Способ получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита


 


Владельцы патента RU 2402606:

Ворович Михаил Фридрихович (RU)
Учреждение Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН (RU)
Ляпустин Виктор Николаевич (RU)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита (КЭ) из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ. Данный способ предусматривает центрифугирование антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, с угловым ускорением не менее 15000 g. Предложенное изобретение позволяет получать вирионный антиген вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

 

Изобретение относится к способам получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита (КЭ) из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса клещевого энцефалита мельче полноразмерных вирионов КЭ.

Способы получения вирионного антигена вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, заявителю неизвестны.

Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в возможности получения вирионного антигена вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ.

Указанный технический результат достигается центрифугированием антигенсодержащего материала с угловым ускорением не менее 15000 g, g - ускорение свободного падения.

Указанный технический результат достигается также тем, что до или после центрифугирования антигенсодержащий материал подвергают барьерному электрофорезу.

На практике вирионный антиген вируса КЭ получают из антигенсодержащего материала, содержащего значительное количество полноразмерных вирионов КЭ путем его хроматографирования, дающего возможность извлечения из антигенсодержащего материала лишь полноразмерных вирионов КЭ.

При хроматографии на широкопористых носителях распределение надмолекулярных белковых структур и макромолекул осуществляется в зависимости от другого параметра - размера структур. При этом частицы, превышающие размер пор носителя, выходят в эксклюзионном объеме, не задерживаясь при хроматографии, тогда как частицы, сопоставимые с размером пор носителя и меньшие по размеру, распределяются по фракциям в соответствии с размером - чем меньше та или иная структура, тем позже она выходит с хроматографической колонки.

Используемая в настоящее время хроматографическая технология получения вакцины против вируса КЭ [1] состоит из следующих этапов:

1. Концентрация вируссодержащего инактивированного формалином культурального материала с помощью ультрафильтрации.

2. Хроматография полученных концентратов на широкопористых носителях. При этом материал концентратов распределяется на три области фракций. Фракции первого пика оптической плотности содержат основное количество интактных вирионных структур вируса КЭ и примеси, сопоставимые по размеру с вирионами и превышающие их по этому параметру. Фракции второго пика оптической плотности содержат, в основном, низкомолекулярные примеси невирусного характера. Третья область фракций объединяет материал, распределяющийся при хроматографии между двумя пиками. Для этой области характерно не только низкое количество примесей невирусного характера, но низкое содержание антигенного материала, обладающего вирионной специфичностью.

3. Для изготовления вакцины против вируса КЭ используется антигенный вирионный материал первого пика оптической плотности.

Антигенный материал третьей области хроматографических фракций не используется в производстве вакцины против вируса КЭ, поскольку он содержит вирионный антиген в концентрациях, не позволяющих применять их для изготовления вакцины. Этот материал содержит также значительные количества примесных белковых структур. Эти вирионные структуры имеют меньшие размеры, чем полноценные интактные вирионы [2] и поэтому не отделяются при повторной хроматографии от примесей.

В этом антигенсодержащем материале присутствуют, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, способы выделения которых неизвестны. Поэтому такой антигенсодержащий материал не используют.

Способ получения вирионного антигена вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, осуществляют следующим образом.

Антигенсодержащий материал загружают в центрифужные пробирки, которые помещают в центрифужные роторы. Роторы устанавливают в центрифугу и вращают с угловым ускорением не менее 15000 g в любой части пробирок, g - ускорение свободного падения. По окончании центрифугирования роторы извлекают из центрифуги, вынимают из них пробирки. Удаляют из пробирок надосадочную жидкость. Для получения конечного продукта осадок суспендируют в буферном растворе, например, в трис-боратном [3]. Количество полученного антигенсодержащего материала увеличивается с увеличением времени центрифугирования.

Для получения более чистого препарата вирионного антигена вируса КЭ до или после центрифугирования антигенсодержащий материал подвергают барьерному электрофорезу в микроустройстве, описанном ранее [4].

Способ получения вирионного антигена вируса КЭ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение вирионного антигена вируса КЭ центрифугированием.

