Антитело к cd40: препарат и способы

Группа изобретений относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано при лечении рака. Группа изобретений касается жидкого фармацевтического препарата, содержащего агонистическое антитело к CD40 при рН 5,0-6,0 и фармацевтически приемлемый носитель, а также способа лечения рака, включающего введение данного препарата. Повышенная стабильность препарата, достигаемая за счет указанного диапазона рН и конкретных носителей, позволяет сократить количество продуктов разложения антител и таким образом снизить частоту возникновения неблагоприятных побочных эффектов лечения. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл.

 

Предшествующий уровень техники

CD40 является членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR). Он экспрессируется на антигенпрезентирующих клетках (В-клетках, дендритных клетках, моноцитах), гематопоэтических предшественниках, эндотелиальных клетках, гладкомышечных клетках, эпителиальных клетках, а также на большинстве опухолей человека (Grewal & Flavell, Ann. Rev. Immunol., 1996, 16:111-35; Toes & Schoenberger, Seminars in Immunology, 1998, 10 (6): 443-8). В исследованиях с использованием CD40-агонистических агентов сообщалось, что стимуляция рецептора CD40 вызывает каскад эффектов, связанных с противоопухолевой активностью. Например, показано, что стимуляция рецептора CD40 на антигенпрезентирующих клетках улучшает их созревание, антигенпрезентирующую функцию, костимуляторный потенциал и высвобождение ими иммунорегуляторных цитокинов (Lee et al., PNAS USA, 1999, 96 (4): 1421-6; Cella et al., J. Exp.Med., 1996, 184 (2): 747-52). Также сообщалось, что агонисты CD40 стимулируют апоптоз CD40(+)-опухолей и увеличивают возможность их обработки дендритными клетками (von Leoprechting et al., Cancer Res., 1999, 59: 1287-94; Sotomayo et al., Nature Medicine, 1999, 5 (7): 780-87; Eliopoulos et al., Mol. Cell Biol., 2000, 29 (15): 5503-15; Ziebold et al., Arch. Immunol. Therapiae Experimentalis, 2000, 48 (4): 225-33; Hoffmann et al., J. Immunol., 2001, 24 (2): 162-71). Значимость этих иммуностимулирующих и прямых противоопухолевых эффектов была продемонстрирована на животных моделях, где было показано, что агонистические антитела к CD40 предотвращают рост опухолей и реверсируют толерантность к опухолям (Diehl et al., Nature Med.,1999, 5 (7): 774-9; Francisco et al., Cancer Res., 2000, 60 (12): 32225-31). Следующие патентные публикации: US 5786456; US 5674492; WO 02/088186; US 2003059427; US 20020142358; WO 01/56603; US 5801227; EP 806963; WO 88/06891 и WO 94/04570 относятся к антителам к CD40. Однако не описаны высокоэффективные способы введения и препараты антител к CD40. Также будет полезным стабильный препарат, пригодный для применения в таком лечении.

Краткое изложение сущности изобретения

Настоящее изобретение относится к способу лечения рака у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающему введение указанному пациенту агонистического антитела к CD40 или его фрагмента, при котором указанное антитело вводят в соответствии с режимом периодического введения доз из по меньшей мере двух циклов, причем каждый цикл включает (а) период введения доз, в течение которого указанному пациенту вводят терапевтически эффективное количество указанного агонистического антитела к CD40, и затем (б) перерыв. В одном воплощении введение обеспечивает концентрацию антитела в плазме от 0,01 мкг/мл до 10 в течение по меньшей мере трех часов, а перерыв составляет по меньшей мере 1 неделю. В других воплощениях период введения доз составляет по меньшей мере одни сутки, 1-5 суток или 1-3 суток. В других воплощениях перерыв составляет от 1 до 8, 1-6 недель, 2-5 недель или 3-4 недели.

В некоторых воплощениях терапевтически эффективное количество агонистического антитела к CD40 обеспечивает концентрацию указанного антитела от приблизительно 0,03 до 10 мкг/мл, от приблизительно 0,03 до 1 мкг/мл, от приблизительно 0,03 до 0,3 мкг/мл, или от приблизительно 0,1 до 0,3 мкг/мл в течение 3-120 часов. В некоторых воплощениях указанная концентрация в плазме сохраняется в течение по меньшей мере одних суток, 24-30 часов, 24-36 часов, 24-48 часов, 24-72 часов, 24-96 часов или 24-120 часов. В некоторых воплощениях эта концентрация в плазме сохраняется в течение 3-96 или 12-72 часов.

В некоторых воплощениях терапевтически эффективное количество агонистического антитела, вводимое в течение периода введения доз, составляет от приблизительно 0,03 до 3,0 мг/кг/сутки, от 0,1 до 3,0 мг/кг/сутки, от 0,1 до 1,0 мг/кг/сутки, или от приблизительно 0,1 до 0,3 мг/кг/сутки. В одном воплощении эту дозу вводят в течение 1-5 или 1-3 суток, либо последовательно, либо через сутки.

Периодический режим введения доз агонистических антител к CD40, как описано выше в отношении лечения опухолей, также полезен для усиления иммунных ответов у пациентов, и такое применение, следовательно, также предложено в настоящем изобретении. В некоторых воплощениях усиление иммунного ответа пациента приводит к повышенной экспрессии CD23 или МНС-11 на В-клетках в цельной крови пациента, что, например, можно измерить в конце периода введения доз.

В некоторых воплощениях анти-CD40-антитело вводят пациенту, который страдает первичными и/или комбинированными иммунодефицитами, включая CD40-зависимый иммунодефицит с гипер-IgM-синдромом, общий вариабельный иммунодефицит, агаммаглобулинемию Брутона, дефициты подклассов IgG и Х-сцепленные SCID (тяжелые комбинированные иммунодефицитные заболевания) (мутации общей гамма-цепи). В некоторых воплощениях анти-CD40-антитело вводят для лечения пациента с иммуносупрессией, например, вследствие химиотерапии, или который страдает ослабляющим иммунитет заболеванием, включая любое приобретенное иммунодефицитное заболевание, такое как ВИЧ. В некоторых воплощениях анти-CD40-антитело вводят для усиления иммунитета пожилого пациента. В некоторых воплощениях анти-CD40-антитело вводят для лечения пациента, имеющего бактериальную, вирусную, грибковую или паразитарную инфекцию. В некоторых воплощениях человеческое агонистическое анти-CD40-антитело можно профилактически вводить пациенту, который вследствие возраста, заболевания или слабого общего здоровья подвержен инфекции, для предупреждения или уменьшения числа или тяжести инфекций.

