозоидов соответственно 96-98% от общего числа подсчитанных половых клеток в эякуляте. Указанные контрольные индексы отработаны (по сперматогенезу доноров спермы) экспериментально и указаны в таблице 1 в качестве эталона.
Следует отметить, что при разработке предложенного способа цитологической диагностики нарушения сперматогенеза, включающего взятие клеточного осадка эякулята, приготовление раскапанного препарата половых клеток - гамет и соматических клеток, количественный морфологический анализ гамет по стадиям их развития, по последовательным стадиям сперматогониев, профазы, метафазы 1 и 2, ана-телофазы 1 и 2 мейоза сперматогенеза для выявления нормы или различной формы патологии этого процесса и отработке его выполнения на практике, для оценки степени информативности предложенного способа и для сравнения полученных нами количественных результатов по эякуляту одновременно проводили такой же количественный анализ состава незрелых и зрелых половых клеток на препаратах гамет, раскапанных на стекло из суспензии клеток от фрагмента биоптата яичка. Параллельно также оценивали морфологию и состав половых клеток на гистопрепаратах биоптата яичка этих же пациентов, которым выполняли биопсию яичка в клиниках Москвы, в связи с азооспермией или тяжелой формой олигозооспермии неясной этиологии.
По предлагаемому способу удалось выявить, что в эякуляте мужчин с азооспермией или олигозооспермией из общего числа половых клеток 98% составляли незрелые гаметы, из них у некоторых мужчин более 50% были сперматоцитами 1 на стадии пахитены, более 11% половых клеток - на стадии диплотены. Это свидетельствует о выявленных нарушениях: о задержке сперматогенеза на стадиях пахитены и диплотены или других стадиях. Сравнительный количественный анализ состава незрелых половых клеток, полученных из суспензии биоптата этих же мужчин, подтвердил блок сперматогенеза на стадиях пахитены и диплотены или других стадиях. Число дегенерирующих гамет было также выше по сравнению с контрольными показателями - у доноров спермы. Предложенный способ позволяет более точно выявлять нарушение конкретных стадий формирования сперматозоидов. Значительно сниженное количество сперматид и сперматозоидов также свидетельствует о том, что лишь малая доля половых клеток проходит через эти заключительные стадии сперматогенеза, а у некоторых пациентов сперматозоиды отсутствовали вообще (азооспермия). Таким образом, анализ состояния сперматогенеза по предложенному способу позволяет в каждом клиническом случае найти причины патологии развития гамет, т.е. бесплодия. Кроме этого, даже при малом числе клеток в эякуляте (и на препарате) (менее 0,01%) на стадиях сперматогониев, сперматоцитов 1 - прелептотены, лептотены, зиготены, экспериментально подтверждена возможность их объединения и использование общего для этих стадий индекса - «допахитенные стадии», с нормативным показателем 0,71% (см. таблицу 1, Доноры спермы).
Для более детального исследования хромосом и/или идентификации стадии сперматогенеза отработана техника остановки митоза сперматогониев или мейоза сперматоцитов 1 и 2 колхицином до операции гипотонии клеток хлористым калием. Колхицин в концентрации 10 мгк/мл на 1 мл эякулята или аналогичный ему по действию колцемид добавляют 0,25 мл раствора на 1 час. Происходит блокирование, т.е. остановка митоза и мейоза в гаметах, и их можно исследовать (фиг.3е, з).
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
С помощью предложенного способа в группе из 27 мужчин - ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС, мы выявили частичный блок сперматогенеза в сперматоцитах 1, на стадиях прелептотена-лептотена-зиготена профазы 1 мейоза и значительное снижение доли сперматоцитов 1 на стадии пахитены (1,18±0,42 и 0,10±0,03 соответственно). По сравнению с этими показателями у обследуемых у доноров спермы эти показатели эякулята соответственно составляли 0,66±0,16 и 0,45±0,10 (таблица 1). Это объясняет снижение среднего значения концентрации сперматозоидов в эякуляте у ликвидаторов ЧАЭС по сравнению с таковыми показателями у доноров спермы 46,90±4,50 и 105,67±7,32 млн/мл эякулята соответственно.
Во всех проведенных испытаниях в каждом случае выявлены причины нарушения сперматогенеза и бесплодия.
Пример 2.
Пациент М.Б. по поводу бесплодия неясной этиологии и олигозооспермии тяжелой степени после получения биопсии яичка обратился для обследования в лабораторию генетики нарушений репродукции Медико-генетического научного центра (МГНЦ РАМН). Кариотип 46, ХУ (норма). Выполнен цитологический анализ состава по стадиям развития незрелых половых клеток и сперматозоидов из эякулята. Для сравнения информативности этого способа такой же анализ проведен на препаратах раскапанных половых клеток из приготовленной нами суспензии от фрагмента биоптата яичка, параллельно оценивали состояние сперматогенеза на гистопрепаратах биоптата яичка. По эякуляту из общего числа гамет 98% составляли незрелые половые клетки (в норме их должно быть не более 2-4%), из них более 50% были сперматоцитами 1 на стадии пахитены, более 11% ПК - на стадии диплотены профазы 1 мейоза (табл.1, продолжение, МБ). Это свидетельствует о задержке - блоке сперматогенеза на стадиях пахитены и диплотены и объясняет причину снижения концентрации сперматозоидов (олигозооспермия) и бесплодие у пациента М.Б,. Количественный анализ состава незрелых половых клеток, полученных из суспензии клеток биоптата, подтвердил блок сперматогенеза на стадиях пахитены и диплотены, выявленный по гаметам из эякулята. Число дегенерирующих гамет из эякулята было также выше по сравнению с контрольными показателями у доноров спермы. Значительно сниженное количество сперматид и сперматозоидов также свидетельствует о том, что лишь малая доля половых клеток проходит через эти заключительные стадии сперматогенеза, и это объясняет причину олигозооспермии тяжелой степени и бесплодие.
