Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры



Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры
Способ очистки, предназначенный для получения очищенного вируса везикулярного стоматита из клеточной культуры

 


Владельцы патента RU 2484135:

ВАЙЕТ (US)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу очистки вируса везикулярного стоматита (ВВС) из жидкости клеточной культуры. Способ включает осветление жидкости клеточной культуры низкоскоростным центрифугированием при скорости ниже 10000 об/мин или при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, с получением ВВС в надосадочной жидкости. Фильтруют надосадочную жидкость через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, и получают ВВС в отфильтрованном растворе. Загружают содержащий ВВС отфильтрованный раствор на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором. Первый буферный солевой раствор обладает ионной силой от 100 мМ до 400 мМ. Элюируют ВВС из анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором. ВВС элюируется с мембранного адсорбера при добавлении второго буферного солевого раствора в одну стадию. Концентрация соли в одностадийной элюции составляет от 500 мМ до 750 мМ. Собирают элюированные фракции, содержащие ВВС. Очищают ВВС проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по которой от 300 кДа до 1000 кДа и получают ВВС в концентрате. Фильтруют содержащий ВВС концентрат через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получают ВВС в отфильтрованном растворе. Способ очистки не включает использование человеческих эмбрионов. Предложенное изобретение позволяет получить ВВС высокой степени очистки с высоким выходом. 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 33 табл., 12 пр.

 

Вирус везикулярного стоматита (BBC), представляющий собой член семейства рабдовирусов, содержит несегментированный, одноцепочечный геном антисмысловой РНК (- РНК). Его геном размером 11 т.н. (11 тысяч нуклеотидов) включает пять генов, которые кодируют пять структурных белков вируса: нуклеокапсидный белок (N), который требуется в стехиометрических отношениях для инкапсулирования реплицированной РНК; фосфопротеин (Р), являющийся кофактором РНК-зависимой РНК-полимеразы (L); матричный белок (М) и гликопротеин прикрепления (G) (см., например: Gallione et al., 1981, J. Virol., 39:529-535; Rose and Gallione, 1981, J. Virol., 39:519-528; патент США No. 6033886; патент США No. 6168943).

В общем случае BBC не считается патогеном человека и поэтому естественный иммунитет к BBC у людей встречается крайне редко. Таким образом, разработка векторов на основе BBC оказалась целевым направлением в таких областях, как создание иммуногенных композиций (например, вакцин) и доставка генов, кодирующих терапевтические белки. Например, исследования показали, что BBC может служить эффективным вектором для экспрессии белка гемагглютинина вируса гриппа (Roberts et al., 1999 J. Virol., 73:3723-3732), белка Н вируса кори (Schlereth et al., 2000 J. Virol., 74:4652-4657) и белков env и gag ВИЧ-1 (Rose et al., 2001 Cell, 106(5):539-49). Другие характеристики BBC, которые обеспечивают его привлекательность как вектора, включают: (а) способность к эффективной репликации в клеточной культуре; (b) неспособность как интегрироваться в ДНК клетки-хозяина, так и участвовать в генетической рекомбинации; (с) существование нескольких серотипов, что позволяет применять стратегии иммунизации типа прайм-буст; (d) возможность вводить в геном BBC интересующие чужеродные гены, экспрессия которых будет эффективно происходить за счет вирусной транскриптазы; и (е) разработка специализированной системы получения инфекционного вируса из комплементарной ДНК, соответствующей вирусному геному (см., например: патент США No.6033886; патент США No.6168943).

Приготовление иммуногенных композиций на основе BBC вектора обычно включает заражение подходящей клеточной культуры (хозяина) рекомбинантным BBC, культивирование BBC на клеточной культуре, сбор жидкости клеточной культуры в подходящий момент и выделение (очистку) BBC из культуральной жидкости. Использование векторов на основе BBC и содержащих их иммуногенных композиций в клинических целях требует образцов BBC (или доз) подходящей чистоты, которая соответствует требованиям безопасности различных органов надзора за безопасностью лекарственных средств во всем мире (например, Управления по контролю за продуктами и лекарствами (США), Европейского агентства лекарственных средств, Канадского агентства по надзору за лекарственными продуктами и продуктами питания и т.д.).

Однако отделение BBC от загрязняющих веществ, происходящих от клеточной культуры (например, загрязняющих белков и ДНК клеточной культуры), и получение BBC подходящей чистоты и с требуемым выходом при помощи имеющихся в настоящее время способов очистки BBC (например, очисткой центрифугированием в градиенте плотности сахарозы) обычно вызывает затруднения. Например, применение доступных в настоящее время способов очистки обычно приводит к обратному отношению между чистотой и количеством (процентным выходом) получаемых образцов BBC, что усложняет получение достаточных количеств очищенного BBC. Кроме того, при использовании современных процессов с применением биореакторов, увеличение концентраций клеток и увеличение продолжительности культивирования приводит к более высоким титрам BBC с одновременным увеличением концентраций загрязняющих клеточных осколков и органических составляющих в жидкости биореактора, что еще более затрудняет очистку BBC.

С 1964 года стандартным способом очистки вирусов (включая очистку BBC) является ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы (Yamada et al., 2003 BioTechniques, 34(5): 1074-1078, 1080; Brown et al., 1967 J. Immun, 99(1):171-7; Robinson et al., 1965 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 54(1):137-44; Nishimura et al., 1964 Japan. J. Med. Sci. Biol., 17(6): 295-305). Тем не менее, по мере увеличения концентрации вируса, увеличивается концентрация загрязняющих остатков клеток и, кроме того, также появляются ДНК и белки клеток-хозяев, удаление которых при более высоких их концентрациях с использованием ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы достаточно затруднительно. Кроме того, адаптация способа ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы для крупномасштабного применения обходится недешево. При высоких концентрациях загрязняющих веществ концентрирование и очистка BBC способом осаждения полиэтиленгликолем (ПЭГ) (McSharry et al., 1970 Virol., 40(3):745-6) создает аналогичные проблемы.