В настоящем изобретении также предложен способ лечения опухоли у пациента, включающий введение агонистического антитела к CD40 и ингибитора репликации ДНК, предпочтительно производного платины, особенно цисплатина. В некоторых воплощениях цисплатин вводят внутривенно. В некоторых воплощениях цисплатин вводят в количестве от приблизительно 25 до 300 мг на 1 м², от приблизительно 50 до 150 мг на 1 м², или от приблизительно 75 до 100 мг на 1 м² площади поверхности тела пациента. В одном воплощении цисплатин вводят в одной дозе (например, в однократной внутривенной инфузии). В другом воплощении его вводят в течение 2-5 суток. В некоторых воплощениях количество антитела к CD40, вводимого в комбинации с цисплатином, вводят в дозировке от приблизительно 0,1 до 3,0 мг/кг или от приблизительно 0,1 до 1,0 мг/кг, или от приблизительно 0,1 до 0,3 мг/кг.

В другом аспекте введение цисплатина комбинируют с периодическим режимом введения доз антитела к CD40, причем цисплатин вводят в течение одного или более периодов введения доз или перерывов.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу лечения опухоли у пациента, нуждающегося в таком лечении, путем введения этому пациенту агонистического антитела к CD40 или его фрагмента в дозировке менее чем 1 мг/кг/сутки, при котором максимальная концентрация С_max в сыворотке крови пациента, получаемая в результате введения этого антитела, составляет менее 50 мкг/мл. В одном воплощении дозировка составляет от 0,1 до 0,3 мг/кг, и концентрация антитела в сыворотке пациента С_max составляет от 0,5 до 10 мкг/мл.

В другом аспекте данное изобретение относится к стабильному жидкому фармацевтическому препарату, пригодному для парентерального введения, содержащему анти-CD40-антитело при рН 5,0-6,0 и фармацевтически приемлемый носитель, причем этот препарат стабилен в течение промежутка времени по меньшей мере три месяца. Концентрация антитела к CD40 в этом препарате предпочтительно составляет по меньшей мере приблизительно 5 мг/мл. В одном воплощении этот препарат содержит анти-CD40-антитело, ацетат натрия, хлорид натрия и полисорбат 80. Предпочтительно он содержит 20 мМ ацетата натрия, 140 мМ хлорида натрия и 0,2 мг/мл полисорбата 80. Анти-CD40-антитело предпочтительно имеет аминокислотную последовательность антитела, выбранного из группы, состоящей из антитела 21.4.1 или 3.1.1.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг.1 показано ингибирование роста CD40(-)-опухоли К562 агонистическим антителом к CD40 в присутствии иммунных клеток. Животные получали однократную инъекцию (IP) 21.4.1 или KLH во время опухолевой провокации. Размер опухоли в мм² указан для каждого отдельного животного на 21 сутки (10 животных на группу). Данное исследование представлено на основании по меньшей мере 5 отдельных исследований.

На фиг.2 показано ингибирование роста клеточной линии опухоли молочной железы человека ВТ 474 агонистическим антителом к CD40. Значения представляют собой измерения индивидуальных опухолей, полученные на 53 сутки после инъекции, с использованием 6 животных на группу. Данное исследование представлено на основании двух отдельных экспериментов. Среднее значение для каждой группы лечения показано горизонтальной линией.

На фиг.3 показано ингибирование роста CD40(+)-опухоли агонистическим антителом к CD40, одним или в присутствии иммунных клеток. Животные получали однократную инъекцию 21.4.1 во время опухолевой провокации. (а) Опухоли инъецировали одни или (б) вместе с Т-клетками и DC (дендритными клетками) периферической крови человека. Точки на графике представляют собой размер опухоли (мм²) для каждого отдельного животного. Среднее значение для каждой группы лечения (N=10) показано горизонтальной линией. Данное исследование представлено на основании по меньшей мере 3 отдельных экспериментов.

На фиг.4 показаны эффекты агонистического антитела к CD40 на замедление смертности, вызванной лимфомой В-клеток (Daudi). Точки на графике относятся к среднему количеству выживших животных, N=10 на группу.

На фиг.5 показана регрессия опухоли, вызванная комбинированной терапией агонистическим антителом к CD40 и цисплатином.

Подробное описание предпочтительных воплощений

При использовании здесь термин "агонистическое антитело к CD40" или "агонистическое анти-CD40-антитело" означает антитело, которое специфически связывается с молекулой CD40 человека и повышает одну или более чем одну активность CD40 по меньшей мере приблизительно на 20% при добавлении к клетке, ткани или организму, экспрессирующим CD40. В некоторых воплощениях антитело активирует активность CD40 по меньшей мере на 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 85%. В некоторых воплощениях эта активация происходит в присутствии CD40L. В некоторых воплощениях активность активирующего антитела измеряют, используя анализ положительной регуляции поверхностных молекул цельной крови. В другом воплощении активность активирующего антитела измеряют, используя анализ с дендритными клетками, для измерения высвобождения IL-12. В другом воплощении активность активирующего антитела измеряют, используя модель опухоли in vivo.

Термин "антитело" при использовании здесь относится к интактному антителу или к его связывающему фрагменту, который конкурирует с интактным антителом за специфическое связывание. Связывающие фрагменты продуцируют посредством рекомбинантных ДНК-методик или путем ферментативного или химического расщепления интактных антител. Связывающие фрагменты включают Fab, Fab', F(ab')₂, Fv и одноцепочечные антитела. Следует понимать, что ссылка на интактное {например, целое, полноразмерное и т.д.) антитело в данном описании включает антитело, имеющее делецию концевого лизина в тяжелой цепи, которая обычно имеет место в процессе рекомбинантной экспрессии.