Антигенсодержащий материал хроматографических фракций концентрировали с помощью ультрафильтрации через фильтр РВМК (Millipore) в 150 раз, затем концентрат центрифугировали в пробирках бакетного ротора 3×35 мл в центрифуге VAC-25 при скорости 21000 оборотов в минуту в течение 4 часов (угловое ускорение составляло около 40000 g на уровне середины пробирки). Осадок суспендировали в трис-боратном буферном растворе в 1/10 исходного объема концентрата, а надосадочную жидкость дополнительно концентрировали в 2,5 раза с помощью ультрафильтрации. Детекцию антигенной активности проводили с помощью иммуноферментного анализа при использовании моноклональных антител к поверхностному гликопротеиду Е [5]. Концентрацию белка в пробах измеряли спектрофотометрически с помощью красителя Coomassie G.

Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что в результате центрифугирования получен существенно очищенный препарат вирионного антигена - соотношение белка Е и суммарного белка в препарате осадка составляло 1:4,6. При этом концентрация белка Е увеличилась более чем в 8 раз и количество его в препарате осадка составляло 75% от исходного количества. Основное количество примесных белков осталось в надосадочной жидкости.

Пример 2. Получение вирионного антигена вируса КЭ центрифугированием с последующим барьерным электрофорезом.

Антигенсодержащий материал хроматографических фракций концентрировали с помощью ультрафильтрации через фильтр РВМК (Millipore) в 150 раз, затем концентрат центрифугировали в центрифуге VAC-25 бакетном роторе 3×35 мл при скорости 21000 оборотов в минуту в течение 4 часов (угловое ускорение составляло около 40000 g на уровне середины пробирки). Осадок суспендировали в трис-боратном буферном растворе в 1/10 исходного объема концентрата и подвергали барьерному электрофорезу в микроустройстве при 70 вольт в течение 12 часов. Для электрофоретического разделения белкового материала в микроустройстве также использовали трис-боратный буфер.

Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что препарат вирионного антигена, полученный в результате ультрацентрифугирования, существенно дополнительно очищается в результате электрофореза. Соотношение белка Е и суммарного белка в антигенных препаратах достигает величин 1:4-1:6 и основное количество примесей перемещается в анодную камеру устройства.

Пример 3. Получение вирионного антигена вируса КЭ барьерным электрофорезом с последующим центрифугированием.

Антигенсодержащий материал хроматографических фракций концентрировали с помощью ультрафильтрации через фильтр РВМК (Millipore) в 200 раз и подвергали барьерному электрофорезу в микроустройстве при 70 вольт в течение 12 часов. Для последующей работы использовали препарат, полученный из камеры введения микроустройства, поскольку вирионные структуры вируса КЭ, синтезирующиеся в первичных культурах клеток куриных эмбрионов, в основном, неподвижны в электрическим поле [6, см. также табл.2]. Антигенный препарат разводили в трис-боратном буфере в три раза и центрифугировали в пробирках бакетного ротора 3×5 мл в центрифуге MSE-65 при скорости 30000 оборотов в минуту в течение 2 часов (угловое ускорение составляло около 80000 g на уровне середины пробирки). Осадок суспендировали в трис-боратном буферном растворе в 1/10 исходного объема концентрата. Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что препарат вирионного антигена, полученный в результате электрофореза, существенно дополнительно очищается в результате ультрацентрифугирования. Соотношение белка Е и суммарного белка в антигенном препарате достигает величины 1:1,17, при этом 75% белка Е перераспределяется в осадок и не менее 80% суммарного белка остается в надосадочной жидкости.

Таким образом, с помощью предлагаемого способа можно получать высокоочищенные препараты вирионного антигена вируса КЭ в количествах, необходимых для создания диагностических препаратов.

Литература

1. Эльберт Л.Б., Красильников И.В., Дроздов С.Г. и соавт. Концентрированная и очищенная вакцина против клещевого энцефалита, приготовленная методом ультрафильтрации и хроматографии. Вопр. вирусол., 1985, №1, с.90-93.

2. Ляпустин В.Н., Ворович М.Ф., Куринная О.Н. и соавт. Распределение антигенных структур вируса клещевого энцефалита при седиментации и хроматографии. В кн.: Медицинская вирусология, Том XXV, Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН, 2008, с.91-102.

