Способ увеличения пула стволовых клеток в миокарде
Владельцы патента RU 2347577:
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН) (RU)
Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для увеличения пула жизнеспособных стволовых клеток в патологическом миокарде после их интрамиокардиальной трансплантации. Для этого перед интрамиокардиальной трансплантацией осуществляют культивирование мезенхимальных стволовых клеток, причем в последний день культивирования флаконы с клетками последовательно выдерживают определенное время в термостатах с разными температурными режимами: 15 мин при 43°С, 4 часа при 37°С, 2 часа при 43°С и 12 часов при 37°С. Такой режим культивирования обеспечивает увеличение в миокарде пула жизнеспособных стволовых клеток за счет сохранения их пролиферативной активности. 1 табл.
Изобретение относится к области биологии и медицины и может быть использовано для увеличения пула жизнеспособных стволовых клеток в патологическом миокарде после их интрамиокардиальной трансплантации.
Известен способ увеличения числа стволовых клеток в сердечной мышце животных и человека за счет интрамиокардиального введения взвеси предварительно культивированных клеток и, в частности, мезенхимальных стволовых клеток [1].
Данный способ является наиболее близким к заявляемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Недостатком данного способа является то, что он не обеспечивает гарантированного увеличения пула жизнеспособных стволовых клеток в патологически измененной сердечной мышце даже в первую неделю после трансплантации. Значительная часть клеток утрачивает жизнеспособность уже в первые часы после проведения трансплантации.
Задачей изобретения является увеличение пула жизнеспособных стволовых клеток в патологически измененном миокарде. Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ увеличения пула стволовых клеток в патологически измененной сердечной мышце после их интрамиокардиальной трансплантации, отличающийся тем, что в последний день культивирования флаконы с клетками, предназначенными для трансплантации, последовательно помещают в термостаты с разными температурными режимами: 15 мин при 43°С, 4 часа при 37°С, 2 часа при 43°С и 12 часов при 37°С.
Новым в предлагаемом способе является изменение режима культивирования стволовых клеток перед их интрамиокардиальной трансплантацией в патологически измененный миокард.
Использование стволовых клеток в медицине направлено на восполнение дефицита этих клеток в органах и тканях взрослого организма с целью поддержания их функциональной активности или усиления репаративных процессов. При этом одним из положений, определяющих тактику проведения клеточной трансплантации, является адресность этой процедуры. При поражении сердца трансплантацию проводят интракоронарно или интрамиокардиально (непосредственно в сердечную мышцу) [1]. В результате трансплантации стволовые клетки из оптимальной для них среды, поддерживаемой при культивировании, попадают в условия патологически измененного миокарда. Неблагоприятными факторами являются разросшийся и уплотнившийся межклеточный матрикс, дефицит кислорода, а также сам процесс трансплантации [2, 3]. Эти факторы существенно снижают жизнеспособность стволовых клеток. Повысить их численность простым увеличением трансплантируемой массы клеток невозможно, так как в этом случае в клетках запускается процесс апоптоза - естественного механизма, ограничивающего численность клеток. С другой стороны, известно, что в организме существует эндогенные механизмы адаптации, способные существенно повысить его устойчивость к действию неблагоприятных факторов [4]. Стимуляция этих механизмов возможна при кратковременном действии различных стресс-факторов, одним из которых является повышенная температура. Показано, что ряд адаптационных механизмов может реализоваться на клеточном уровне. Можно предположить, что эти механизмы можно активировать на уровне отдельных стволовых клеток на этапе их культивирования. Такие клетки смогут пережить процедуру трансплантации и сформировать в миокарде мезенхимальные островки-колонии [5]. Образование в миокарде таких колоний и их функционирование обеспечит поддержание пролиферативной активности стволовых клеток и естественное увеличение их числа.
Совокупность информации об активации адаптивных механизмов на клеточном уровне дает основание считать, что определенное изменение режима культивирования стволовых клеток может повлиять на их численность в миокарде после интрамиокардеальной трансплантации в патологически измененный миокард.
Существенные признаки проявили в заявленной совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста.
Идентичная совокупность признаков не обнаружена в патентной и научно-медицинской литературе.
Способ может быть применен для увеличения пула жизнеспособных стволовых клеток в патологически измененном миокарде.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемый способ соответствующим условиям патентоспособности: «новизна», «изобретательский уровень», «промышленная применимость».
Изобретения будет понятно из следующего описания.