Предпочтительно агонистическое антитело к CD40 представляет собой человеческое антитело. При использовании здесь термин "человеческое антитело" означает антитело, в котором последовательности вариабельных и константных доменов происходят от человеческих последовательностей. Человеческие антитела к CD40 подробно описаны в предварительной заявке на патент США №60/348980, поданной 9 ноября 2001, и в международной заявке РСТ №PCT/US02/36107 (в настоящее время опубликованной как WO 03/040170), поданной 8 ноября 2002, полное описание которых включено в данное описание изобретения посредством ссылки. Человеческие антитела обеспечивают существенное преимущество в способах лечения по настоящему изобретению, поскольку ожидается, что они минимизируют иммуногенные и аллергические реакции, которые связаны с применением нечеловеческих антител у пациентов-людей.

Примеры человеческих анти-CD40-антител, полезных для настоящего изобретения, включают антитела, имеющие аминокислотные последовательности антител, обозначенных 3.1.1, 3.1.1Н-А78Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1Н-С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1, 24.2.1, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V и 23.28.1L-C92A, а также антитело, содержащее CDR (область, определяющую комплементарность) или вариабельную область любого из этих приведенных в качестве примеров антител.

Антитела, которые распознают те же или подобные эпитопы или их участки, что и любое из приведенных в качестве примера антител, также могут быть полезны для настоящего изобретения. То есть, как понятно специалистам в данной области техники на основании приведенного здесь описания, антитело, которое конкурирует с антителом по изобретению (например, 3.1.1, 3.1.1Н-А78Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1Н-С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1, 24.2.1, 3.1.1Н-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V и 23.28.1L-C92A и подобным), может быть полезно, как раскрыто в данном описании. Интересующее антитело, которое конкурирует с антителом, приведенным здесь в качестве примера, можно легко идентифицировать, используя способы, хорошо известные в данной области техники для характеристики антител. Более конкретно, анализы оценки характеристик связывания антитела, а также сравнения этих характеристик связывания с характеристиками другого антитела хорошо известны в данной области техники. Такие способы включают анализы на основе ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа), использование исследований связывания BIAcore, а также подробно описанных в публикации патентной заявки США №2003/0157730 А1 Walker et al., но не ограничены ими.

Под термином "конкурировать" при использовании здесь в отношении антитела подразумевают, что первое антитело конкурирует за связывание со вторым антителом, причем связывание первого антитела с распознаваемым им эпитопом обнаруживаем образом уменьшается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Может, хотя и не обязательно, иметь место альтернативный случай, когда связывание второго антитела с его эпитопом также обнаруживаемым образом уменьшается в присутствии первого антитела. То есть первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без ингибирования вторым антителом связывания первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако, когда каждое антитело обнаруживаемым образом ингибирует связывание другого антитела с распознаваемым им эпитопом или лигандом в той же самой большей или меньшей степени, антитела называют "перекрестью конкурентными" друг для друга в отношении их связывания с соответствующим(и) эпитопом(ами). Например, перекрестно конкурентные антитела могут связываться с эпитопом или с участком эпитопа, с которым связываются антитела по изобретению (например, 3.1.1, 3.1.1Н-А78Т, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1Н-С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1H-D16E, 23.29.1, 24.2.1, 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V и 23.28.1L-C92A). Как конкурентные, так и перекрестно конкурентные антитела включены в объем настоящего изобретения. Независимо от механизма, посредством которого происходит такая конкуренция или перекрестная конкуренция (например, пространственное препятствие, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его участком и тому подобное), специалисту в данной области техники понятно на основании представленных здесь сведений, что такие конкурентные и/или перекрестно конкурентные антитела включены в объем изобретения и могут быть полезны для способов, раскрытых в описании изобретения.

Кроме того, типичные антитела могут быть дополнительно модифицированы путем замены, добавления или делеции одного или более аминокислотных остатков без ликвидации способности антитела связывать антиген и проявлять его агонистическую функцию. Действительно, антитело, обозначенное "3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V", содержит три аминокислотные замены в вариабельной области тяжелой цепи, то есть замену аланина на треонин в аминокислотном остатке номер 78, замену валина на аланин в аминокислотном остатке номер 88 и замену валина на аланин в аминокислотном остатке номер 97 (SEQ ID NO:9), все по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области тяжелой цепи антитела 3.1.1 (SEQ ID NO:1). Кроме того, антитело 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V дополнительно содержит аминокислотную замену лейцина на метионин в аминокислотном остатке номер 4 и замену лейцина на валин в аминокислотном остатке номер 83 в вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO:10) по сравнению с аминокислотной последовательностью вариабельной области легкой цепи антитела 3.1.1 (SEQ ID NO:3). Аминокислотные последовательности константных областей тяжелых цепей (SEQ ID NO:2) и легких цепей (SEQ ID NO:4) антител 3.1.1 и 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V являются одинаковыми. Антитело 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V также упоминается как "3.1.1H3L2", чтобы отразить, что это антитело содержит три аминокислотные замены в тяжелой цепи и две аминокислотные замены в легкой цепи по сравнению с антителом 3.1.1.

Таким образом, в некоторых воплощениях типичные антитела могут быть модифицированы путем замены, добавления или делеции одного-десяти, одного-пяти или одного-трех аминокислотных остатков, например, в CDR или каркасной области. Такие типичные антитела и способы их продуцирования подробно описаны в предварительной заявке на патент США №60/348980, поданной 9 ноября 2001, и в международной заявке РСТ №PCT/US02/36107 (WO 03/040170), поданной 8 ноября 2002. Однако изобретение не ограничено этими или любыми другими аминокислотными заменами. Специалисту в данной области техники, вооруженному представленной здесь информацией, конечно будет понятно, что изобретение охватывает большое разнообразие аминокислотных замен.