Вирус относительно высокого качества был получен при помощи гель-хроматографии (Transfiguracion et al., 2003 Human Gene Ther., 4(12):1139-1153; Vellekamp, et al., 2001 Human Gene Ther., 12(15): 1923-36; Rabotti et al., 1971; Comptes Rendus des Seances de I'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles, 272(2):343-6; Jacoli et al., 1968 Biochim. Biophys. Acta, GenI Subj., 165(2):99-302). Тем не менее себестоимость этого способа и трудности при его осуществлении делают его непригодным для крупномасштабного получения вирусов. Для очистки вирусов иногда применяют аффинную хроматографию, например, с гепарином (Zolotukhin et al., 1999 Gene Ther., 6(6):973-985), лектином (Kaarsnaes et al., 1983 J. Chromatog., 266:643-9; Kristiansen et al., 1976 Prot. Biol. Fluids, 23:663-5) и Matrex(Cellufine(сульфатом (Downing et al., 1992 J. Virol. Meth., 38(2):215-228). Гепарин и пектин не являются предпочтительными лигандами (или не используются) при получении цГМФ-вирусов (cGMP-viruses) из-за возможных проблем с их вымыванием, из-за которых перед выпуском продукта обычно следует проводить дополнительные испытания.

Очистка способом аффинной хроматографии с использованием Matrex(Cellufine(сульфата не является однозначным решением и требует учета эффективности очистки вируса, качества вируса и регенерации колонки. Для очистки BBC нужны очень большие колонки, предназначенные для проведения аффинной хроматографии (например, 0,2 л Matrex(Cellufine(сульфатной смолы на 1 литр клеточной культуры; неопубликованные результаты Wyeth Vaccine). Низкий выход вируса был получен при очистке, как только способом ионообменной хроматографии, так и при ее сочетании с другими типами хроматографической очистки, применяемыми для очистки вирусов (Международная заявка на патент No. WO 2006/011580; Specht et al., 2004 Biotech. Bioeng., 88(4):465-173; Yamada et al., 2003, cited above; Vellekamp et al., 2001 cited above; Zolotukhin et al., 1999, указанные выше; (Международная заявка на патент No. WO 1997/06243; Kaarsnaes et al., 1983, указанные выше).

Таким образом, в данной области техники имеется настоятельная необходимость разработки способов очистки, при помощи которых можно получать BBC необходимой чистоты с необходимой степенью извлечения (выходом).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Способы и композиции, рассматриваемые в настоящем описании, в целом относятся к области вирусологии, микробиологии, иммунологии и технологических разработок. В частности, описаны новые способы очистки, предназначенные для получения вируса везикулярного стоматита (BBC) повышенной степени чистоты и с высоким выходом.

В одном своем аспекте настоящее изобретение относится к способу очистки BBC из жидкости клеточной культуры, полученной из культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, включающему следующие стадии: (а) первичное осветление, (b) вторичное осветление, (с) адсорбцию на анионообменной мембране, (d) проточную фильтрацию вдоль направления потока и (е) фильтрацию. В одном примере реализации стадия (а) включает осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования с получением BBC в надосадочной жидкости. В еще одном примере реализации стадия (b) включает фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, с получением BBC в отфильтрованном растворе. В другом примере реализации стадия (с) включает загрузку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, элюирование BBC из анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором и сбор элюированных фракций, содержащих BBC. В еще одном примере реализации стадия (d) включает очистку выделенного BBC посредством проточной фильтрации вдоль направления потока (ПФ, tangential flow filtration (TFF)) с использованием мембраны из полого волокна, предел пропускания по молекулярной массе которого составляет от 300 килодальтон до 1000 килодальтон (кДа), и получение BBC в концентрате. В одном примере реализации стадия (е) включает фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе.

В некоторых примерах реализации клетки культуры клеток млекопитающего выбирают из эмбриональных клеток почки человека (human embryonic kidney (HEK)), клеток HEK 293, клеток яичников Китайского хомячка (Chinese hamster ovary (CHO)), клеток почки новорожденных хомячков (baby hamster kidney (BHK)) и клеток почки Африканской зеленой мартышки (African green monkey kidney (AGMK)), также известных под названием клеток Vero.

В некоторых примерах реализации операцию низкоскоростного центрифугирования в указанном способе очистки проводят при ускорении от 4400×g до 8000×g. В одном из конкретных примеров реализации операцию низкоскоростного центрифугирования проводят при ускорении 6238×g.

В другом примере реализации фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм представляет собой фильтровальное устройство Millipore Millex®-GV, фильтровальное устройство Millipore Millex®-GP, фильтровальное устройство Pall Supor®, фильтровальное устройство Sartorius SartobranTM или фильтровальное устройство Sartorius SartoporeTM 2. В одном из конкретных примеров реализации фильтр представляет собой фильтровальное устройство Sartorius SartobranTM с отверстиями размером 0,2 мкм.

В других примерах реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Sartorius SartobindTM Q или мембранный адсорбер Pall MustangTM Q. В одном из конкретных примеров реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Pall MustangTM Q.

В некоторых других примерах реализации соль в первом буферном солевом растворе, используемом на стадии (с), представляет собой NaCl или KCl. В другом примере реализации ионная сила NaCl или KCl составляет от 0,1 М до 0,4 М. В одном из конкретных примеров реализации соль представляет собой NaCl, и ионная сила NaCl составляет 0,3 М.

В другом примере реализации соль во втором буферном солевом растворе, используемом на стадии (с), представляет собой NaCl или KCl. В одном из конкретных примеров реализации соль во втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет от 0,5 М до 0,75 М.

В другом конкретном примере реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,6 М. В некоторых других примерах реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,75 М. В некоторых других примерах реализации скорость расхода второго буферного солевого раствора при элюировании составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту. В других примерах реализации расход при элюировании составляет 20 ОК/минуту.

В некоторых других примерах реализации ионную силу NaCl во втором буферном солевом растворе линейно увеличивают от 0,001 М до 0,75 М при скорости расхода при элюировании, составляющей от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту. В одном из конкретных примеров реализации линейный градиент скорости расхода при элюировании составляет 20 ОК/минуту.

В некоторых других примерах реализации pKa первого и второго буферных растворов, применяемых на стадии (с), составляет от 6,0 до 8,5. В некоторых других примерах реализации pH первого буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет от 6,5 до 8,0. В одном из конкретных примеров реализации pH первого буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет 7,5. В других примерах реализации, pH второго буферного солевого раствора, применяемого на стадии (с), составляет от 6,5 до 8,0. В одном из конкретных примеров реализации, pH второго буферного солевого раствора равно 7,5.