3. Фармакопейная статья ФС42-3874-99. Физико-химические, химические и иммунологические методы контроля медицинских и иммунобиологических препаратов. Фармакопейный государственный комитет, 1999, с.49.

4. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г., Соболев С.Г. и соавт. Препаративное разделение структур вируса клещевого энцефалита с помощью электрофореза в жидкой фазе. Вопр. вирусол, 1988, №1, с.98-102.

5. Тимофеев А.В., Эльберт Л.Б., Терлецкая Н.Н. и соавт. Применение прямого твердофазного иммуноферментного анализа для оценки иммунохимической активности вакцины против клещевого энцефалита. ЖМЭИ, 1987, №9, с.89-93.

6. Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Мустафина А.Н. и соавт. Зависимость синтеза вирионных структур вируса клещевого энцефалита от вида клеточных культур. Вопр. вирусол., 1987, №6, с.701-709.

Табл. 1.
Характеристики антигенных вирионных материалов вируса КЭ, полученного из концентрата хроматографических фракций с помощью ультрацентрифугирования
Концентрат хроматографических фракций Препарат осадка концентрата хроматографических
фракций после ультрацентрифугирования
Концентрат надосадочной жидкости концентрата хроматографических фракций после ультрацентрифугирования
Концентрация белка Е (мкг/мл) 40 350 20
Концентрация суммарного белка (мкг/мл) 3200 1600 6900
Соотношение белка Е и суммарного белка 1:80 1:4,6 1:345
Табл. 2
Параметры антигенного вирионного хроматографического материала вируса КЭ, полученного с помощью ультрацентрифугирования и последующей очистки барьерным электрофорезом
Концентрат хроматографических фракций, полученный с помощью ультрацентрифугирования Препарат катодной камеры электрофоретического устройства Препарат камеры введения электрофоретического устройства Препарат анодной камеры электрофоретического устройства
Концентрация белка E (мкг/мл) 45 6 16 7
Концентрация общего белка (мкг/мл) 1050 27 95 520
Соотношение белка Е и суммарного белка
1:23,3 1:4,5 1:5,9 1:52
Табл.3.
Параметры антигенного вирионного хроматографического материала вируса КЭ, полученного из предварительно электрофоретически очищенного концентрата хроматографических фракций с помощью ультрацентрифугирования
Препарат камеры введения после электрофоретической очистки концентрата хроматографических фракций Препарат осадка электрофоретически очищенного концентрата хроматографических фракций после ультрацентрифугирования Надосадочная жидкость электрофоретически очищенного концентрата хроматографических фракций после ультрацентрифугирования
Концентрация белка E (мкг/мл) 80 600 2,5
Концентрация суммарного белка (мкг/мл) 450 700 380
Соотношение белка Е и суммарного белка 1:5,6 1:1,17 1: 152

1. Способ получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита из антигенсодержащего материала, включающего главным образом антигенные частицы вируса клещевого энцефалита мельче полноразмерных вирионов клещевого энцефалита, заключающийся в центрифугировании антигенсодержащего материала с угловым ускорением не менее 15000 g, g - ускорение свободного падения.

2. Способ получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита из антигенсодержащего материала по п.1, отличающийся тем, что до или после центрифугирования антигенсодержащий материал подвергают барьерному электрофорезу.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению питательных сред для культивирования клеток, и может быть использовано для значительного снижения вариаций продукции рекомбинантных белков, которые имеют место при культивировании клеток с использованием разных партий коммерчески доступного соевого гидролизата.

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к устройству для очистки вирусов и может быть использовано в микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа концентрации вирусов из жидких сред. .
Изобретение относится к области вирусологии. .
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и касается способа получения антигенов аденовирусов птиц. .