Гибридомы 3.1.1, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1 и 21.4.1 были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Американской коллекции типовых культур (АТСС), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 6 августа 2001. Гибридомы 21.2.1, 22.1.1, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.29.1 и 24.2.1 были депонированы в АТСС 16 июля 2002. Гибридомам присвоены следующие депозитные номера:

Гибридома	№ по каталогу
3.1.1 (LN 15848)	РТА-3600
7.1.2 (LN 15849)	РТА-3601
10.8.3 (LN 15850)	PTA-3602
15.1.1 (LN 15851)	PTA-3603
21.4.1 (LN 15853)	PTA-3605
21.2.1 (LN 15874)	PTA-4549
22.1.1 (LN 15875)	PTA-4550
23.5.1 (LN 15855)	PTA-4548
23.25.1 (LN 15876)	PTA-4551
23.28.1 (LN 15877)	PTA-4552
23.29.1 (LN 15878)	PTA-4553
24.2.1 (LN 15879)	PTA-4554

Последовательности этих антител известны и описаны в WO 03/040170. Для удобства аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей двух из этих антител приведены ниже:

Антитело 3.1.1:

3.1.1: Белковая последовательность тяжелой цепи

Вариабельная (SEQ ID NO:1): QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG MHWVRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKG RFTISRDNSKNALYLQMNSLRVEDTAVYYCVRRG HQLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS Константная (SEQ ID NO:2): ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK

3.1.1: Белковая последовательность легкой цепи

Вариабельная (SEQ ID NO:3): DIVLTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYN FLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGS GSGTDFTLKISRLEAEDVGVYYCMQALQTPRTFG QGTKVEIK Константная (SEQ ID NO:4): RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

3.1.1Н-А78Т-V88A-V97A: Белковая последовательность тяжелой цепи

Вариабельная (SEQ ID NO:9): QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYG MHWVRQAPGKGLEWVAVISKDGGNKYHADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRGH QLVLGYYYYNGLDVWGQGTTVTVSS Константная (SEQ ID NO:2): ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK

3.1.1L-L4M-L83V: Белковая последовательность легкой цепи

Вариабельная (SEQ ID NO:10): DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGY NFLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSG SGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPRTF GQGTKVEIK Константная (SEQ ID NO:4): RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

Антитело 21.4.1:

21.4.1: Белковая последовательность тяжелой цепи

Вариабельная (SEQ ID NO:5): QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYM HWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQG RVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQ PLGYCTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS Константная (SEQ ID NO:6): ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWT VPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCV ECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKG LPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP MLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK

21.4.1: Белковая последовательность легкой цепи

Вариабельная (SEQ ID NO:7): DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAW YQQKPGKAPNLLIYTASTLQSGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEI К Константная (SEQ ID NO:8): RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNR GEC

Таким образом, аминокислотная последовательность антитела 21.4.1 содержит аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID №№: 5-8, аминокислотная последовательность антитела 3.1.1 содержит аминокислотные последовательности, изложенные в SEQ ID №№: 1-4, и аминокислотная последовательность антитела 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V содержит последовательности, изложенные в SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:2, SEQ ID N010 и SEQ ID NO4. Аминокислоты, которые различаются у 3.1.1 и 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V, подчеркнуты.

На основании представленного здесь описания понятно, что антитело 3.1.1 по изобретению охватывает любую комбинацию вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепи, изложенных здесь. То есть антитело может содержать любую комбинацию вариабельных областей, включая 3.1.1Н (SEQ ID NO:1)/3.1.1L (SEQ ID NO:3), 3.1.1Н (SEQ ID NO:1)/3.1.1L-L4M-L83V (SEQ ID NO:10), 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEQ ID NO:9)/3.1.1L (SEQ ID N03), и более предпочтительно 3.1.1H-A78T-V88A-V97A (SEQ ID NO:9)/3.1.1L-L4M-L83V (SEQ ID NO:10), но не ограничиваясь ими. Однако изобретение никоим образом не ограничено этими или любыми другими конкретными комбинациями.

В некоторых воплощениях лечение опухолей ингибирует пролиферацию раковых клеток, ингибирует или предотвращает увеличение массы или объема опухоли и/или вызывает уменьшение массы или объема опухоли. В некоторых воплощениях лечение опухоли продлевает жизнь пациента. В некоторых воплощениях рост опухоли ингибирован по меньшей мере на 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75% по сравнению с опухолями без лечения. В некоторых воплощениях опухоль является CD40-положительной. В некоторых воплощениях опухоль является CD40-отрицательной. Опухоль может представлять собой солидную опухоль или несолидную опухоль, такую как лимфома. В некоторых воплощениях анти-CD40-антитело вводят пациенту, у которого имеется опухоль, являющаяся раковой.

Пациенты, которых можно лечить анти-CD40-антителами или участками антител, включают пациентов, у которых диагностирован рак головного мозга, рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы и шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, желудочный рак, колоректальный рак, рак ободочной кишки, гинекологические опухоли (например саркомы матки, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища или карцинома вульвы), рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы (например, рак щитовидной, паращитовидной железы или надпочечников), саркомы мягких тканей, лейкемия, миелома, множественная миелома, рак уретры, рак пениса, рак предстательной железы, хроническая или острая лейкемия, солидные опухоли детей, болезнь Ходжкина, лимфоцитарная лимфома, лимфомы не-Ходжкина, рак мочевого пузыря, рак печени, почечный рак, рак почки или уретры (например, карцинома почечных клеток, карцинома почечной лоханки) или новообразования в центральной нервной системе (например, первичная лимфома ЦНС, опухоли спинного мозга, глиомы ствола головного мозга или аденомы гипофиза), глиома или фибросаркома, но не ограничены ими.

При использовании здесь термин "пациент" относится к человеку или млекопитающему, не являющемуся человеком, который экспрессирует перекрестно-реактивный CD40 (например, к примату, обезьяне рода Cynomolgus или резус-обезьяне). Предпочтительно пациент, подлежащий лечению, представляет собой человека.

При использовании здесь термин "Периодический режим введения доз" означает режим введения доз, который включает введение агонистического антитела к CD40 с последующим перерывом.

При использовании здесь термин "перерыв" означает период времени, в течение которого пациент не получает агонистическое антитело к CD40. Например, если антитело давали на ежесуточной основе, перерыв будет, если ежесуточное введение прервано, например на некоторое количество дней или недель. Если дозу вводят в другом режиме, перерыв будет иметь место, когда такое введение доз прервано на некоторое время. Альтернативно перерыв может иметь место, когда концентрацию антитела поддерживают на субтерапевтическом уровне.

В одном воплощении антитело не дают после второго перерыва, то есть, когда способ по изобретению включает два цикла, лекарство не требуется вводить после второго цикла перерыва.

Предпочтительно в течение перерыва концентрацию антитела в плазме поддерживают на субтерапевтическом уровне.

