Способ выделения внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот из крови

Изобретение относится к области клинической биохимии и касается способа выделения внеклеточных ДНК (внДНК) из крови. Сущность способа заключается в добавлении Nonidet Р-40 или тритон Х-100 к исследуемой пробе крови до конечной концентрации 0.5-1.5%, инкубации смеси во льду в течение 1-15 мин, разделении лизированной крови на супернатант и ядерную фракцию клеток при помощи центрифугирования. Далее супернатант обрабатывают РНК-гидролизиующим ферментом и из полученной фракции выделяют внДНК при помощи стекловолокнистого сорбента. Использование способа позволяет упростить процедуру выделения внДНК, одновременно выделять из лизата крови свободные и связанные с поверхностью клеток крови внДНК, что позволяет значительно повысить достоверность и чувствительность дальнейшего исследования при амплификационном анализе для ранней диагностики онкологических и других заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 4 табл.

 

Изобретение относится к области медицины, конкретнее к клинической биохимии, а именно к разработке способов выделения внеклеточных ДНК (внДНК) из крови, которые могут быть использованы в амплификационном анализе для ранней диагностики предраковых состояний и ранних стадий рака, состояний плода при беременности, а также мониторинга эффективности противораковой терапии.

На сегодняшний день актуальной проблемой медицины является выявление онкологических заболеваний на ранних стадиях развития (предрак и ранний рак). Современные методы инструментального анализа, такие как рентгенология, эндоскопия, ультразвук, маммография, не только не являются достаточно эффективными на ранних стадиях заболевания, но и дают большое количество ложноотрицательных результатов. Использование опухолевых тканей в качестве биологического материала возможно только при сформировавшейся опухоли и не применимо для ранней диагностики и мониторинга эффективности противоопухолевой терапии. Исходя из всего вышесказанного, использование для диагностики маркеров, присутствующих в таком легкодоступном биологическом материале как периферическая кровь, является очень перспективным. Иммунохимический анализ онкомаркеров в настоящее время широко используется, но не обладает достаточной специфичностью и чувствительностью, поскольку достаточное для измерения количество белкового антигена может быть секретировано в кровь только сформировавшейся опухолью определенного размера. Анализ ДНК маркеров в составе внеклеточных ДНК крови представляется перспективным, поскольку обладает высокой чувствительностью и позволяет выявлять опухолевую трансформацию на ранних стадиях развития опухолей (предрак, рак in situ).

В настоящее время используются различные методы исследования генетического материала крови, такие как определение концентраций нуклеиновых кислот [1], анализ изменений генов (точечные мутации и статус метилирования промоторных областей) и анализ дозы генов (потеря гетерозиготности, микросателлитная нестабильность) [2, 3].

Известен способ выделения ДНК из крови для последующей ранней диагностики рака легкого при помощи определения концентрации ДНК в плазме крови онкологических больных [4], включающий сбор крови самотеком с последующим разделением собранной крови на плазму и фракцию клеток крови и определением концентрации ДНК в плазме крови онкологических больных. ДНК из плазмы крови больных раком легкого выделяли при помощи набора для выделения QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Канада), концентрацию выделенной ДНК определяли при помощи DNA DipStick TM Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Концентрация ДНК в плазме у здоровых доноров (n=43) составила 18 нг/мл, у пациентов с первичным плоскоклеточным раком легкого I стадии (n=46) - 320-344 нг/мл, у пациентов II и III стадии (n=15 и n=23) - 304 и 290 нг/мл соответственно. Было показано, что при успешном хирургическом вмешательстве уровень раковой ДНК в плазме снижается в несколько раз по сравнению с уровнем до операции (n=35).

Недостатками данного способа являются высокая вероятность получения ложноотрицательных результатов, поскольку данный способ не позволяет выявлять опухоли, локализованные в различных органах. Еще один недостаток - высокая вероятность получения ложноположительных результатов, поскольку увеличение концентрации ДНК в плазме крови наблюдается не только при онкологических, но и при неонкологических заболеваниях (травма [5], аутоиммунные заболевания [6] и т.д.).