В некоторых примерах реализации первый и второй буферные растворы, применяемые на стадии (с), представляют собой фосфатные буферы, буферы, на основе N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновой кислоты (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометана (TRIS). В другом примере реализации указанные первый и второй буферные солевые растворы, применяемые на стадии (с), также содержат сахарозу в концентрации от 1,5% до 5%. В одном из конкретных примеров реализации концентрация сахарозы составляет 2%.

В других примерах реализации предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет 300 кДа. В некоторых других примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет 750 кДа. В некоторых других примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе материала мембраны при ПФ составляет по меньшей мере 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 850, 900, 950 или 1000 кДа. В одном из конкретных примеров реализации мембрана ПФ представляет собой мембранный модуль из полого волокна. В другом примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного на стадии (с), по меньшей мере в 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере однократной замены буфера. В еще одном примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного на стадии (с), проводимое по меньшей мере 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере пяти операций замены буфера. В одном из конкретных примеров реализации буферный раствор, применяемый для замены буфера, представляет собой фосфатный буфер, буфер, содержащий HEPES, или буфер, содержащий TRIS, причем концентрация указанного буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, а pH составляет 7,2 до 7,5. В другом примере реализации буфер, применяемый для замены буфера, также содержит от 0,10 М до 0,20 М NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.

В других примерах реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при комнатной температуре; при этом комнатную температуру определяют как значение или значения температуры, составляющее или находящиеся в диапазоне от приблизительно 15°С до приблизительно 25°С. В одном из конкретных примеров реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при 20°С.

В еще одном примере реализации осветление культуральной жидкости клеточной культуры, проводимое на стадии (а), осуществляют при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, и из стадии (а) исключают проведение операцию низкоскоростного центрифугирования. В конкретных примерах реализации модуль объемного фильтрования представляет собой модуль Whatman® PolycapTM HD, модуль Sartorius Sartoclear™ P или модуль Millipore® Millistak+®HC.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, из культуры клеток млекопитающего получают BBC повышенной степени чистоты. В некоторых примерах реализации очищенный BBC по меньшей мере на 90,0% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В других примерах реализации, очищенный BBC по меньшей мере на 99,0% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В одном из конкретных примеров реализации очищенный BBC по меньшей мере на 99,8% освобожден от загрязняющих его белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры.

В соответствии с некоторыми другими примерами реализации получают BBC повышенной степени чистоты, который очищают и выделяют в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании. В некоторых примерах реализации, очищенный BBC имеет одну или несколько из перечисленных ниже характеристик: выбранный серотип или сочетание серотипов BBC; геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну мутацию или по меньшей мере две мутации, которые ослабляют патогенные свойства BBC, геномную последовательность, которая содержит последовательность, содержащую открытую рамку считывания (ОРС) чужеродной полинуклеотидной последовательности, кодирующую один или несколько различных белков (терапевтических или иммуногенных), более подробно раскрытую в подробном описании настоящего изобретения.

Другие особенности или преимущества рассматриваемых в настоящем описании композиций и способов более подробно изложены в нижеследующем подробном описании и более очевидны при рассмотрении предпочтительных примеров реализации и Формулы изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг.1 изображена блок-схема способа очистки (обведенная черными рамками), применяемого для получения BBC повышенной чистоты из культуральной жидкости культуры клеток млекопитающего.

На Фиг.2А изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи окрашивания серебром, после очистки на мембранном адсорбере Mustang™ Q в присутствии 2% сахарозы, добавленной в буфер для элюирования (10 мМ фосфата натрия, 1,0 М NaCl). Дорожки 1-10 представляют собой следующее: (1) перед центрифугированием (клеточная культура), (2) загрузка, (3) элюирование и промывка, (4) 5%-ный буфер В (фракции 1-5), (5) 60%-ный буфер В (фракции 6-7), (6) 60%-ный буфер В (фракции 8-10), (7) 60%-ный буфер В (фракции 11-25), (8) 100%-ный буфер В (фракции 26-35), (9) регенерация колонки и (10) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™. Скорость потока для модуля Mustang™ Q составлял 3,5 мл/минуту с линейным градиентом элюирования. Анализ SDS-PAGE проводили при помощи 4-20%-ного Трис-глицинового геля; детектирование белков проводили при помощи окрашивания серебром.

На Фиг.2В изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи вестерн-блоттинга (Western blot), в соответствии с описанием Фиг.2А. Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-BBC политональных антител.

На Фиг.3А изображен электрофорез на геле, показывающий разделение белков BBC при помощи окрашивания серебром и вестерн-блоттинга после очистки на мембранном адсорбере Mustang™ Q без добавления сахарозы в буфер для элюирования (10 мМ фосфата натрия, 1,0 М NaCl). Дорожки 1-9 представляют собой следующее: (1) загрузка, (2) элюирование и промывка, (3) 5%-ный буфер В (фракции 1-5), (4) 60%-ный буфер В (фракции 6-11), (5) 60%-ный буфер В (фракции 12-25), (6) 100%-ный буфер В (фракции 26-35), (7) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (8) проведение стандартизации BBC (т.е. BBC, очищенного способом с градиентом плотности сахарозы) и (9) получение объединенной среды после регенерации колонки. Скорость потока для модуля Mustang™ Q составлял 3,5 мл/минуту при ступенчатом градиенте элюирования. Анализ SDS-PAGE проводили при помощи 4-20%-ного геля с Трис-глициновым буфером; детектирование белков проводили при помощи окрашивания серебром.

На Фиг.3В изображен гель-электрофорез, показывающий разделение белков BBC при помощи вестерн-блоттинга после очистки, описанной для Фиг.3А. Вестерн-блоттинг проводили с использованием анти-BBC поликлональных антител. Буфер В (также называемый «буфером для элюирования») содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 1 М NaCl.

На Фиг.4А представлен SDS-PAGE анализ (4-20%-ный гель с Трис-глициновым буфером) BBC, проводимый при помощи окрашивания серебром + коллоидного окрашивания (colloidal staining) на каждой стадии способа очистки, показанного на Фиг.1. Дорожки 1-12 представляют собой следующее: (1) перед центрифугированием, (2) после центрифугирования (1° осветления), (3) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр, (4) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (2° осветления), (5) объединенная среда после прохождения и промывки мембранного адсорбера Mustang™ Q, (6) объединенные фракции после элюирования BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q, (7) концентрат BBC, полученный после ПФ ультрафильтрации/диафильтрации, (8) объединенная среда после концентрирования и диафильтрации, (9) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр (конечным), (10) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (конечного) (общий концентрат очищенного BBC), (11) стандартизации проведение Bio-Rad® Precision Plus Protein™ и (12) контроль BBC (серия #3, очищенный общий концентрат).