Период введения доз и/или доза антитела в циклах могут быть одинаковыми или разными.

Суммарное время лечения (то есть число циклов лечения) будет варьироваться от пациента к пациенту на основании тщательной медицинской оценки и факторов, конкретных для пациента, подлежащего лечению. Как правило, лечение проводят до получения удовлетворительного ответа. В некоторых воплощениях изобретения период лечения включает 2-20, 2-15, 2-10, 2-7, 2-5 циклов или 2-3 цикла.

Антитело можно вводить любыми желаемыми способами, включая, например, внутривенное, подкожное, внутримышечное, парентеральное, внутриопухолевое и чрескожное введение. В другом воплощении антитело к CD40 вводят внутривенно. В другом воплощении его вводят, используя устройство с микроиглой; такие устройства хорошо известны и включают, например, устройство, описанное в WO 03/084598.

При введении в комбинации с ингибитором репликации ДНК, например цисплатином, антитело можно вводить до, во время или после введения ингибитора.

В одном аспекте изобретение относится к водному раствору для внутривенной инъекции с рН от приблизительно 5,0 до 6,0, предпочтительно рН приблизительно 5,5. Такой раствор может быть приготовлен с ацетатом натрия (тригидратом), уксусной кислотой (ледяной), полисорбатом 80, хлоридом натрия и водой. Предпочтительно хранить раствор антитела при температурах в холодильнике между 2 и 8°С и не замораживать.

В соответствии с настоящим изобретением также предложены способы лечения опухоли у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающие введение указанному пациенту комбинации терапевтически эффективного количества агонистического антитела к CD40 и терапевтически эффективного количества ингибитора репликации ДНК, например производного платины. В некоторых воплощениях агонистическое антитело к CD40 действует в синергической комбинации с соединением, представляющим собой производное платины, особенно с цисплатином, так что противоопухолевый эффект этой комбинации выше, чем предсказываемый от введения каждого соединения по отдельности.

Производные платины являются хорошо известной группой соединений, которые проявляют свою противоопухолевую активность посредством вмешательства в репликацию ДНК. В некоторых воплощениях производные платины выбраны из группы, состоящей из цисплатина (цис-диаминдихлорплатины, см. Merck Index), карбоплатина и оксалиплатина.

Изобретение станет более понятным при помощи ссылки на приведенные ниже примеры. Однако их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Все литературные источники включены посредством ссылки.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Эффекты антитела на клетки лимфатических узлов раковых пациентов

Исследовали эффекты человеческого анти-CD40-антитела (21.4.1) на клетки лимфатических узлов, полученных от раковых пациентов, стимулированных аутологичными опухолевыми клетками.

Клетки лимфатических узлов и опухоли собирали у пациентов с карциномой почечных клеток, немелкоклеточным раком легкого, промежуточно-клеточной карциномой мочевого пузыря, раком толстой кишки, раком предстательной железы и раком головы и шеи. Клетки лимфатических узлов помещали в культуру вместе с облученными, обработанными коллагеназой опухолями (выделенными от того же пациента) в присутствии или в отсутствие 21.4.1 (1 мкг/мл; 6,7 нМ). Пролиферацию оценивали, используя ³H-тимидин, через 96 часов. Число клеток, продуцирующих INFγ, оценивали с помощью ELISPOT (иммуноферментного слот-анализа) после повторной стимуляции.

Антитело увеличивало количество IFN_γ(+)-положительных Т-клеток в культурах клеток лимфатических узлов, стимулированных опухолевым антигеном. Кроме того, пролиферация этих клеток лимфатических узлов в ответ на опухолевый антиген усиливалась в 3-4 раза.

Антитело усиливало пролиферацию и способность продуцировать цитокины у клеток лимфатических узлов, полученных от раковых пациентов при стимуляции опухолевым антигеном.

Пример 2: Связывание антитела с Fc (кристаллизуемый фрагмент)-рецептором

Исследовали связывание анти-CD40-антитела (21.4.1) с Fc-рецепторами на лейкоцитах человека и Cynomolgus.

Исследования с помощью проточной цитометрии показали, что FcR типов FcγRII (CD32) и FcγRIII (CD16), а также очень низкие уровни FcγRI (CD64) экспрессировались на лейкоцитах человека. Связывание 21.4.1 с рецепторами Fn(FcR) на лейкоцитах периферической крови человека или Cynomolgus определяли, используя ¹²⁵I-21.4.1 и контрольное mAb человеческого IgG1. Лейкоциты человека от нормальных доноров или лейкоциты Cynomolgus выделяли из цельной крови, используя плазменный гель, и тщательно промывали, чтобы обеспечить возможность диссоциации связанных с рецептором сывороточных иммуноглобулинов. Для разделения связанных с клетками и свободных антител использовали центрифугирование с сахарозной "подушкой". Исследования проводили при 4°С в присутствии азида натрия для предотвращения интернализации рецепторов.

21.4.1 тестировали на специфическое связывание с FcR путем использования избытка немеченого человеческого антитела, соответствующего изотипу IgG2, в качестве конкурента. Специфическое связывание ¹²⁵I-21.4.1 с FcR на человеческих лейкоцитах (n=5 доноров) составляло -1,0±8,5%, а специфическое связывание с FcR на лейкоцитах Cynomolgus (n=4) составляло 15±13%. При добавлении 500-кратного избытка немеченого 21.4.1, которое будет блокировать любое специфическое связывание ¹²⁵I-21.4.1 с CD40-рецепторами лейкоцитов, а также FcR, продемонстрировано 49%-е и 67%-е специфическое связывание ¹²⁵I-21.4.1 с CD40-рецепторами на лейкоцитах человека и Cynomolgus соответственно (% специфического связывания с CD40 вычисляли путем вычитания % связывания с FcR из суммарного % специфического связывания). В качестве контроля ¹²⁵I-IgG1 последовательно продемонстрировал специфическое связывание с лейкоцитами человека и Cynomolgus. Специфическое связывание контрольного IgG1-антитела с FcR на лейкоцитах человека и Cynomolgus составляло 56% и 51% суммарной связанной радиоактивности соответственно.

Эти исследования показывают, что антитело демонстрирует минимальное специфическое связывание с Fc-рецепторами на лейкоцитах человека и Cynomolgus.

