Способ получения l-триптофана

 

2473I5

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОР СИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Сова Соеетекмв

Социалистичеоаа

Республик

Зависимое от авт. свидетельства л№

Кл, 12q, 6 "01

6b, 16/03

Заявлено 25.Х11.1967 (№ 1206055/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 04.V11.1969. Бюллетень № 22

Дата опубликования описания 22.XII.1969

МПК С 07f

С 12d

УДК 663.132 576.8 097 (088.8) Комитет по делам изобретений н открытиИ при Совете Министров

СССР б- т - и Юэб., Я

Е. Л. Рубан, Л. Б. Лобырева, Т. К. Аболиня, P. К. Озолиня, M е. Бекер, lO. О. Якобсон, С. Э. селга, У. Э. Внестур, л. О; тамная " " )Il и М. И. Верховцева Т1 Х11ИЧЕГКАЯ

БИБЛИОТЕКА

Институт микробиологии имени Августа Кирхенштейн

Авторы изобретения

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРИПТОФАНА

Известны способы получения L-триптофана путем глубинного выращивания продуцирующих его дрожжей штамма Candida utilis 295 в водной питательной среде, содержащей источник углевода, с добавлением необходимых для роста минеральных солей фосфора, магния, кальция, азота в присутствии антраниловой кислоты как предшественника триптофана, с последующим выделением триптофана из культуральной жидкости одним из известных способов.

Предлагаемый способ сокращает процесс и увеличивает выход L-триптофана. Для этого процесс выращивания I -триптофана ведут в две стадии. В первой стадии производят максимальное накопление биомассы при аэрации среды, а во второй — непосредственный биосинтез 1-триптофана при снижении расхода кислорода воздуха и дробном добавлении антраниловой кислоты как предшественника триптофана.

Для интенсификации процесса желательно первую стадию проводить при интенсивности аэрации не,ниже 120 мг О,/л.мин, температуре

28 — 30 С и рН среды 7,5 — 8,0, а вторую — при интенсивности аэрации 60 — 80 мг О /л.мин, той же температуре и том же значении рН.

В качестве источника углеводов для роста биомассы и биосинтеза 1-триптофана предлагается использовать свекловичную мелассу.

С целью получения L-триптофана для кормовых целей полученную культуральную жидкость после окончания процесса выращивания можно обезвоживать одним из известных способов.

Для уменьшения объема культуральной полученной ния, и повышения концентрации 1-триптофана после первой стадии целесообразно концентри10 ровать биомассу одним из известных способов, например сепарированием, а микробную суспензию антисептировать, например, при помощи этилового спирта с последующим разбавлением стерильной средой.

Сущность способа состоит в следующем.

Культуру Candida utilis 295 поддерживают на скошенном сусло-агаре. Готовят питательную среду в следующем составе:

Мел асса 85,0 г/47,2% (сахара)

Фосфат калия двузамещенньш 0,1 г

Сульфат магния 0,05 „

Хлористый кальций 0,1

Мо евина 5,0

Вода до 1 л

Причем мелассу и мочевину стерилизуют отдельно в течение 20 мин при 0,75 атм, а минеральную среду — 30 мин при 1,0 ати, рН среды устанавливают 7,5 — 8,2.

247315

Candida utiIis 295 с сусло-агатового косяка переносят .в колбы, круговой качалки для размножения культуры, после чего максимальное накопление биомассы — первую стадию— проводят в заранее простерилизованных ферментаторах с питательной средой для осуществления глубинного культивирования. Количество засевного материала при последовательных посевах составляет не менее 8% абсолютно сухой биомассы от концентрации перераба- 10 тываемого сахара. Температура ферментации

28 — 30 С, рН 7,5 — 8,0. Интенсивность аэрации не менее 120 мг О,/л.мин (ло,сульфитному методу). После размножения необходимого количества биомассы (не менее 18 г/л абсолютно сухого вещества дрожжей) ведут .вторую стадию процесса — биосинтез L-триптофана.

К дрожжевой суспензии равномерными порциями добавляют 40% по объему раствора мелассы или глюкозы с содержанием 2% са- 20 хара. Длительность интервала подачи раствора при периодическом процессе 6 — 24 час. К суспензии через 0,5 — 2 час после каждой задачи сахара порциями добавляют 0,3 — 0,4% антраниловой кислоты в виде 5%-ного спиртового раствора или 5%-ного водного раствора антранилата натрия и 0,8 — 0,9% мочевины в виде водного раствора, рН культуральной жидкости во время процесса поддерживают

7,5 — 8,0, температуру 28 — 30 С, интенсивность аэрации 60 — 80 мг О.,/л.мин. Общая продолжительность ферментации 6 — 8 суток.