На Фиг.4В представлен SDS-PAGE анализ (4-20%-ный Трис-глициновый гель) BBC при помощи вестерн-блоттинга в соответствии с методикой, описанной для Фиг.4А.

На Фиг.5А представлен SDS-PAGE (4-20% Трис-глициновый гель) сравнение BBC, очищенного при помощи окрашивания серебром + коллоидного окрашивания, описанного в пояснениях к Фиг.1, с BBC, очищенным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (дорожка 11). Дорожки 1-12 представляют собой следующее: (1) культуральная жидкость клеточной культуры, (2) после центрифугирования (осветление 1°), (3) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр, (4) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (осветление 2°), (5) объединенная среда после прохождения и промывки мембранного адсорбера Mustang™ Q, (6) объединенные фракции после элюирования BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q, (7) концентрат BBC, полученный после ПФ ультрафильтрации/диафильтрации, (8) перед фильтрованием через 0,2-мкм фильтр (конечным), (9) после фильтрования через 0,2-мкм фильтр (конечного) (общий концентрат очищенного BBC), (10) проведение стандартизации Bio-Rad® Precision Plus Protein™, (11) BBC, очищенный центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (добавляли лишь половину объема от объема дорожки 9) и (12) контроль BBC (серия #1, очищенный общий концентрат).

На Фиг.5В представлено SDS-PAGE (4-20% Трис-глициновый гель) сравнение BBC, очищенного при помощи Вестерн-блоттинга в соответствии с методикой, описанной для Фиг.1, с BBC, очищенным центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (дорожка 11), в соответствии с пояснением к Фиг.5А.

На Фиг.6 приведена гистограмма, показывающая процентный титр выхода BBC, полученный в четырех экспериментальных сериях адаптации методики к крупномасштабному применению (объем клеточной культуры 4,5 л). CR #1 представляет собой экспериментальную Серию 1, CR #2 представляет собой экспериментальную Серию 2, CR #3 представляет собой экспериментальную Серию 3 и ТТ 01 представляет собой экспериментальную Серию 4.

На Фиг.7 приведена гистограмма, показывающая удаление загрязняющих белков в операции очистки при помощи MustangTM Q для конструкции BBCINN4CT1-gag1.

На Фиг.8А изображена гистограмма, показывающая получение BBCNJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ (триметиламиноэтиловая смола) при pH 6,5.

На Фиг.8В изображена гистограмма, показывающая получение BBCNJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ при pH 7,0.

На Фиг.8С изображена гистограмма, показывающая получение BBCNJN4CT1-gag1 при скрининге в ТМАЕ при pH 7,5.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Из-за того, что вирус везикулярного стоматита (BBC) имеет множество характеристик, которые делают привлекательным его применение в качестве вектора в описанных выше иммуногенных композициях и/или для доставки генов, кодирующих терапевтические белки, в данной области техники имеется потребность в разработке способов очистки, при помощи которых из культур клеток млекопитающих можно получать рекомбинантный BBC повышенной степени чистоты. Указанную потребность удовлетворяют композиции и способы, раскрытые в настоящем описании. В нижеследующих Примерах 3-8 описаны усовершенствованные способы очистки и выделения BBC из культуры клеток млекопитающих (см., например, Фиг.1) и BBC, очищенный при помощи таких способов.

I. Получение BBC в культуре клеток млекопитающих

Процедура получения BBC в культуре клеток млекопитающих хорошо известна специалистам в данной области техники, и она обычно включает заражение клеточной культуры (клетки-хозяина) рекомбинантным BBC, культивирование BBC в клеточной культуре и сбор клеточной культуры в подходящий момент. Поскольку BBC выделяется из клеток-хозяев в среду, получаемый BBC собирают в жидкости клеточной культуры.

В способе приготовления BBC из культуры клеток млекопитающего и, следовательно, в новых способах выделения BBC из этой культуры применяют подходящие культуры клеток млекопитающего, используемые для размножения (или роста) BBC (вирус с несегментированной антисмысловой одноцепочечной PHK), известные в данной области техники. Неограничивающие примеры таких клеточных культур включают эмбриональные клетки почки человека (HEK), клетки HEK 293, клетки почки Африканской зеленой мартышки (AGMK), например клетки Vero, клетки яичников Китайского хомячка (СНО) и клетки почки новорожденных хомячков (BHK).

Кроме того, материалы клеточных культур, способы и методики известны специалистам в данной области техники. Например, исходный материал рекомбинантного BBC (например, «спасенный» BBC, см. ниже раздел II) применяют для заражения популяции монослоя клеток-хозяев или популяции клеток-хозяев, имеющей определенную плотность (например, культуры клеток Vero) в биореакторе при заданной множественности заражения; BBC культивируют в клеточной культуре в течение заданного времени и при заданной температуре, и образующееся потомство BBC собирают в составе культуральной жидкости клеток. Как указано далее, термины «культуральная жидкость», «жидкость клеточной культуры», «среда для клеточной культуры», «среда» и/или «жидкость из биореактора» взаимозаменяемы и относятся к среде или раствору, в котором культивируют клеточную культуру.

II. Очистка (получение) BBC из культуры клеток млекопитающих

Рассматриваемые в настоящем описании новые способы получения BBC из культуральной жидкости культуры клеток млекопитающих, зараженных BBC, включают несколько операций очистки. На блок-схеме, показанной на Фиг.1, представлена общая схема способа, который включает следующие операции: (а) первичное осветление, (b) вторичное осветление, (с) адсорбцию на анионообменной мембране, (d) проточную фильтрацию вдоль направления потока и (е) фильтрование. Более конкретно, указанные операции включают (а) осветление жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования, (b) дальнейшее осветление надосадочной жидкости, полученной после центрифугирования, фильтрованием через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, (с) очистку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, в анионообменном мембранном адсорбере, (d) замену буфера и концентрирование BBC при помощи проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) и (е) конечное фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм. В некоторых других примерах реализации стадии очистки (а)-(е) осуществляют при комнатной температуре. Как указано выше, «комнатная температура» означает температуру или температуры, составляющие или находящиеся в диапазоне от приблизительно 15°C до приблизительно 25°C. Таким образом, например, подходящая температура проведения операций (а)-(е) включает температуру, составляющую по меньшей мере 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 и включая 25°C, или дробные значения температуры, находящиеся между указанными значениями. В одном из конкретных примеров реализации, операции очистки (а)-(е) проводят при 20°С.

