Способ получения диагностического реагента тромбопластина полного из плаценты человека
Изобретение относится к медицине и касается технологии получения реагента тромбопластина полного, применяемого для определения протромбинового времени плазмы крови человека.. Предложен способ получения диагностического реагента тромбопластина полного из плаценты человека, который заключается в том, что плаценту человека отмывают 5-кратно очищенной водой и 3-кратно 0,9% раствором натрия хлорида до содержания гемоглобина в смывных водах не более 0,5 мг/мл, гомогенизируют механически и ультразвуком по выбранному режиму до получения частиц не более 0,02 мм, вводят сахарозу для получения 0,5% раствора, перемешивают и подвергают сублимационному высушиванию. Изобретение обеспечивает создание способа получения диагностического реагента тромбопластина полного из плаценты человека, имеющего высокую тромбопластическую активность до и после сублимационной сушки. 1 табл.
Изобретение относится к медицине и используется для получения диагностического реагента тромбопластина полного, применяемого для определения протромбинового (тромбопластинового) времени плазмы крови человека.
Отражая состояние внешнего пути свертывания крови, протромбиновое время широко используется в клинико-диагностических лабораториях для скринингового исследования свертывающей системы, контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия, диагностики заболеваний печени, выявления дефицита витамина К. Принцип метода основан на активации коагуляционного каскада тканевым тромбопластином - аналогом тканевого фактора. Реагент тромбопластина для проявления своего каталитического действия должен содержать тромбопластически активные вещества, представляющие собой надмолекулярное образование из фосфолипидов и белка апопротеина III. При изготовлении тромбопластинов необходимо выделить из используемого вида сырья тромбопластически активные вещества и сохранить в дальнейшем при проведении сублимационной сушки реагента.
Существуют подобные тромбопластины нерастворимой формы, при изготовлении которых в качестве сырья используют кадаверные ткани человека (мозг), применение которых требует специального разрешения.
В заявленном способе сырьем является плацента человека, она обладает специфической тромбопластической активностью и не требует специального разрешения для использования в производстве. Известны многие способы обработки плаценты для получения препаратов в терапевтических или косметических целях, но все они включают в себя использование химических веществ, которые отрицательно влияют на тромбопластическую активность тканей.
Известен способ приготовления биологически активного препарата из плаценты, включающий измельчение сырья, проведение слабого кислотного гидролиза, выделение продукта центрифугированием, нейтрализацию надосадочной жидкости, выделение и очистку препарата, сублимационное высушивание (Патент США N 4054648, МПК 6 А61К 35/50, 1977 г.). Недостатком указанного способа являются большие затраты времени, трудоемкость, повреждение при кислотном гидролизе тромбопластически активных веществ. Наиболее близким к настоящему изобретению по технической сущности и достигаемому результату при использовании является способ получения биологически активного тканевого препарата из плаценты. Он включает отмывку очищенной водой, получение гомогената, гемолиз тканей в очищенной воде и 2-кратное тонкое измельчение тканей в роторно-пульсационном аппарате, обеззараживание 3% раствором перекиси водорода, фильтрацию и получение готового продукта (Патент RU 2 148408, C1 A61К 35/50). Недостатком метода является обработка перекисью водорода, так как при этом происходит повреждение структуры тромбопластически активных веществ.
Задача, на решение которой направлено данное изобретение, заключается в создании способа получения лиофилизированного диагностического реагента тромбопластина полного из плаценты человека, имеющего высокую тромбопластическую активность до и после сублимационной сушки.
Указанный технический результат, заключающийся в получении реагента с высокой тромбопластической активностью, достигается в предложенном способе за счет использования специфичного сырья плаценты, все ткани которой обладают высокой тромбопластической активностью. Первый этап обработки плаценты - это проведение отмывки от гемоглобина. Для получения реагента с высокой тромбопластической активностью необходимо исключить при этом использование химических веществ, которые могут повреждать тромбопластически активные вещества. Поэтому отмывание проводят водой очищенной и 0,9% раствором натрия хлорида. Процесс отмывки и содержание гемоглобина в смывных водах контролируют лабораторными исследованиями (гемиглобинцианидным методом), содержание гемоглобина не должно превышать 0,5 мг/мл.
Также необходимо обеспечить наиболее возможно тонкое измельчение плаценты для проявления тканями плаценты своей тромбопластической активности. Гомогенизацию плаценты проводят механическим размельчителем ткани и ультразвуковым гомогенизатором. Контролируют процесс гомогенизации, определяя наличие сгустков и крупных включений в полученном гомогенате. При необходимости процесс повторяют, добиваясь полной гомогенности сырья, с размером частиц не более 0,02 мм.
В полученный гомогенат добавляют равный объем очищенной воды и перемешивают на мешалке активаторного типа в течение 30 минут, получая устойчивую эмульсию. При перемешивании также добавляют сохраняющие вещества, для сохранения тромбопластической активности реагента в процессе проведения сублимационной сушки.