Известен способ выделения РНК для последующей диагностики рака предстательной железы путем выявления мутантных генов раковых клеток методами ПЦР-анализа [7]. Известно, что на поздних стадиях рака метастатические клетки циркулируют в крови, поэтому для анализа используют клеточную фракцию крови, из которой выделяют РНК одним из известных способов, а затем проводят мультиплексную ОТ-ПЦР. При раке предстательной железы у 84% пациентов (43/51) со злокачественной опухолью были выявлены значительные количества (3800 копий/0.5 мл крови) PSA и hK2 мРНК, тогда как лишь у одного из 19 пациентов (5%) с доброкачественной опухолью было обнаружено присутствие фрагментов PSA и hK2 мРНК в количестве 1500 и 3100 копий/0,5 мл крови. Главным недостатком этого метода является то, что требуется обязательное наличие метастатических, циркулирующих в крови больного раковых клеток (для негематологических опухолей), что ограничивает использование амплификационного анализа для больных в предраковом состоянии и с раком на начальной стадии.

Известен способ выделения ДНК для последующей диагностики онкозаболеваний путем выявления мутантных онкогенов ras в плазме периферической крови с помощью аллельспецифичной ПЦР с последующим секвенированием полученных фрагментов ДНК [8]. Недостатками этого способа являются большая трудоемкость и длительность выделения ДНК, а также низкая достоверность результатов диагностики раковых и особенно предраковых состояний из-за небольшого удельного содержания специфических последовательностей НК, что затрудняет клиническое использование данного способа.

Известен способ выделения внеклеточных ДНК для последующей диагностики преэклампсии путем оценки количества внеклеточных НК, циркулирующих в плазме беременных женщин, методами амплификации [9]. Недостатком данного способа является низкая достоверность результатов диагностики ранней патологии беременности.

Наиболее ближайшим к заявленному способу - прототипом является способ выделения внДНК из крови для последующей диагностики онкологических заболеваний путем выявления онкоспецифических маркеров в плазме и элюатах с поверхностей клеток крови [10]. Данный способ включает следующие стадии: разделение крови на форменные элементы и плазму, разделение клеток крови на эритроциты и лейкоциты, обработку данных клеток PBS буфером, содержащим ЭДТА (для элюции нуклеиновых кислот, связанных с клетками за счет ионных взаимодействий), затем обработку клеток трипсином (для элюции нуклеиновых кислот, связанных с клетками за счет белковых взаимодействий) и выделение внеклеточной циркулирующей ДНК из всех вышеперечисленных фракций (5 штук) сорбцией на мелкодисперсном стекле (ММС). После выделения ДНК подвергают бисульфитной модификации с последующей постановкой полимеразной цепной реакции для выявления изменений статуса метилирования генов RAR/32, RASSF1A и HIC-1.

Недостатком прототипа является высокая трудоемкость и многостадийность способа и, в связи с этим, недостаточная чувствительность последующего выявления онкоспецифических маркеров.

Технической задачей изобретения является упрощение способа и повышение чувствительности анализа.

Поставленная задача достигается предлагаемым способом, заключающимся в следующем.

Осуществляют сбор крови самотеком при помощи иглы для переливания крови в антисвертывающий раствор, содержащий PBS буфер (10 мМ фосфатный буфер, рН 7,5, 0,15 М NaCl) и 8-15 мМ ЭДТА. Далее в кровь добавляют Nonidet P-40 (NP-40) или тритон Х-100 до конечной концентрации 0.5-1.5%, инкубируют смесь во льду в течение 1-15 мин, лизированную кровь разделяют на супернатант, содержащий фракцию плазмы и мембран-цитозольную фракцию клеток крови, содержащую адсорбированные на поверхности клеточных мембран внеклеточные нуклеиновые кислоты и ядерную фракцию клеток, при помощи центрифугирования в течение 15 мин при 2000 g. Ядерную фракцию клеток отбрасывают. Далее проводят обработку супернатанта РНК-гидролизиующим ферментом, преимущественно РНКазой А с концентрацией 5-100 U при 37°С в течение 20-120 минут для гидролиза как клеточной, так и внеклеточной РНК. Из обработанного ферментом супернатанта проводят выделение суммарного пула внДНК (свободных и связанных с поверхностью клеток крови) с использованием стекловолокнистых сорбентов (преимущественно производства Biosilica) и выявление известных специфических последовательностей нуклеиновых кислот методами амплификационного анализа с последующим анализом ПЦР продуктов и составлением заключения о наличии или отсутствии детектируемых нуклеотидных последовательностей.