(а) Первичное осветление

В некоторых примерах реализации, культуральную жидкость культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, осветляют при помощи низкоскоростного центрифугирования (или, в альтернативном случае, объемным фильтрованием), и BBC получают в надосадочной жидкости - в настоящем описании эту операцию также называют «первичным (или 1°) осветлением» жидкости клеточной культуры. В некоторых примерах реализации, первичное осветление жидкости клеточной культуры проводят при комнатной температуре.

Способы и оборудование для центрифугирования, применяемые для первичного осветления жидкости клеточной культуры, хорошо известны специалистам в данной области техники. Ниже указано, что «низкоскоростное» центрифугирование представляет собой центрифугирование со скоростью менее 10000 об/мин. В некоторых примерах реализации, скорость низкоскоростного центрифугирования, которое применяют для осветления жидкости клеточной культуры, составляет скорость центрифугирования, находящуюся в диапазоне от 4000×g(±100×g) до 8000×g(±100×g). В других примерах реализации скорость низкоскоростного центрифугирования, применяемого для осветления жидкости клеточной культуры, представляет собой скорость центрифугирования, составляющую по меньшей мере 4000×g, 4500×g, 5000×g, 5500×g, 6000×g, 6500×g, 7000×g, 7500×g или 8000×g или любое количество об./мин, лежащее в указанных диапазонах. В одном из конкретных примеров реализации первичное осветление жидкости клеточной культуры низкоскоростным центрифугированием производят при 6238×g в течение 30 минут при комнатной температуре (Пример 3, Таблица 2).

Как указано выше, в некоторых примерах реализации, культуральную жидкость культуры клеток млекопитающего, зараженных BBC, в альтернативном случае осветляют (1°) объемным фильтрованием (вместо низкоскоростного центрифугирования). Объемное фильтрование может быть использовано, если на стадии (а) первичного осветления не применяют низкоскоростное центрифугирование. Объемное фильтрование (в отличие от поверхностного фильтрования) обычно проводят при помощи «толстых» фильтров, которые иммобилизуют загрязнения внутри своей структуры. Материалы и способы объемного фильтрования хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, материал фильтра обычно представляет собой толстую структуру из целлюлозного волокна, заполненного неорганическими фильтрующими добавками, например частицами диатомитовой земли (кизельгура), заполняющими отверстия волокон. Такой материал фильтра имеет большую площадь внутренней поверхности, которая является фактором, определяющим характеристики улавливания частиц и фильтрации. Диаметры пор указанных модулей для объемного фильтрования равны по размеру или находятся в диапазоне от 1,0 мкм до 4,5 мкм, включая размеры отверстий, составляющие по меньшей мере 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 и 4,5 мкм, а также дробные значения, находящиеся между указанными величинами. Неограничивающие примеры модулей, применяемых для объемного фильтрования, включают модули Whatman® Polycap™ HD (Whatman Inc.; Florham Park, NJ), модули Sartorius Sartoclear™ P (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и модули Millipore® Millistak+® HC (Millipore; Billerica, MA). В одном из конкретных примеров реализации культуральную жидкость очищают при помощи объемного фильтрования (проводимого при комнатной температуре) и BBC получают в составе фильтрата (Пример 3, Таблица 1).

(b) Вторичное осветление

После первичного осветления, проводимого посредством центрифугирования (или объемного фильтрования), жидкость, содержащую BBC (или фильтрат), осветляют далее (2°) при помощи фильтрования или микрофильтрации через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,25 мкм, и BBC извлекают в отфильтрованный раствор. В одном из конкретных примеров реализации, микрофильтрацию производят при комнатной температуре, как указано выше. Средства для фильтрования/микрофильтрации изготавливают из различных материалов, и они доступны в различном исполнении и известны специалистам в данной области техники. Неограничивающие примеры установок для микрофильтрации включают установки для фильтрования Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA), установки для фильтрования Millipore Millex®-GP, установки для фильтрования Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), установки для фильтрования Sartorius Sartobran™ (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и установки для фильтрования Sartorius SartoporeTM 2. В некоторых примерах реализации размеры отверстий фильтров указанных установок для фильтрования составляют от 0,2 до 0,45 мкм. Размеры пор указанных установок для фильтрования составляют по меньшей мере 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4 и 0,45 мкм, а также дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации фильтр представляет собой установку для фильтрования Sartorius SartobranTM с размером отверстий, равным 0,2 мкм. Отфильтрованный BBC получают в отфильтрованном растворе.

(с) Адсорбция на анионообменной мембране

После проведения осветления продукта BBC (т.е. стадий осветления 1° и 2°, описанных выше), BBC далее очищают в анионообменном мембранном адсорбере. Материалы, применяемые в мембранных адсорберах, хорошо известны специалистам в данной области техники и поставляются такими производителями, как Sartorius Corp. (Edgewood, NY), Pall Corp. (East Hills, NY) и Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, МО). Неограничивающие примеры анионообменных мембранных адсорберов включают мембранный адсорбер SartobindTM Q (Sartorius Corp.) и мембранный адсорбер Mustang™ Q (Pall Corp.). В одном из конкретных примеров реализации анионообменный мембранный адсорбер представляет собой мембранный адсорбер Pall Mustang™ Q. В общем случае, в мембранной адсорбционной хроматографии могут быть непосредственно использованы способы и буферные растворы, применяемые для традиционной ионообменной хроматографии, которые известны специалистам в данной области техники. В некоторых примерах реализации анионообменную мембранную адсорбционную хроматографию проводят при комнатной температуре, как указано выше.

Таким образом, в некоторых примерах реализации, BBC очищают в анионообменном мембранном адсорбере, в котором отфильтрованный раствор BBC, получаемый после вторичного осветления, загружают в анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором (также называемым «уравновешивающим буфером» или «буфером, связывающим BBC»). BBC элюируют с анионообменного мембранного адсорбера с помощью второго буферного солевого раствора («буфером элюирования») с получением фракций, которые содержат BBC (например, см. нижеследующий Пример 6).