Пример 3: Анализ высвобождения цитокинов цельной крови

Анти-CD40-антитело (21.4.1) тестировали на его способность индуцировать высвобождение цитокинов из нестимулированной цельной крови человека, используя in vitro анализ цельной крови, который коррелирует с индукцией опосредованного антителом высвобождением цитокинов у людей. 21.4.1 тестировали в концентрации 1, 10 и 100 мкг/мл, параллельно с IgG1 мыши против-CDS человека в качестве положительного контроля, который индуцирует высвобождение цитокинов через опосредованный Fc путь, и LPS (липополисахаридов) в качестве второго положительного контроля, который индуцирует цитокины посредством стимуляции макрофагов. В качестве доноров включали индивидуумы, которые реагировали как на мышиное антитело, так и на LPS (4 донора), а также индивидуумы, которые реагировали только на LPS (3 донора). Гепаринизированную цельную кровь культивировали с 21.4.1 в течение 5 часов, и плазму собирали и анализировали на фактор некроза опухоли альфа (TNF-α), интерферон гамма (INF-γ) и интерлейкин-6 (ИЛ-6) с помощью ELISA (используя имеющиеся в продаже наборы). Культуры также инкубировали в течение 48 часов и анализировали на интерлейкин-1-бета (ИЛ-1β).

Цитокины не были обнаружены в плазме крови человека, культивируемой с 1 или 10 мкг/мл 21.4.1. Только один донор, обработанный 100 мкг/мл антитела, продемонстрировал низкие, но измеряемые уровни двух цитокинов (34 пг/мл TNF-α и 90 пг/мл ИЛ-6). Затем этого донора тестировали повторно, и он не продемонстрировал какой-либо обнаруживаемой индукции TNF-α или IL-6. Ни в одном из образцов не было повышения INFγ или ИЛ-1β.

Эти исследования показывают, что 21.4.1 не индуцирует воспалительные цитокины в цельной крови человека.

Пример 4: Фармакодинамика и фармакокинетика антитела

Антитело к CD40 (21.4.1) вводили внутривенно в варьирующихся дозах (1 мг/кг n=4; 3 мг/кг n=4; 5 мг./кг n=2 и 10 мг/кг n=2) обезьянам Cynomolgus. У обезьян брали гепаринизированную кровь в различные моменты времени до и после введения доз. Кровь делили на аликвоты и окрашивали. Данные получали, используя Becton Dickinson FACSCalibur, и анализировали с помощью программного обеспечения CellQuest. Результаты вычисляли как кратность увеличения средней интенсивности флуоресценции по сравнению со значениями перед введением доз.

Экспрессия МНС класса II, отражающая состояние активации и антигенпрезентирующую способность В-клеток, увеличивалась в 2,5-3 раза через 24 часа после введения доз для всех тестируемых доз при отсутствии четкой наблюдаемой взаимосвязи доза-ответ. Экспрессию CD23, другого маркера активации В-клеток оценивали у 2 животных при дозе 3 мг/кг и у одного животного при дозе 10 мг/кг. Экспрессия CD23 повышалась ≥20-кратно через 24 часа после введения доз при отсутствии наблюдаемого влияния дозы. Положительная регуляция обоих поверхностных маркеров сохранялась (≥2-кратное повышение), в то время как уровни 21.4.1 оставались выше 1 мкг/мл. Уровни CD71 (рецептора трансферрина) и СО86-костимуляторной молекулы также продемонстрировали умеренную положительную регуляцию, в то время как экспрессия CD80 значительно не менялась.

21.4.1 положительно регулирует поверхностные маркеры В-клеток Cynomolgus in vivo. Экспрессия МНС класса II и CD23 на CD20+-клетках увеличивается при обработке, и оказывается, что 1 мг/кг (что соответствует С_max~20 мкг/мл и воздействию ≥0,1 мкг/мл в течение 4 суток) продуцирует предельный фармакодинамический ответ в В-клетках Cynomolgus. Продолжительность этого ответа была больше при более высоких дозах.

Фармакокинетические свойства анти-CD40-антитела (21.4.1) исследовали у обезьян Cynomolgus после внутривенного (IV) введения однократной дозы 1, 3, 5 или 10 мг/кг. 21.4.1 характеризовалось низким системным клиренсом (0,0133-0,0635 мл/мин/кг) и малым объемным распределением в стабильном состоянии (0,0459-0,0757 л/кг), что приводит в результате к видимому среднему периоду полувыведения от 0,75 до 2,0 суток (Таблица 1). Фармакокинетика 21.4.1 в исследованном интервале доз оказалась дозозависимой. Значения клиренса в целом снижались с повышением дозы от 1 до 10 мг/кг, и видимый средний период полувыведения увеличивался с 0,75 суток при 1 мг/кг до 2,0 суток при 10 мг/кг. Объем распределения в стабильном состоянии был похож при различных дозах (среднее 0,0575 л/кг).

Наблюдаемый дозозависимый клиренс может быть отчасти следствием связывания 21.4.1 с CD40-рецепторами, которые широко экспрессируются в нормальных тканях, и последующей интернализации и элиминации комплекса антитело-рецептор. Развитие антителогенеза примат-против-человека (РАНА) может также вносить вклад в ускоренный клиренс у некоторых обезьян. РАНА оценивали только после того, как индивидуальные концентрации 21.4.1 в сыворотке достигали нижнего предела количественного определения (LLOQ, 0,03 мкг/мл), поскольку присутствие 21.4.1 в тестируемой сыворотке препятствует анализу на РАНА. Анти-21.4.1-антитела были обнаружены у всех обезьян в группах с дозами 3, 5 и 10 мг/кг на 14-28 сутки после введения антитела.