Пример 3.
Пациент П.О., бесплодие в двух браках, олигозооспермия. При выполнении биопсии обоих яичек П.О. обратился для оценки состояния сперматогенеза по биоптату и для цитогенетического обследования в МГНЦ РАМН. Кариотип 46, ХУ (норма). Выполнен цитологический анализ состава по стадиям развития незрелых половых клеток и сперматозоидов из эякулята и для сравнения информативности этого способа - такой же анализ проведен на препаратах раскапанных половых клеток из приготовленной нами суспензии от фрагмента биоптата яичка. Параллельно оценивали состояние сперматогенеза на гистопрепаратах биопсии яичка. По эякуляту, исследованному данным способом, из общего числа гамет 71,4% составляли незрелые половые клетки (в норме - не более 2-4%), из них 3,3% были сперматоцитами 1 на стадии пахитены, 27,7% половых клеток - на стадии диакинеза-метафазы 1, (табл.1, продолжение, П.О.), что значительно выше уровня этих показателей в норме, у доноров спермы. Это свидетельствует о задержке сперматогенеза на стадиях пахитены и диакинеза-метафазы 1. Цитологический анализ состава незрелых гамет, полученных из суспензии биоптата, подтвердил блок сперматогенеза на стадиях пахитены и диакинеза-метафазы 1. Число дегенерирующих гамет было также значительно выше (около 70%) по сравнению с контрольными показателями. Значительно сниженное количество сперматид и сперматозоидов также свидетельствует о том, что лишь малая доля половых клеток проходит через эти заключительные стадии. Т.е. выявление блока на стадиях пахитены профазы 1 мейоза и диакинеза-метафазы 1 объяснило причину олигозооспермии у данного пациента и бесплодия.
Пример 4.
В группе пациентов (17 мужчин) с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте) в большинстве случаев при анализе половых клеток из эякулята сперматозоидов не выявляли (табл.1). При сравнении этих результатов с данными анализа половых клеток из суспензии биоптата яичка и данными исследования гистопрепаратов биоптата яичка подтвердился диагноз - азооспермия, отсутствие сперматозоидов и незрелых половых клеток не только в эякуляте, но и в биоптате. В этих случаях был правомочен диагноз - Синдром клеток Сертоли только. Но у части мужчин с азооспермией незрелые половые клетки выявлены: сперматоциты 1 на стадии диплотены, сперматоциты 2 и сперматиды, треть из сперматид - неразошедшиеся, 13,1% гамет - в дегенерации. Такие нарушения являются причиной азооспермии и бесплодия.
Пример 5.
У некоторых пациентов (примерно у 30% лиц) с азооспермией в эякуляте с помощью предложенного способа были выявлены незрелые половые клетки. Наличие их было подтверждено затем при анализе половых клеток в суспензии биоптата яичка и на гистопрепаратах биоптата яичка. Например, у пациента Н.П. с азооспермией, кариотип 46, ХУ; в двух образцах эякулята был выявлен блок на трех стадиях сперматогенеза: на стадиях предпахитены, на стадии диплотены и на стадиях диакинез-метафаза 1 и метафаза 2, а также снижено число сперматоцитов 2 и сперматид (табл.1). Это объясняет причину отсутствия сперматозоидов в эякуляте и бесплодие.
Пример 6.
У пациента Д., отмечено бесплодие в течение 16 лет вследствие азооспермии. Кариотип 46, ХУ. В МГНЦ РАМН при проведении цитологического анализа состава незрелых гамет и сперматозоидов из эякулята нами были выявлены единичные сперматоциты 1 на стадии зиготены и высокий уровень дегенерирующих незрелых гамет (табл.1, продолжение, Д.), что являлось причиной азооспермии и бесплодия.