В некоторых примерах реализации первый буферный солевой раствор или равновесный буфер представляет собой солевой раствор NaCl или KCl. NaCl или KCl присутствуют в растворе в концентрации, создающей ионную силу, значения которой составляют приблизительно от по меньшей мере 0,1 М до приблизительно 0,4 М. Таким образом, значения ионной силы раствора составляют по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М, включая дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации, соль представляет собой NaCl, а ионная сила раствора NaCl составляет 0,3 М. Буферный раствор может представлять собой фосфатный буфер, буфер, который содержит N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), или буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS). В некоторых примерах реализации pH указанных буферных растворов составляет приблизительно от 6,0 до 8,0, т.е. значения pH составляют по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 и 8,0 или значения pH, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации значение pH первого буферного солевого раствора составляет 7,5. В некоторых других примерах реализации значение pKa первого буферного раствора при проведении адсорбции на анионообменной мембране составляет от 6,0 до 8,5, т.е. значение pKa составляет по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 и 8,5 или равно значениям pKa, лежащим между указанными значениями.

В конкретных примерах реализации, равновесный буфер также содержит приблизительно от 1% сахарозы до 5% сахарозы. В некоторых примерах реализации, равновесный буфер содержит приблизительно 1% сахарозы. В одном из конкретных примеров реализации, концентрация сахарозы составляет 2%. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 3% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 4% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 5% сахарозы. Тем не менее могут быть использованы и другие значения концентрации сахарозы, находящиеся между указанными целыми значениями.

Второй буферный солевой раствор («буфер элюирования») также может содержать те же буферные компоненты, что и первый (равновесный) буфер. В некоторых примерах реализации второй буферный солевой раствор или буфер элюирования представляет собой солевой раствор NaCl или KCl. В одном из конкретных примеров реализации соль, находящаяся во втором буферном солевом растворе, представляет собой NaCl. NaCl или KCl присутствуют в растворе в концентрации, создающей ионную силу, значения которой составляют приблизительно от по меньшей мере 0,1 М и приблизительно до 0,4 М. Таким образом, значения ионной силы раствора составляют по меньшей мере 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4 М, включая дробные значения, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации соль представляет собой NaCl, а ионная сила раствора NaCl составляет 0,3 М. Буферный раствор может представлять собой фосфатный буфер, буфер, который содержит N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES), или буфер, который содержит трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS). В некоторых примерах реализации значение pH указанных буферных растворов составляет приблизительно от 6,0 до 8,0, т.е. значения pH составляют по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 и 8,0 или значения pH, находящиеся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации, значение pH второго буферного солевого раствора составляет 7,5. В некоторых других примерах реализации, значение pKa второго буферного раствора при проведении адсорбции на анионообменной мембране составляет от 6,0 до 8,5, т.е. значение pKa составляет по меньшей мере 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2, 8,4 и 8,5 или равно значениям pKa, лежащим между указанными значениями.

В конкретных примерах реализации, буфер элюирования также содержит приблизительно от 1% сахарозы до 5% сахарозы. В некоторых примерах реализации буфер элюирования содержит приблизительно 1% сахарозы. В одном из конкретных примеров реализации концентрация сахарозы составляет 2%. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 3% сахарозы.

В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 4% сахарозы. В другом примере реализации буфер содержит приблизительно 5% сахарозы. Тем не менее могут быть использованы и другие значения концентрации сахарозы, находящиеся между указанными целыми значениями.

Для элюирования BBC из мембраны, концентрацию соли (NaCl или KCl) (ионную силу) в буфере элюирования повышают в соответствии с линейным градиентом или в соответствии с одностадийным способом элюирования (Пример 6). Обе операции одинаково эффективны для элюирования BBC из анионообменного мембранного адсорбера. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет от 0,5 М до 0,75 М. В одном из конкретных примеров реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,6 М. В некоторых других примерах реализации ионная сила NaCl во втором буферном солевом растворе составляет 0,75 М.

В других примерах реализации расход второго буферного солевого раствора при элюировании составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту. Таким образом, в некоторых примерах реализации, расход при элюировании составляет по меньшей мере от 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 до 30 ОК/минуту, или равен дробному значению, находящемуся между указанными величинами. В одном из конкретных примеров реализации расход при элюировании составляет 20 ОК/минуту.

В других примерах реализации, ионную силу NaCl во втором буферном солевом растворе линейно увеличивают от 0,001 М до 0,75 М при расходе элюирования, составляющем от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту, описанном выше. В одном из конкретных примеров реализации, линейный градиент расхода при элюировании составляет 20 ОК/минуту.

(d) Проточная фильтрация вдоль направления потока (ПФ)

После очистки BBC анионообменной мембранной адсорбционной 30 хроматографией BBC далее очищают способом проточной фильтрации вдоль направления потока (ПФ). В общем случае, ПФ представляет собой процесс, протекающий в результате увеличения давления, при котором для разделения компонентов, находящихся в жидком растворе (или суспензии), применяют мембрану (мембраны), и в котором жидкость (поток) перекачивают тангенциально вдоль поверхности мембраны, а прикладываемое давление служит для проталкивания «части» потока через мембрану в сторону фильтрата (через мембраны). В некоторых примерах реализации ПФ проводят при комнатной температуре. При проведении этого способа происходит замена буфера и концентрирование BBC. В одном из примеров реализации ПФ включает по меньшей мере 5-кратное концентрирование BBC, полученного при проведении операции анионообменной мембранной адсорбции с последующей по меньшей мере однократной заменой буфера. В другом примере реализации ПФ включает концентрирование BBC, полученного при проведении операции анионообменной мембранной адсорбции, по меньшей мере от 5 до 10 раз с последующим проведением по меньшей мере пяти или по меньшей мере шести замен буфера. Некоторые другие примеры реализации включают по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять, или по меньшей мере шесть замен буфера, проводимых после концентрирования BBC, полученного при проведении операции анионообменной мембранной адсорбции.

Материалы (например, полое волокно, спирально намотанное, плоская пластина) и способы проведения ПФ (например, ультрафильтрация (UF), диафильтрация (DF), микрофильтрация) хорошо известны специалистам в данной области техники. В некоторых примерах реализации, предел пропускания по молекулярной массе мембраны для ПФ составляет 300 кДа. В некоторых других примерах реализации предел пропускания по молекулярной массе мембраны для ПФ составляет 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650 или 700 кДа. В еще одном примере реализации предел пропускания по молекулярной массе мембраны для ПФ составляет 750 кДа. В одном из примеров реализации мембрана для ПФ представляет собой мембранный модуль из полого волокна.