Таблица 1
Средние (±SD (стандартное отклонение)) фармакокинетические параметры 21.4.1 у обезьян Cynomolgus после однократного внутривенного введения 1, 3, 5 и 10 мг/кг
Доза (мг/кг)	N/пол	CL (мл/мин/кг)	Vdss (л/кг)	t1/2 (сутки)	AUC(0-∞) (мкг·ч/мл)
1 3 5 10	2/пол 2/пол 2F 1/пол	0,0635±0,0245 0,0213±0,0055 0,0174 0,0133	0,0757±0,0265 0,0459±0,0055 0,0488 0,0529	0,75±0,21 1,4±0,3 1,4 2,0	298±126 2460±600 4790 12500
CL - клиренс
Vdss - объем распределения в стабильном состоянии
AUC(0-∞)- площадь под фармакокинетической кривой в интервале 0-∞

Пример 5: Противоопухолевая активность антитела

Ингибиторную активность антитела к CD40 (21.4.1) в отношении опухолевого роста определяли у мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров, подкожно инъецированных только опухолевыми клетками (1×107) или человеческими дендритными клетками (DC) (1×105) и Т-клетками (5×105) от одного и того же донора. Соотношение опухолевых клеток к DC- и Т-клеткам составляло 100:1:5. Если не указано иное, результаты представляли в виде размера опухоли в мм² в один фиксированный момент времени, предварительно определенный (из кинетических экспериментов) как время, когда рост опухолей у контрольных животных достигал величины 300-400 мм², и дальнейшее продолжение эксперимента было негуманным. Во всех случаях вводили только одну инъекцию 21.4.1, которое обладало T_1/2>30 суток у мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров.

Пример 5 (а): Эффекты антитела на CD40(-)-опухоли человека

Исследовали эффекты антитела к CD40 (21.4.1) на рост CD40(-)-опухолей (например, эритролейкемии и карциномы толстой кишки). В частности, опухоли К562 были выбраны для оценки эффективности 21.4.1 против CD40(-) низкоиммуногенной (отрицательной по классу I и II) опухоли.

Мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров подкожно инъецировали CD40(-)-эритролейкемической опухолью, К562 (АТСС CCL-243) самой по себе или в присутствии Т- и DC-клеток периферической крови человека. Животные получали однократную IP инъекцию 21.4.1 либо в момент инъекции опухоли, либо через 5 суток, с использованием варьирующих уровней доз.

Однократная IP инъекция 21.4.1 привела дозозависимому ингибированию роста опухоли К562, когда присутствовали иммунные клетки, как это показано на 21 сутки после опухолевой провокации (фиг.1). Количество 21.4.1, которое вызывает 50%-ное ингибирование опухолевого роста, составляло 0,005 мг/кг и соответствовало С_max концентрации в сыворотке 0,05 мкг/мл. Подобные результаты наблюдались с CD40(-)-карциномой толстой кишки, Lovo (АТСС CCL-229). Результаты были идентичными, когда 21.4.1 вводили в 0 сутки или на+5 сутки относительно опухолевой провокации. Рост этих CD40(-)-опухолей не ингибировался 21.4.1 в отсутствие иммунных клеток.

21:4.1 предотвращает рост CD40(-)-опухолей, когда присутствуют иммунные клетки, что предполагает усиление опосредованной иммунитетом противоопухолевой активности. Это было продемонстрировано в отношении карциномы толстой кишки и эритролейкемической опухоли. Такая противоопухолевая активность была также продемонстрирована с использованием антитела 3.1.1 в отношении карциномы толстой кишки и для антитела 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V (IC50<0,01 мг/кг) при эритролейкемической опухоли. Таким образом, данные, раскрытые здесь, демонстрируют, что антитело 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V обладает in vivo активностью антитела 3.1.1. Эти результаты на in vivo опухолях дополнительно подтверждают, что с учетом аналогичных данных in vitro, полученных при сравнении двух антител, антитело 3.1.1 и антитело 3.1.1Н-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V in vivo ведут себя подобно. Таким образом, результаты, полученные с использованием 3.1.1, применимы к 3.1.1Н-А78Т-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V в этом и в других анализах.

Пример 5 (б): Эффекты антитела на рост опухолей молочной и предстательной железы человека

Исследовали эффекты анти-CD40-антитела (21.4.1) на предотвращение роста опухолей молочной и предстательной железы.

Проводили провокацию мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров опухолью молочной железы человека, ВТ 474 (АТСС НТВ-20), подкожно вместе с DC- и Т-клетками периферической крови человека. Животные получали однократную дозу 21.4.1 (IP) в момент инъекции опухоли.

Как показано на фиг.2, однократная инъекция 21.4.1 предотвращала рост клеток ВТ 474 в присутствии иммунных клеток. Количество 21.4.1, необходимое, чтобы вызвать 50%-е уменьшение опухолевого роста, составляло 0,005 мг/кг, соответствующее С_max, концентрации в сыворотке 0.05 мкг/мл. Подобные результаты наблюдались в отношении клеточной линии рака предстательной железы человека, РС-3 (АТСС CRL-1435). То же самое было также продемонстрировано с использованием антитела 3.1.1 и может ожидаться для 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V.

21:4.1 предотвращает рост опухолей молочной и предстательной железы человека.

Пример 5 (в): Противоопухолевые эффекты антитела в отношении CD40(+)-опухолей

Изучали эффекты анти-CD40-антитела (21.4.1) на противоопухолевую активность в отношении CD40(+)-опухолей и изменения в эффективности в присутствии и в отсутствие иммунных клеток.

Мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров инъецировали подкожно CD40(+) В-клеточной лимфомой линии Raji (АТСС CCL-86) (SC) с последующей однократной дозой 21.4.1 (IP) в момент инъекции опухоли. Некоторых животных также инъецировали человеческими DC и Т-клетками. Рост опухолей оценивали на 21 сутки.

Как показано на фиг.3, количество 21.4.1, которое вызывает 50%-ное ингибирование опухолевого роста в присутствии иммунных клеток, составляло 0,02 мг/кг и соответствовало концентрации в сыворотке С_max равной 0,2 мкг/мл. Когда опухолевые клетки инъецировали совместно с иммунными клетками, количество 21.4.1, необходимое, чтобы вызвать 50%-ное ингибирование опухолевого роста, уменьшалось в 20 раз до 0,001 мг/кг (С_max концентрация в сыворотке = 0,01 мкг/мл).

Эти результаты иллюстрируют, что 21.4.1 обладает непосредственной противоопухолевой активностью в отношении CD40(+)-опухолей. Это наблюдение было также сделано для 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V (IC50<0,01 мг/кг). Эта противоопухолевая активность для антитела 21.4.1 повышалась, когда присутствовали иммунные клетки, и то же самое также было продемонстрировано с антителом 3.11 и ожидается для антитела 3.1.1Н-А78Т-V88A-V97A/3.1.1 L-L4M-L83V.