Использование для анализа внДНК не только свободных, но и связанных с поверхностью клеток крови особенно эффективно для диагностики ранних стадий патогенеза, в частности рака, когда основная масса внДНК крови связана с клеточной поверхностью.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа, по сравнению с прототипом, являются:

1. Клетки исследуемой крови лизируют добавлением Nonidet P-40 (NP-40) или тритона Х-100 до конечной концентрации этих реагентов 0.5-1.5%, что обеспечивает одновременное выделение из крови свободных и связанных с поверхностью клеток крови внДНК, что позволяет значительно повысить достоверность выявления специфических последовательностей ДНК на ранних стадиях заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки.

2. Лизированную кровь разделяют на супернатант и ядерную фракцию клеток при помощи центрифугирования, что позволяет уменьшить количество балластных нуклеиновых кислот из нормальных клеток крови и увеличить удельное содержание выявляемых специфических последовательностей для дальнейшего амплификационного анализа.

3. Супернатант обрабатывают РНК-гидролизиующим ферментом и из полученной фракции выделяют внДНК при помощи стекловолокнистых сорбентов, что позволяет упростить способ за счет сокращения времени на подготовку образца и, соответственно, времени всего анализа (от забора крови до выдачи готового результата), тогда как в прототипе используют отдельно свободные и связанные с клеточной поверхностью внДНК.

Одновременное использование такого диагностического объекта как свободные и связанные с поверхностью клеток крови внДНК позволяет увеличить чувствительность детекции специфических последовательностей за счет их повышенного удельного содержания на ранних стадиях патогенеза.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения способа.

Пример 1.

Была взята кровь у 20 впервые поступивших женщин в Новосибирский Областной Онкологический диспансер с первичным диагнозом рак молочной железы и 20 здоровых доноров, пришедших в отделение переливания крови Центральной Клинической Больницы СО РАН.

Кровь была собрана самотеком при помощи иглы для переливания крови в антисвертывающий раствор, содержащий PBS, 8 мМ ЭДТА. Собранную кровь лизировали добавлением NP-40 до его конечной концентрации 0.5%. После инкубации во льду в течение 15 минут ядра осаждали центрифугированием в течение 15 минут при 2000 g. Далее проводили обработку супернатанта 5 U РНКазы А при 37°С в течение 120 минут для гидролиза как клеточной, так и внеклеточной PHK. Из полученной фракции выделяли внДНК с использованием коммерческого набора для выделения ДНК из крови «Biosilica».

Полученную ДНК модифицировали обработкой бисульфитом натрия, при которой неметилированные цитозины в 5 положении превращаются в урацилы (20 минут при 75°С в присутствии 3М NaOH; 4 часа при 56°С в присутствии Na₂S₂O₅; 30 минут при 37°С в присутствии 3М NaOH).

Далее для исследования концентрации и статуса метилирования промоторной области гена RARβ2 проводили полимеразную цепную реакцию в реальном времени с использованием флуоресцирующих красителей SYBR Green I и флуоресцеина. После начальной денатурации 1.5 минуты при 95°С проводили 38 циклов в следующем режиме: денатурация ДНК при 95°С - 15 секунд; отжиг праймеров при 64.5°С - 20 секунд; элонгация при 72°С - 40 секунд; детекция флуоресценции после 87°С - 12 секунд.

Были использованы следующие праймеры:

(прямой) 5'-GGT TAG TAG TTC GGG TAG GGT TTA TC-3'

(обратный) 5'-CCG AAT CCT ACC CCG ACG-3'

Полученные данные по 10 пациентам представлены в таблице 1 (Количество копий гена RARbeta (метилированная форма) в супернатанте крови из расчета на 1 мл крови).

Данный пример иллюстрирует, что выделенные разработанным способом внДНК могут быть использованы для ранней диагностики онкологических заболеваний с помощью анализа статуса метилирования внДНК, выделенных из супернатанта крови.

Пример 2.

При проведении ежегодного обследования рабочих (производство плутония и, как следствие, риск онкозаболеваний дыхательных путей) в 2006 и 2007 годах были взяты образцы крови. Целью обследования было выявление среди рабочих с неопределенными хроническими заболеваниями легких (группа риска) профиля гиперметилирования генов (АРС и RASSF1A), вовлеченных в регуляцию онкообразований.