ПРИМЕР ОПИСАНИЯ СПОСОБА
Плаценту человека тщательно отмывают очищенной водой 5-кратно. Удаляют слизь и сгустки крови. Расход воды составляет 10 литров на каждое промывание. Второе промывание проводят 0,9% раствором натрия хлорида 3-кратно, расход раствора составляет 3 литра на каждое промывание. Процесс отмывки контролируют, определяя содержание гемоглобина гемиглобинцианидным методом. Содержание его в последних промывных водах не должно превышать 0,5 мг/мл, при необходимости процесс отмывки повторяют. Отмытую плаценту подвергают гомогенизации.
Первое гомогенизирование плаценты проводят на механическом размельчителе тканей при 8 тысячах оборотов в минуту в течение 5 минут, получая гомогенат с размерами частиц от 1 до 0,5 мм. Второе гомогенизирование плаценты проводят в ультразвуковом гомогенизаторе при 15 микронах в течение 10 минут, получая гомогенат с размерами частиц от 0,01 до 0,02 мм. Измеряют полученный объем и массу гомогената.
В полученный гомогенат добавляют равный объем очищенной воды и сахарозу из расчета получения 0,5% раствора. Перемешивают на мешалке активаторного типа в течение 30 минут, получая полуфабрикат готовый для сублимационного высушивания. Он представляет собой устойчивую эмульсию светло-коричневого света.
Разливают полуфабрикат дозатором шланговым по флаконам из трубки стеклянной объемом 10 мл по 5 мл в один флакон. Помещают флаконы в низкотемпературный прилавок при температуре минус 40°С для закаливания, которое может продолжатся от 10 до 30 дней. Далее проводят сублимационную сушку реагента по разработанному графику в течение 24 часов. После сублимационного высушивания получают готовый реагент, частично растворимый в 0,9% растворе натрия хлорида, массой 0,5 г в одном флаконе. Проводят укупорку резиновыми пробками и завальцовку алюминиевыми колпачками флаконов с готовым реагентом. Контроль его качества включает в себя определение внешнего вида - он представляет собой порошок светло-коричневого цвета тромбопластической активности, которая составляет не более 18 секунд в тесте по определению протромбинового времени плазмы крови человека, потери в массе при высушивании - не более 2%.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведены в производственной лаборатории ООО «НПФ ВятМедДиа».
Приготовлено 5 серий диагностического реагента тромбопластина полного из плаценты человека. Качество и стабильность полученного реагента при хранении определяли методом ускоренной деградации, в течение одного месяца при +37°С. Деградация в таких условиях приравнивается к 1 году хранения реактива при +4-8°С. Результаты исследований представлены в таблице 1.
| Таблица 1 | ||||||||
| Характеристики реагента тромбопластина плацентарного при хранении | ||||||||
| № серии | Сроки исследований (месяцы) | |||||||
| внешний вид (1-12 месяцев) | Потеря в массе при высушивании (%) | ПВ (с) | ||||||
| после сублимации | 12 | исходные | после сублимации | 3 | 6 | 12 | ||
| 010403 | порошок светло-коричневого цвета | 0,05 | 0,08 | 13,5 | 14,0 | 15,5 | 15,0 | 15,5 |
| 020403 | порошок светло-коричневого цвета | 0,07 | 0,09 | 14,5 | 15,5 | 16,5 | 16,0 | 16,5 |
| 040403 | порошок светло-коричневого цвета | 0,09 | 0,10 | 13,0 | 14,5 | 14,5 | 15,5 | 15,5 |
| 050403 | порошок светло-коричневого цвета | 0,05 | 0,09 | 14,5 | 15,0 | 16,0 | 16,0 | 16,5 |
| 070403 | порошок светло-коричневого цвета | 0,06 | 0,08 | 14,0 | 15,0 | 15,5 | 15,5 | 16,0 |
Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что реагент тромбопластина плацентарного, приготовленный по заявленному способу, имеет вид порошка светло-коричневого цвета, высокую тромбопластическую активность в течение 12 месяцев (16 с), потерю массы при высушивании, не превышающую 2%.
ЛИТЕРАТУРА
1. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. - Казань: ФЭН. - 2000. - С.49-51.
2. Патент №2161975 от 20.01.2001 г. Способ сохранения активности сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого до и во время лиофилизации. / ГУ КНИИГ и ПК, Репнякова Е.М., Тарасова Л.H., Савиных Е.Ю., Гонин Л.Н., Решетникова Н.Р.
3. Патент №2260111 от 10.12.2000 г. Способ получения высокоактивного сырья для изготовления тромбопластина полного растворимого. / ГУ КНИИГ и ПК, Тарасова Л.Н., Репнякова Е.М., Савиных Е.Ю., Решетникова Н.Р., Гонин Л.Н.
4. Патент №2148408 от 14.09.1999 г. Способ получения биологически активного тканевого препарата. / Полковников P.M.
Способ получения диагностического реагента тромбопластина полного из плаценты человека, отличающийся тем, что используемое сырье плаценту человека отмывают 5-кратно очищенной водой и 3-кратно 0,9% раствором натрия хлорида до содержания гемоглобина в смывных водах не более 0,5 мг/мл, гомогенизируют механически и ультразвуком по выбранному режиму до получения частиц не более 0,02 мм, вводят сахарозу для получения 0,5% раствора и перемешивают, подвергают сублимационному высушиванию.