Из бедренной кости животного выделяют костный мозг и, используя стандартную технику градиентного центрифугирования, получают мононуклеарную фракцию клеток костного мозга. Количество и жизнеспособность клеток определяют стандартными методами, например, используя краситель метиленовый синий и камеру Горяева. Для отделения стволовых клеток мононуклеарную фракцию помещают в культуральные флаконы (80-100×106 клеток на 5 мл культуральной среды) и ставят в СО2 инкубатор при 37°С. Уже после первой смены культуральной среды во флаконах остаются только стволовые клетки. В последний день культивирования флаконы с клетками последовательно выдерживают в термостатах с разными температурными режимами: 15 мин при 43°С, 4 часа при 37°С, 2 часа при 43°С и 12 часов при 37°С, а затем, после подбора требуемой клеточности, трансплантируют в сердечную мышцу.
Пример
Для определения эффективности предлагаемого способа проведено сравнительное исследование миокарда 5-ти групп животных по 10 животных в группе. Присутствия стволовых клеток в миокарде лабораторных животных (крысы линии Вистар) проводили после их умерщвления. Все процедуры проводили в стерильных условиях, а работы с культурами клеток в ламинарном шкафу. Фрагменты левого желудочка сердца гомогенизировали, а полученную взвесь помещали в культуральные флаконы и культивировали по стандартной схеме. Спустя 16 суток питательную среду удаляли, а содержимое флаконов фиксировали и окрашивали. В пробах миокарда интактных животных и животных с сердечной недостаточностью развившейся после кардиосклероза не было выявлено ни одной колонии стволовых клеток, а клеточность составляла 318±162 и 937±460 кл./см2 соответственно (таблица).
| Присутствие колоний стволовых клеток и общая клеточность интактного и патологического миокарда | ||||
| Группы исследуемого миокарда | Показатели | |||
| Число колоний | Клеточность кл./см2 | |||
| 4 сутки | 7 сутки | 4 сутки | 7 сутки | |
| Интактный миокард | 0 | 318±162 | ||
| Миокард с СН | 0 | 937±460 | ||
| Интактный миокард после трансплантации клеток | 8±2 | 26±4 | 946±267 | 1723±463 |
| Миокард с СН после трансплантации клеток | 6±2 | 11±5 | 923±165 | 1094d±318 |
| Миокард с СН после трансплантации модифицированных клеток | 18±5 | 29±9 | 1626±123 | 1787±396 |
| Примечание: СН - сердечная недостаточность, развившаяся после кардиосклерлоза. |
В миокарде животных, которым трансплантировали мезенхимальные стволовые клетки, полученные традиционным способом, клеточные колонии выявлялись. Причем, если в образцах миокарда, взятых через на 4 сутки после трансплантации, различие между интактным и патологическим миокардом практически не было, то к 7 суткам число выявляемых колоний различалось уже более чем в 2 раза. Это различие указывает на то, что в условиях патологического миокарда трансплантираванные клетки, если и выживают, то сохраняют меньшую пролиферативную активность и жизнеспособность. В группе животных, которым трансплантировали клетки, модифицированные предлагаемым способом, число выявляемых колоний во всех случаях было выше (таблица).
Этот результат указывает на то, что трансплантируемые клетки не только успешно переносят процедуру трансплантации, но и сохраняют свою активность в дальнейшем.
Предлагаемый авторами способ позволяет увеличить пул жизнеспособных стволовых клеток в патологически измененном миокарде лабораторных животных при исследовании кардиопротекторных эффектов клеточной трансплантации при сердечно-сосудистых патологиях.
Цитируемая литература
1. Шумаков В.И., Казаков Э.Н., Онищенко Н.А. и др. Первый опыт клинического применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для восстановления сократительной функции миокарда. // Российский кардиологический журнал. 2003, №5, с.42-50.
2. Потапов И.В., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Клеточная кардиомиопластика. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. 2001, №2, с.53-62.
3. Капелько В.И. Внеклеточный матрикс миокарда и его изменения при заболеваниях сердца. // Кардиология. 2000, №9, с.78-92.
4. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита миокарда. (1993) Наука, Москва.
5. Шахов В.П., Попов С. В., Кокарев О.В., Афанасьев С.А. Феномен образования мезенхимальных островков костного мозга in vitro. // Бюл. экспер.биол. 2004, №6, с.706-709.
Способ увеличения пула стволовых клеток в миокарде, заключающийся в интрамиокардиальной трансплантации предварительно культивированных мезенхимальных стволовых клеток, отличающийся тем, что в последний день культивирования флаконы с клетками последовательно выдерживают определенное время в термостатах с разными температурными режимами: 15 мин при 43°С, 4 ч при 37°С, 2 ч при 43°С и 12 ч при 37°С.