Кровь была собрана самотеком при помощи иглы для переливания крови в антисвертывающий раствор, содержащий PBS, 15 мМ ЭДТА. Взятую кровь лизировали добавлением NP-40 до его конечной концентрации 1.5% в течение 1 минуты во льду с последующим разделением при помощи центрифугирования в течение 15 минут при 2000 g на супернатант и ядерную фракцию. Далее супернатант обрабатывали 100 U РНКазы А в течение 20 минут при 37°С и из полученной фракции выделяли внДНК с использованием стекловолокнистых сорбентов производства «Biosilica».

После проведения модификации ДНК, как описано в примере 1, проводили ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцирующих красителей SYBR Green I и флуоресцеин: начальная денатурация 1.5 минуты при 95°С, затем 38 циклов в следующем режиме:

- для гена АРС - денатурация ДНК при 95°С - 25 секунд; отжиг праймеров при 64°С - 30 секунд; элонгация при 72°С - 30 секунд; детекция флуоресценции после 85°С - 12 секунд; были использованы праймеры [11]:

метилированная пара - 5'-TATTGCGGAGTGCGGGTC-3' (Пр1),

5'-TCGACGAACTCCCGACGA-3' (Пр2);

неметилированная пара - 5'-GTGTTATTGTGGAGTGTGGGTT-3' (Пр1),

5'-ССААТСААСАААСТСССААСАА-3' (Пр2);

- для гена RASSF1A - 20 секунд при 95.5°С, 25 секунд при 64°С (для метелированной пары праймеров), 25 секунд при 59°С (для неметилированной пары праймеров), 30 секунд при 72°С; детекция флуоресценции после 86°С - 15 секунд; были использованы праймеры [12]:

метилированная пара - 5'-GGGTTTTGCGAGAGCGCG-3' (Пр1),

5'-GCTAACAAACGCGAACCG-3' (Пр2);

неметилированная пара - 5'-GGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG-3' (Пр1),

5'-CACTAACAAACACAAACCAAAC-3' (Пр2);

Полученные данные представлены в таблице 2, из которой видно, что метилированные маркеры АРС и RASSF1A, ассоциированные с легочным канцерогенезом, выявляются с частотой до 63% во внДНК, выделенной из лизата крови, на ранней стадии заболевания (обследование 2006 г.), что позволило поставить предварительный диагноз. Через год при повторном обследовании процент гиперметилированых маркеров в группе риска практически не изменялся. В течение 4 лет с момента первого взятия крови у 62% пациентов из группы риска был клинически подтвержден рак легкого. У всех больных, показавших положительный профиль гиперметилирования, был диагностирован рак легкого.

Данный пример иллюстрирует пригодность использования внДНК, выделенных из лизата крови заявляемым способом, для ранней диагностики рака легкого, что способствует своевременному выбору правильной стратегии лечения.

Пример 3.

У группы женщин (N=25), успешно прооперированных два года назад по поводу раковой опухоли груди и прошедших курс химиотерапии, были взяты образцы крови с профилактической целью, так как пациентки с раком груди входят в группу онкологических больных с высоким риском повторных новообразований.

Взятую кровь лизировали добавлением Тритона Х-100 до его конечной концентрации 0.5% в течение 15 минут во льду с последующим разделением при помощи центрифугирования в течение 15 минут при 2000 g на супернатант и ядерную фракцию. Обработку супернатанта, выделение и исследование внДНК, циркулирующих в крови, проводили аналогично примеру 1 (выделение из лизата крови).

Для оценки экспрессии онкогенов, имеющих важное прогностическое значение при раке груди, ПЦР-анализ в реальном времени провели с использованием праймеров, специфичных для генов с-myc и с-erbB2.

Условия реакции после полутороминутной денатурации ДНК при 95°С были следующее:

- для гена c-myc - 30 циклов: 40 секунд при 94°С, 40 секунд при 65°С, 50 секунд при 72°С; детекция флуоресценции после 88°С - 15 секунд; были использованы праймеры [13]:

5'-CTCGAATTCCTTCCAGATATCCTCGCTG-3' (Пр1);

5'-CACTGCGCGCTGCGCCAGGTTT-3' (Пр2);

- для гена с-erbB2 - 35 циклов: 35 секунд при 94°С, 30 секунд при 56°С, 40 секунд при 72°С; детекция флуоресценции после 85°С - 12 секунд; были использованы праймеры [14]:

5'-CAGGTAGTTTGGCGTAAAAATAAA-3' (Пр1);

5'-CAAAATCCAGGGTTTTTTAAGAGGT-3' (Пр2).