На основании результатов цитологического анализа состава незрелых половых клеток у этих пациентов выявлен блок сперматогенеза на стадии пахитены. Поэтому рекомендовано проведение дальнейшего анализа - исследование поведения синаптонемного комплекса (СК) мейотических хромосом (4). Как и у пациента М.Б. (Пример 2), у пациента П.О. (Пример 3) выявлено нарушение формирования СК, конъюгации хромосом и другие аномалии поведения хромосом в мейозе - т.е. установлены определенные мейотические мутации - особая группа наследственных заболеваний, приводящая к нарушению сперматогенеза и бесплодия. Эти мейотические мутации выявляются лишь при анализе хромосом половых клеток на стадиях зиготены и пахитены профазы 1 мейоза. У пациента Д. (Пример 6) в сперматоцитах 1 из биоптата яичка не выявлено даже фрагментов СК, наблюдали «пустые» ядра (фиг.3ж) (диагноз - асинаптическая мутация, самостоятельное заболевание, отражающееся только на хромосомах в мейозе, генетическая причина бесплодия). Без проведения цитологической диагностики нарушения сперматогенеза, без подсчета состава незрелых гамет по эякуляту по предложенному способу невозможно было бы рекомендовать исследование поведения СК хромосом и диагностировать нарушения сперматогенеза и бесплодие.
Данный способ используется в онкологии с целью охраны (сохранения) детородной функции при терапии опухолей; в животноводстве - для сохранения производительной функции животных, в том числе - ценных пород. Кроме того, предложенный способ может быть использован в токсикологических исследованиях при повышении уровня загрязнения среды обитания.
Таким образом, предлагаемый способ используется как в диагностических целях, в том числе для выявления мейотических мутаций, мало изученных состояний бесплодия, так и для мониторинга результатов лечения мужчин с бесплодием для оценки состояния сперматогенеза в экстремальных ситуациях, в том числе при повышении уровня загрязненности среды обитания.
Источники информации
1. Руководство ВОЗ по лабораторному исследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. 4-е изд. Изд-во Cambridge University Press, 1999. Перевод Р.А.Нерсесяна, научный редактор русского перевода проф. Л.Ф.Курило. Москва: МедПресс, 2001, с.18-21, с.73-75.
2. Патент РФ №2199117 кл. G01N 33/48 Опубликован 20.02.2003 г.
3. Патент РФ №2231979 кл. А61В 10/00 Опубликован 10.07.2004 г. - прототип.
4. Коломиец О.Л. Синаптонемный комплекс как индикатор хромосомной изменчивости. Диссертация в форме научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук, РАН, Ин-т общей генетики им. Н.И.Вавилова, Москва, 1998, 61 с.
1. Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза, включающий взятие пробы состава половых клеток - гамет, приготовление препарата половых клеток и проведение с помощью микроскопа дифференциальной диагностики и количественного подсчета различных групп клеток сперматогенеза для выявления нормы или различной формы патологии сперматогенеза, отличающийся тем, что пробу половых и соматических клеток для анализа берут из осадка центрифугированного эякулята, приготавливают цитологические препараты нативных половых клеток путем обработки их в течение 1 ч гипотоническим раствором 0,55-0,56%-го хлористого калия (KCl) при температуре 37,0-37,1°С, с последующей их фиксацией в смеси метанолового спирта и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1, с добавлением 0,1-0,2 мл хлороформа, затем полученную клеточную суспензию раскапывают на влажные охлажденные предметные стекла, высушивают сухим воздухом с последующим их окрашиванием красителем Гимза и подсчитывают количество различных типов соматических клеток и, в основном, половых клеток на следующих этапах их развития: сперматогониев, сперматоцитов 1 - первичных в профазе 1 мейоза, на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, лептотены, зиготены, пахитены, диплотены, диакинеза; а также подсчитывают гаметы: число сперматоцитов 1 и 2 на стадиях метафазы 1 и 2 мейоза; сперматид и сперматозоидов; число неразошедшихся при делениях митоза и мейоза гамет, число дегенерирующих гамет и затем сравнивают полученные числовые данные в виде индекса по каждой стадии с таковыми от контрольной группы, установленными по результатам обследования здоровых мужчин - доноров спермы, с нормальным набором хромосом - кариотипом и спермограммой; при этом контрольные индексы стадий развития половых клеток здоровых мужчин соответствуют следующим значениям: сперматогониев 0,03-0,07%, сперматоцитов первичных на стадиях: от прелептотены до зиготены включительно 0,57-0,81%; пахитены 0,35-0,45%, диплотены 1-2%, диакинеза 0,03-0,07%, сперматоцитов в метафазе 1 и 2 0,03-0,07%, сперматоцитов 2 и сперматид 91-93%, сперматоцитов 2 и сперматидов, не разошедшихся в делениях созревания и в митозе гониев, 15-31%, дегенерирующих гамет 4,9-6,9%, при этом доля незрелых половых клеток у здоровых мужчин с нормальной спермограммой не превышает 2-4%, а сперматозоидов 96-9 8% от общего числа половых клеток в эякуляте.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при выявлении количества сперматогониев и сперматоцитов 1 на стадиях прелептотенной конденсации и деконденсации хромосом, а также лептотены и зиготены для каждой стадии менее 0,01%; для достоверности анализа объединяют число клеток указанных стадий в одну группу - «допахитенные стадии», контрольный индекс которых не менее 0,7%.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для исследования состояния хромосом гамет для остановки митоза сперматогониев или мейоза сперматоцитов 1 и 2 перед обработкой гипотоническим раствором хлористого калия клетки из эякулята вначале обрабатывают статмокинетическими препаратами - колхицином 0,25 мл, в концентрации 10 мгк/мл в 1 мл эякулята или колцемидом.