Культуральную жидкость сепарируют из фугата при помощи ионнообменных смол, выделяют L-триптофан в кристаллическом виде.

Выход продукта в неочищенном виде 90%, лосле перекристаллизации 65 — 70%.

Пример. Пример составлен для работы в

100-литровом ферментаторе. Активный штамм дрожжей Candida utilis 295 сохраняют на ско- 40 шенном сусло-агаре и пересевают один раз в месяц. После пересева выдерживают 48 час .в термостате при 28 — 30 С, а затем сохраняют в холодильнике. Далее проводят подготовку посевного материала для ферментации. Куль- 4> туру смывают с косого агара в пробирку 3 мя стерильной ниже указанной средой и высевают на чашки с сусло-агаром по 0,1 — 0,2 мл на чашку, размазывают шпателем и выдерживают в термостате при 28 — 30 С 48 час. Вырос- >0 шие на сусло-агаре дрожжи снимают с поверхности чашек стеклянной лопаточкой и переносят в колбу со стерильной средой. Полученную густую суспензию дрожжей с соблюдением условий стерильности переносят в коли- 55 честве 15 — 20 мл в конические колбы емкостью

250 мл, содержащие по 10 мл питательной среды следующего состава (в г/л): меласса 104, мочевина 5, К2НРО4 0,1; MgSO< 0,05, СаС12

0,1, рН 7,5 — 8,0. Колбы выдерживают на ка- 60 чалке 24 час при 28 — 30 С. После 24 час выращивания содержимое колб в стерильных условиях переносят в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие по 100 мл питательнои среды вышеуказанного состава.

На качалке колбы выдерживают 24 час при

28 — 30 С. После 24 час выращивания на качалке биомасса дрожжей используется для дальнейшего, накопления дрожжевой массы в ферментаторе.

Процесс ферментации в ферментерах проводят следующим образом. Производственную питательную среду следующего состава (в а/л): меласса 62,3, мочевина 5, К2НРО4 0,1, CaCI> 0,1, iVlgSO4 0,05 стерилизуют при 1 ать

30 мин, рН среды 7,5 — 8,0.

После охлаждения до 30 С туда в стерильных условиях переносят посевной материал, который составляет не менее 3 — 5 г/л сухого вещества. В ферментере в течение 24 час дрожжи культивируются при аэрации не менее 120 мг О /л.мин.

В качестве пеногасителя можно использовать подсолнечное масло, кашалотовый жир или кремнийорганическое соединение.

Через 24 час в культуральную жидкость добавляют антраниловую кислоту в виде 5%ного спиртового раствора в количестве 175 мл и мочевину в виде 50%-ного раствора 50 мл.

После дооавки антраниловой кислоты начинается вторая стадия ферментации — биосин.тез 1 -триптофана. Уровень аэрации снижается до 50 мг 02/л.лгик. После добавления в среду антраниловой кислоты или мочевины через

4 час добавляют мелассу в виде 25%-ного раствора до 840 лл. На дальнейшем этапе ферментации добавки проводят в следующем порядке: мелассный раствор добавляют через каждые 12 час ферментации, антраниловую кислоту одновременно с источником азота добавляют через каждые 6 час ферментации. Все растворы добавляются по вышеуказанным количествам.

Через 144 час ферментацию прекращают.

Биомассу отделяют, культуральную жидкость используют для выделения кристаллического триптофана.

Предмет изобретения

1. Способ получения L-три птофана путем глубинного выращивания продуцирующих его дрожжей штамма Candida utilis 295 в водной питательной среде, содержащей источник углевода, с добавлением необходимых для роста минеральных .солей фосфора, магния, кальция, азота в присутствии антра|ниловой кислоты как предшественника триптофана, с последующим выделением 1-троптофана из культу,ральной жидкости одним из известных способов, отличающийся тем, что, с целью увеличения,выхода 1 -три птофана и сокращения времени для его,получения, выращивание дрожжей ведут в две стадии, в,первой из которой производят максимальное накопление биомассы при аэрации среды, а во,второй— непосредственный биосинтез 1 -триптофана при снижении расхода кислорода воздуха и дробном добавлении антранило вой кислоты как предшественника триптофана.

247315

Составитель В. Дунье

Редактор В. Смирягина Текред А. А. Камышникова Корректор О. Б, Тюрина

Заказ 3428/!9 Тираж 480 Подпнснос

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью интенсификации процесса, первую стадию проводят при интенсивности аэрации не ниже 120 мг О л.мин, а вторую — при интенсивности аэрации б0 — 80 мг О./л.мин.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что первую стадию проводят при температуре

28 — 30 С и рН среды 7,5 — 8,0, а вторую — при той же температуре и том же значении рН.