Процент выявленной у пациенток (N=30) сверхэкспрессии исследованных генов представлен в таблице 3.

Из табл.3 видно, что анализ внДНК, выделенной из лизата крови, выявил сверхэкспрессию исследованных генов у 23% женщин (7/30). В течение последующих двух лет у 23% пациенток были клинически диагностированы повторные метастазы в региональные лимфоузлы.

Данный пример иллюстрирует, что разработанный способ может быть использован для оценки эффективности хирургического вмешательства и постоперационной терапии.

Пример 4.

У группы женщин (N=30) из отделения патологии беременности роддома №7 для обоснования возможности постановки на учет женщин с Х и Y сцепленными наследственными заболеваниями были взяты образцы крови с целью определения пола будущего ребенка.

Выделение внДНК, циркулирующих в крови, проводили аналогично примеру 1 (выделение из супернатанта крови). Далее полученную ДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР анализа в реальном времени.

В качестве контроля для определения количества суммарной внДНК использовали ДНК с известной концентрацией, разведенную от 50 до 5000 копий из расчета, что 6.6 пг ДНК на клетку соответствует 1 геномному эквиваленту. Количественное определение (эквивалент генома на 1 мл крови) суммарной внДНК проводили методом ПЦР-анализа в реальном времени. Реакционную смесь денатурировали 10 минут при 95°С, после чего проводили 40 циклов полимеразной цепной реакции в следующем режиме: 1 минута при 60°С и 15 секунд при 95°С; при этом были использованы следующие праймеры и флуоресцентно-меченный зонд:

прямой 5'-GGGAACTAATGACAAAAGAATTGAC-3' (Пр.1),

обратный 5'-AAGAAATAACTTCTGGGTGTGAATAAG-3' (Пр.2),

прямой 5'-GGGAAGAAATGACAAAAGAATTGAC-3' (Пр.3),

обратный 5'-AAGAAATAACGTCTGGGTGTGAATACG-3' (Пр.4),

5'-(6-carboxyfluorescein; FAM) ATTTCACCAAAGTTTACCTTATACTGTG (6-carboxytetramethylrhodamine; TAMPA)-3' (зонд).

Полученные данные представлены в таблице 4.

Из табл.4 видно, что ни в одном образце внДНК, выделенной из лизата крови беременных женщин, у которых после родов было подтверждено рождение девочки, данная последовательность не была обнаружена. Данный пример иллюстрирует пригодность внДНК, выделенных из лизата крови, для ранней диагностики пола плода, что является необходимым в случае, когда беременность отягощена заболеваниями, сцепленными с полом.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом:

- упростить способ и уменьшить время выделения внДНК из крови до 40-180 минут;

- повысить достоверность последующей диагностики неонкологических и онкологических заболеваний за счет дополнительного использования более специфичного диагностического показателя (внДНК, связанных с поверхностью клеток крови);

- исключить получение ложноположительных или ложноотрицательных результатов анализа за счет увеличения количества специфических нуклеиновых кислот в пробе;

- увеличить чувствительность детекции специфических (маркерных) последовательностей ДНК, связанных с поверхностью клеток крови, что особенно важно на ранних стадиях развития патологий, когда основная масса внеклеточных нуклеиновых кислот связана с поверхностью клеток.

Источники информации

1. Shapiro В., Chakrabarty M., Cohn E., Leon S. Determination of circulating DNA levels in patients with benign or malignant gastrointestinal disease // Cancer. 1983. V.51. P.2116-2120.

2. Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, Yao SL. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 1994, V.3: 67-71.

3. Брызгунова О.Е., Власов В.В., Лактионов П.П. Современные методы диагностики рака предстательной железы // Биомедицинская химия. 2007. Т.2. С.128-139.

4. Sozzi G, Conte D., Mariani L., Vullo S., Roz L., Lombargo C., Pierotti M., Tavecchio L. Analysis of circulating tumor DNA in plasma at diagnosis and during follow-up of lung cancer patients // Cancer Res. 2001. V.61. P.4675-4678.

5. Rainer Т., Lo D., Chan L., Lam N., Lit L., Cocks R. Derivation of a prediction rule for posttraumatic organ failure using plasma DNA and other variables. Annals of the New York Academy of Sciences. 2001. V.945. P.211-220.

6. Raptis L., Menard H. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus // J. Clin. Invest. 1980. V.66. №12. P.1391-1399.