В одном из конкретных примеров реализации буфер, применяемый для замены буфера в ПФ, представляет собой фосфатный буфер, буфер, который содержит HEPES, или буфер, который содержит TRIS, описанные выше. Тем не менее в некоторых примерах реализации концентрация буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, включая концентрации, составляющие по меньшей мере 5 мМ, 6 мМ, 7 мМ, 8 мМ, 9 мМ, 10 мМ, 11 мМ, 12 мМ, 13 мМ, 14 мМ и 15 мМ, а также включая значения концентрации, выраженные в мМ, находящиеся между указанными значениями. В некоторых примерах реализации значение pH буфера составляет приблизительно от 7,2 до 7,5. Так, в одном из примеров реализации значение pH буфера составляет 7,2, 7,3, 7,4 или 7,5 или равно дробным значениям pH, находящимся между указанными значениями. В другом примере реализации, буфер, применяемый для замены буфера, также содержит от 0,10 М до 0,20 М NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.

В одном из конкретных примеров реализации (см. Пример 7), фракции BBC, получаемые при проведении анионообменной мембранной адсорбционной очистки, объединяют, и объединенный раствор концентрируют и осуществляют замену буфера помощи ПФ, используя мембранный картридж для ПФ, изготовленный из полого волокна, предел пропускания по молекулярной массе которого составляет 750 кДа (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.; Piscataway, NJ).

(e) Фильтрование

Последняя технологическая операция очистки представляет собой конечную микрофильтрацию концентрата BBC, полученного при ПФ, включающую фильтрование концентрата через фильтр с размером отверстий от 0,2 до 0,25 мкм, описанный выше для операции вторичного осветления путем проведения микрофильтрации, и также описанный ниже в Примере 7. Например, подобная фильтрационная установка может включать фильтр с размером отверстий, равным 0,20, 0,21, 0,22, 0,23, 0,24 или 0,25 мкм или равным дробным значениям, находящимся между указанными значениями.

Очистка BBC в соответствии с рассматриваемыми в настоящем описании новыми способами, подробно описана в нижеследующих Примерах; описание включает первичное (Пример 3) и вторичное (Пример 4) осветление культуральной жидкости, включающее низкоскоростное центрифугирование (или объемное фильтрование) и фильтрование через фильтр с размером отверстий, равным 0,2-0,45 мкм, соответственно.

После проведения операций осветления, BBC далее очищают, последовательно проводя очистку в анионообменном мембранном адсорбере (Пример 6); проточную фильтрацию вдоль направления потока; ультрафильтрацию и диафильтрацию (Пример 7), и фильтрование через фильтр с размером отверстий, равным 0,2-0,22 мкм (Пример 7). Кроме того, в соответствии с рассматриваемыми способами, были проведены четыре крупномасштабных очистки (4,5 л) партии клеточной культуры BBC (для адаптации способа к крупномасштабному производству) (Пример 8), в которых при очистке извлекали более 99,9% и 99,8% белковых загрязнений (Таблица 11) и ДНК (Таблица 13), соответственно.

III. Рекомбинантный вирус везикулярного стоматита

В соответствии с настоящим описанием, BBC повышенной степени чистоты может быть получен из культуры клеток млекопитающего при использовании новых способов очистки, раскрытых в настоящем описании. Под «повышенной степенью чистоты» следует понимать, что очищенный BBC по меньшей мере на 90,0% освобожден от загрязняющих белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В других примерах реализации очищенный BBC по меньшей мере на 99,0% освобожден от загрязняющих белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры. В одном из конкретных примеров реализации, очищенный BBC по меньшей мере на 99,8% освобожден от загрязняющих белков и нуклеиновых кислот клеточной культуры.

В конкретных примерах реализации вирус везикулярного стоматита (BBC), выделяемый из культуральной жидкости клеточной культуры млекопитающего при помощи вышеописанного способа, представляет собой рекомбинантный или генетически модифицированный BBC. Способы получения рекомбинантных РНК, вирусов, например BBC, хорошо известны в данной области техники и называются способами «спасения» или «обратной генетики». Неограничивающие примеры способов спасения BBC включают способы, описанные в патенте США 6033886 и патенте США 6168943, каждый из которых полностью включен в настоящее описание по ссылке. Другие методики спасения вирусов, например BBC, описаны в патенте США 6673572 и международной заявке WO 2004/113517, которые полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

BBC повышенной степени чистоты, который очищают и выделяют в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании, может представлять собой BBC конкретного серотипа. В некоторых примерах реализации, очищенный BBC представляет собой серотип Indiana, серотип New Jersey, серотип San Juan, серотип Isfahan, серотип Glasgow или серотип Chandipura. В некоторых примерах реализации BBC может содержать последовательность из более одного указанного серотипа.

Векторы BBC (и включающие его иммуногенные композиции), очищенные в соответствии с новыми способами очистки, раскрытыми в настоящем описании, часто содержат одну или несколько ослабляющих мутаций, находящихся в геноме BBC. В некоторых примерах реализации очищенный BBC имеет геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере одну мутацию, которая ослабляет патогенное действие BBC. В других примерах реализации, очищенный BBC имеет геномную последовательность, которая содержит по меньшей мере две мутации, которые ослабляют патогенное действие BBC. Например, ослабленный BBC содержит две или более известные ослабляющие мутации, например мутации, описанные в Международной патентной заявке No. PCT/US2005/011499 (Международная заявка на патент No. WO 2005/098009), полностью включенной в настоящее описание посредством ссылки. Так, неограничивающие примеры известных ослабляющих мутаций BBC включают мутации перетасовки генов (gene shuffling, включая перетасовку генов BBC, образующих BBC геном и обозначаемых буквами N, P, M, G и L), инсерционные мутации в G-белке, мутации, укорачивающие G-белок, мутации, чувствительные к температуре (и другие точечные мутации), нецитопатические мутации М-гена, мутации G-ствола, мутации «двусмысленной» РНК (ambisense RNA mutations) и мутации, приводящие к делеции гена, каждая из которых описана в Международной патентной заявке No. WO 2005/098009. Так, в некоторых примерах реализации, очищенный BBC содержит одну или несколько ослабляющих мутаций, неограничивающие примеры которых включают мутацию, чувствительную к температуре, точечную мутацию, мутацию перетасовки генов, мутацию G-ствола, нецитопатическую мутацию М-гена, мутацию «двусмысленной» РНК, мутацию, укорачивающую G-белок, инсерционную мутацию G-белка и мутацию, приводящую к делеции гена.