Пример 5 (г): Противоопухолевые эффекты антитела в отношении В-клеточной лимфомы

Оценивали способность анти-CD40-антитела по изобретению (21.4.1) задерживать смертность в CD40(+) системной модели опухоли с использованием В клеточной лимфомы.

Мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров инъецировали внутривенно В-клеточной лимфомой Daudi (АТСС CCL-213). 21.4.1 вводили в виде однократной инъекции (IP) в момент инъекции опухоли. За смертностью наблюдали в течение 58 суток.

Как показано на Фиг.4, однократная инъекция 21.4.1 предупреждала смертность, вызванную системно вводимой линией опухолевых клеток.

21.4.1 задерживает смертность в системной модели CD40(+)-опухоли с использованием В-клеточной лимфомы. Это было также продемонстрировано с использованием 3.1.1, и аналогичные результаты ожидаются для 3.1.1Н-А78Т-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V.

Пример 6: Терапевтические эффекты антитела в комбинации с цисплатином

Исследовали терапевтические эффекты анти-CD40-антитела (21.4.1) в предупреждении роста опухолей молочной железы человека самого по себе и в присутствии цисплатина.

Мышей со SCID и врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров инъецировали SC опухолью молочной железы, ВТ 474. Антитело (1 мг/кг, IP) и/или цисплатин (2,5 мг/кг, IP) вводили в виде однократной инъекции, как только опухоли достигали размера 200 мм². Опухолевый рост измеряли на 84 сутки после провокации.

Как показано на фиг.4, однократная инъекция 21.4.1 или цисплатина предотвращала опухолевый рост. Однако комбинация обоих терапевтических агентов привела к полной регрессии опухоли у 7/8 животных.

21.4.1 предотвращает опухолевый рост при отдельном введении, как только опухоли сформировались, и вызывает регрессию опухоли при введении в комбинации с цисплатином. Это было также продемонстрировано с использованием антитела 3.1.1, а также вероятно для 3.1.1H-A78T-V88A-V97A/3.1.1L-L4M-L83V.

Пример 7: Многодозовая фармакокинетика антитела

В многодозовом исследовании 21.4.1 вводили внутривенно обезьянам Cynomolgus (2/пол/доза) в дозах 0,3, 1,0 и 10 мг/кг на 1, 3, 5, 7 и 9 сутки для 5 суммарных доз. Кровь собирали на 1 и 9 сутки до введения доз и через 0,5, 6 и 24 часа после введения доз, а также перед введением доз и через 0,5 часа после введения доз на 5 сутки для измерения концентраций лекарственных средств в сыворотке. Системное воздействие 21.4.1, при оценке посредством C_max и средней AUC_(0-24), увеличивалось с увеличением дозы от 0,3 до 10 мг/кг как на сутки 1, так и на сутки 9 (таблица 2). Подобные воздействия (средняя C_max и средняя AUC) наблюдались на сутки 1 и 9 в группах доз 0,3 и 1 мг/кг. В группе дозы 10 мг/кг средние значения C_max и AUC_(0-24) повышались в 2,6 и в 2,8 раза соответственно, от суток 1 до суток 9. Связанные с полом различия в воздействии не наблюдались.

Таблица 2
Средние (±SD) фармакокинетические параметры 21.4.1 у обезьян Cynomolgus на 1 и 9 сутки с последующим внутривенным введением через день
Дозаa (мг/кг)	Сутки	Cmax (мкг/мл)	Tmax (Ч)	AUC(0-24) (мкг·ч/мл)
0,3   1,0   10	1 9 1 9 1 9	4,67±1,71 7,4±2,9 26,7±5,1 12,3±9,1 226±29 577±163	1,9±2,8 0,5±0,0 0,5±0,0 1,9±2,8 1,9±2,8 3,3±3,2	47,7±15,4 55,6±47,1 387±59 219±151 4130±600 11400±2100
аN=2/пол/доза

Пример 8: Препарат антитела

Антитело к CD40 концентрировали до приблизительно 11,0 мг/мл ±0,8 мг/мл, используя устройство для ультрафильтрации, содержащее кассеты для отсечения молекулярной массы 30 кДа. Затем концентрат подвергали диализу, фильтровали в буфер 20 мМ ацетат натрия/140 мМ хлорид натрия, рН 5,5. К концентрированному диализно отфильтрованному продукту добавляли 2%-ный раствор полисорбата 80 до достижения конечной концентрации полисорбата 80, равной 0,02%.

1. Жидкий фармацевтический препарат, пригодный для парентерального введения, содержащий агонистическое антитело к CD40 при рН 5,0-6,0 и фармацевтически приемлемый носитель, где антитело выбрано из группы, состоящей из 3.1.1, 3.1.1 Н-А78Т, 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A, 3.1.1 Н-А78Т-V88A-V97A/3.1.1 L-L4M-L83V, 7.1.2, 10.8.3, 15.1.1, 21.4.1, 21.2.1, 22.1.1, 22.1.1Н-С109А, 23.5.1, 23.25.1, 23.28.1, 23.28.1 H-D16E, 23.29.1, 24.2.1, 3.1.1 L-L4M-L83V и 23.28.1L-C92A, и где фармацевтически приемлемый носитель выбран из ацетата натрия, хлорида натрия и полисорбата 80.

2. Препарат по п.1, где концентрация указанного антитела составляет, по меньшей мере, примерно 5 мг/мл.

3. Препарат по п.2, содержащий антитело, ацетат натрия, хлорид натрия и полисорбат 80.

4. Препарат по п.3, содержащий антитело, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из 21.4.1, 3.1.1 и 3.1.1 H-A78T-V88A-V97A/3.1.1 L-L4M-L83V.

5. Способ лечения рака у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества антитела, где антитело находится в фармацевтическом препарате по п.1.

6. Способ по п.5, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из 21.4.1, 3.1.1 и 3.1.1 Н-А78Т-V88A-V97A/3.1.1 L-L4M-L83V.

7. Способ по п.5, дополнительно включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества ингибитора репликации ДНК.

8. Способ по п.7, где указанный ингибитор репликации ДНК представляет собой цисплатин.