7. Ylikoski A, Pettersson К, Nurmi J, Irjala K, Karp M, Lilja H, Lovgren T, Nurmi M. Simultaneous quantification of prostate-specific antigen and human glandular kallikrein 2 mRNA in blood samples from patients with prostate cancer and benign disease // Clin. Chem. 2002, V.48(8): 1265-71.

8. Sorenson GD, Pribish DM, Valone FH, Memoli VA, Bzik DJ, Yao SL. Soluble normal and mutated DNA sequences from single-copy genes in human blood // Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 1994, V.3: 67-71.

9. Zhong XZ, Lavuori H, Livingston JC, Ylikorkala O, Sibai BM, Holzgreve W, Hahn S. Elevation of maternal and fetal extracellular circulating deoxyribonucleic acid concentrations in the plasma of pregnant women with preeclampsia // Am. J. Obstet. Gynecol. 2001, V.184(3): 414-419.

10. Skvortsova Т.Е., Rykova E.Y., Tamkovich S.N., Bryzgunova O.E., Starikov A.V., Kuznetsova N.P., Vlassov V.V., Laktionov P.P. Cell-free and cell-bound circulating DNA in breast tumours: DNA quantification and analysis of tumor-related gene methylation // British Journal of Cancer. 2006. V.94. P.1492-1495.

11. Virmani AK, Rathi A, Sathyanarayana UG, Padar A, Huang CX, Cunnigham HT, Farinas AJ, Milchgrub S, Euhus DM, Gilcrease M, Herman J, Minna JD, Gazdar AF. Aberrant methylation of the adenomatous polyposis coli (APC) gene promoter 1A in breast and lung carcinomas // Clin. Canc. Res. 2001, V.7(7): 1998-2004.

12. Burbee D.G.; Forgacs E.; Zochbauer-Muller S.; Shivakumar L.; Fong K.; Gao В.; Randle D.; Kondo M.; Virniani A.; Bader S.; Sekido Y; Latif F.; Milchgrub S.; Toyooka S, Gazdar AF, Lerman MI, Zabarovsky E, White M, Minna JD. Epigenetic inactivation of RASSF 1A in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression // J. Natl. Cane. Inst. 2001, V.93(9): 691-699.

13. Kowara R, Golebiowski F, Chrzan P, Skokowski J, Karmolinski A, awelczyk T. Abnormal FHIT gene transcript and c-myc and c-erbB2 amplification in breast cancer // Acta Biochimica Polonica, 2002, V.49(2): 341-350.

14. Lonn U, Lonn S, Nilsson B, Stenkvist B. Prognostic value of erb-B2 and myc amplification in breast cancer imprints. Cancer, 1995, V.75(11): 2681-2687.

Таблица 1
	Норма	Рак молочной железы
№ пациента	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Количество копий/мл крови	108	399	193	193	n/a	947	380	396	1148	914
* n/а - количество копий ДНК в образце ниже уровня детекции используемого метода

Таблица 2
Группы обследования	Ген	Год	внДНК крови
Группа риска, N=30	АРС	2006	63%
	2007	62%
	RASSF1A	2006	64%
	2007	66%
В 2006-2007 - саркома легкого обнаружена у 62% пациентов из группы риска, притом, что в эту группу вошли все пациенты с повышенным уровнем гиперметилирования внДНК
Здоровые доноры, N=25	АРС	2006	1%
	2007	2%
	RASSF1A	2006	0
2007	0

Таблица 3
Гены	внДНК крови
c-myc	23%
c-erbB2	23%

Таблица 4
Количество образцов	Кол-во плодной внДНК в лизате крови (количество копий/мл крови)
Количество беременных плодом мужского пола	20	1405,5* (50-2837)
Количество беременных плодом женского пола	10	0
* - среднее значение

1. Способ выделения внеклеточных дезоксирибонуклеиновых кислот (внДНК) из крови для выявления специфических последовательностей нуклеиновых кислот амплификационными методами, отличающийся тем, что в исследуемую кровь добавляют Nonidet Р-40 или тритон Х-100 до конечной концентрации 0,5-1,5%, инкубируют смесь во льду в течение 1-15 мин, лизированную кровь разделяют на супернатант и ядерную фракцию клеток при помощи центрифугирования, супернатант обрабатывают 5-100 U РНКазы А и из полученной фракции выделяют внДНК при помощи стекловолокнистого сорбента.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют стекловолокнистые сорбенты производства «Biosilica».