Изобретение относится к области иммунологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам получения вирусоподобных частиц (VLP) папилломавируса человека, используемых для создания вакцин. .
Изобретение относится к области медицины и касается способа получения живой культуральной гриппозной вакцины

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки вируса везикулярного стоматита (ВВС) из жидкости клеточной культуры
Изобретение относится к области биотехнологии

Изобретение относится к биотехнологии и описывает способ получения очищенного концентрата вируса гриппа, способ включает микрофильтрацию вирусосодержащей аллантоисной жидкости на фильтрующих элементах 0,1-0,2 мкм с дальнейшей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, концентрирование вируса гриппа на мембранах с порогом отсечения 300-500 кДа с последующей диафильтрацией фосфатным буферным раствором, содержащим 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия, 0,02-0,002% анионного детергента и ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы, приготовленной на фосфатном буферном растворе, содержащем 0,25-0,5 М натрия хлорида, ЭДТА или цитрат натрия и 0,02-0,002% анионного детергента. Технический результат изобретения заключается в получении высокоочищенного концентрата вируса гриппа с выходом более 80%, оптимизации технологического процесса. 3 пр., 2 табл.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, генной инженерии и вирусологии. Предложен способ получения препарата, содержащего вирусные антигены, включающий а) инокуляцию клеток инфекционным вирусом в жидкости, b) репродукцию указанного вируса в указанных клетках, с) сбор указанного репродуцированного вируса, d) инактивацию указанного собранного вируса, и е) обработку указанного инактивированного вируса детергентом, приводящий к получению препарата, содержащего вирусные антигены. Способ может быть использован в медицине и фармакологии при получении вакцин. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 2 табл., 3 пр.

Изобретение относится к области биохимии. Проводят гомогенизацию тканей зараженного растения в нейтральном буферном растворе на основе 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновой кислоты (HEPES) в концентрации 0,02-0,03 М с добавлением ингибиторов растительных ферментов иодайетата натрия и фенилметилсульфонилфторида. Добавляют сахарозу. Осветляют полученный экстракт. Обрабатывают осветленный экстракт 4-6% Тритоном Х-100 для отделения вирусных частиц от клеточных компонентов. Выделяют вирусные частицы из осветленного экстракта посредством дифференциального центрифугирования или ультрацентрифугирования. Способ позволяет увеличить выход вирусных частиц, очищенных от растительных примесей, из 100 г навески свежих листьев в 2-3 раза. 4 ил., 4 пр.

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способы очистки инактивированного вируса или фрагментированного вируса (варианты). Способы включают добавление препарата вируса к градиенту сахара и последующее центрифугирование для получения пиковой фракции. Затем осуществляют экстракцию пиковой фракции для получения очищенного вируса. При этом градиент сахара получают путем непрерывного ультрацентрифугирования первого и второго буферного раствора сахара. Причем первый буферный раствор сахара включает первый физиологический буфер, а второй буферный раствор сахара включает второй физиологический буфер, который является тем же или отличным от первого физиологического буфера. В одном варианте концентрация сахара в первом буферном растворе эквивалентна концентрации сахарозы от 35 до 50 мас.%, а концентрация сахара во втором буферном растворе эквивалентна концентрации сахарозы от 50 до 65 мас.%. При этом второй буферный раствор сахара имеет более высокую плотность, чем первый. В другом варианте способа плотность первого буферного раствора сахара составляет от 1,15 кг/л до 1,23 кг/л, а плотность второго - от 1,23 кг/л до 1,32 кг/л. Способы приводят к повышенному на 25% выходу вируса и минимизируют агрегацию вируса в сахарозной фракции пика. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 1 ил., 9 табл., 10 пр.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для производства различных инактивированных вакцин против гриппа. Для этого проводят заражение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), очистку ВАЖ методом микрофильтрации. Очистку ВАЖ осуществляют с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в концентрации 1,5% с последующей микрофильтрацией на глубинных фильтрах с диаметром пор 1,0 мкм и 10,0 мкм. Далее очищенная ВАЖ концентрируется методом ультрафильтрации на мембранах с отсечкой молекулярного веса 100 килодальтон и полученный концентрат очищается в градиенте плотности сахарозы методом ультрацентрифугирования. Использование данного способа позволяет повысить качество очистки вирионов, а также увеличить количество вирусных антигенов, получаемых с одного куриного эмбриона. 1 табл., 1 ил., 6 пр.
Наверх