В некоторых примерах реализации, BBC, очищенный в соответствии со способами очистки, раскрытыми в настоящем описании, имеет геномную последовательность, которая содержит одну или несколько чужеродных или гетерологических (или чужеродных) полинуклеотидных последовательностей, например открытую рамку считывания (open reading frame (ORF)) чужеродных РНК. Гетерологические полинуклеотидные последовательности могут быть при необходимости изменены, и их неограничивающие примеры включают ген, кодирующий цитокин (например, интерлейкин), ген, кодирующий антигенную детерминанту Т-клетки-хелпера (хелперную детерминанту), ген, кодирующий антигенную детерминанту CTL, ген, кодирующий адъювант, и ген, кодирующий кофактор, ген, кодирующий рестрикционный маркер, ген, кодирующий терапевтический белок или белок другого микробного патогена (например, вируса, бактерии, паразита или грибка), в особенности белки, способные вызывать желаемую иммунную реакцию. Например, гетерологические полинуклеотидные последовательности, кодирующие белок иного микробного патогена, могут представлять собой один или несколько следующих генов: ген вируса ВИЧ, ген вируса Т-клеточного лейкоза человека (human T cell leukemia virus), ген обезьяньего вируса иммунодефицита (Simian Immunodeficiency Virus), ген вируса RSV (Respiratory Syncytial Virus), ген вируса PIV (Parainfluenza Virus), ген вируса простого герпеса (HSV), ген цитомегаловируса (CMV), ген вируса Эпштейна-Барра, ген вируса Варицелла-Зостер, ген вируса эпидемического паротита, ген вируса кори, ген вируса гриппа, ген полиовируса, ген риновируса, ген вируса гепатита А, ген вируса гепатита В, ген вируса гепатита С, ген вируса Norwalk, ген тогавируса, ген альфавируса, ген вируса краснухи, ген вируса бешенства, ген вируса Марбурга, ген вируса Эбола, ген вируса папилломы, ген вируса полиомы, ген метапневмовируса, ген коронавируса, ген Vibrio cholerae, ген Streptococcus pneumoniae, ген Streptococcus pyogenes, ген Helicobacter pylori, ген Streptococcus agalactiae, ген Neisseria meningitidis, ген Neisseria gonorrheae, ген Corynebacteria diphtheriae, ген Clostridium tetani, ген Bordetelta pertussis, ген Haemophilus, ген Chlamydia и ген Escherichia coll. В некоторых примерах реализации очищенный BBC содержит последовательность гена ВИЧ, причем указанную последовательность ВИЧ выбирают из группы, состоящей из последовательностей генов gag, env, pol, vif, nef, tat, vpr, rev или vpu. В одном из конкретных примеров реализации ген ВИЧ представляет собой ген gag или env.

В некоторых примерах реализации, очищенный BBC содержит и по меньшей мере одну ослабляющую мутацию, и по меньшей мере одну гетерологическую открытую рамку считывания, описанную выше. Например, иммуногенные композиции содержат BBC (т.е. VSVINN4CT9-gag-1), очищенный в соответствии с новыми способами, примеры которых даны в нижеследующем Разделе V (Примеры 2-8), представляет собой рекомбинантный BBC, включающий две ослабляющие мутации и открытую рамку считывания, кодирующую белок gag ВИЧ-1.

В других примерах реализации BBC, очищенный в соответствии с новыми рассмотренными в настоящем описании способами, кодирует ген gag ВИЧ, причем ген gag введен в последовательность генома BBC в положении один (3'-gag1-NPMGL-5'), положении два (3'-N-gag2-PMGL-5'), положении три (3'-NP-gag3-MGL-5'), положении четыре (3'-NPM-gag4-GL-5'), положении пять (3'-NPMG-gag5-L-5') или положении шесть (3'-NPMGL-gag6-5'). В других примерах реализации BBC, очищенный в соответствии с новыми способами, раскрытыми в настоящем описании, кодирует ген env ВИЧ, причем ген env введен в последовательность генома BBC в положении один (3'-env1-NPMGL-5'), положении два (3'-N-env2-PMGL-5'), положении три (3'-NP-env3-MGL-5'), положении четыре (3'-NPM-env4-GL-5'), положении пять (3'-NPMG-env5-L-5') или положении шесть (3'-NPMGL-env6-5').

На основании вышеизложенного, специалист в данной области техники должен понимать, что в соответствии со способами и методиками, предлагаемыми в настоящем описании, могут быть очищены различные виды рекомбинантных BBC.

IV. Иммуногенные и фармацевтические композиции

В некоторых примерах реализации иммуногенные композиции содержат иммуногенную дозу генетически модифицированного BBC, очищенного в соответствии со способами очистки, представленными в настоящем описании. Например, в некоторых примерах реализации, иммуногенная композиция содержит рекомбинантный BBC, очищенный в соответствии со способами очистки, представленными в настоящем описании, причем указанный BBC содержит одну или несколько последовательностей чужеродных РНК, введенных или замещающих участок генома BBC, несущественный для репликации. К указанным иммуногенным композициям могут быть применены любые примеры реализации рекомбинантного BBC, описанные в вышеизложенном Разделе III. Так, в некоторых примерах реализации, иммуногенную композицию, которая содержит очищенный BBC, готовят для введения млекопитающему пациенту (например, человеку).

Такие композиции обычно содержат очищенный вектор BBC и фармацевтически приемлемый носитель. В соответствии с настоящим описанием, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые вещества, изотонические вещества и вещества с отложенным всасыванием, а также подобные им добавки, совместимые с фармацевтическим введением. Применение таких сред и веществ к фармацевтически активным веществам хорошо известно в данной области техники. За исключением любой традиционной среды или традиционного вещества, несовместимого с вектором BBC, остальные среды могут быть использованы для приготовления иммуногенных композиций, рассматриваемых в настоящем описании. В композиции также могут быть введены дополнительные активные соединения.

Таким образом, рецептура рассматриваемой в настоящем описании иммуногенной композиции должна быть совместима с предполагаемым способом введения этой композиции. Примеры способов введения включают: парентеральный (например, внутривенный, внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный) и мукозальный (например, пероральный, перректальный, интраназальный, буккальный, вагинальный, респираторный) способы введения. Растворы или суспензии, применяемые для парентерального, внутрикожного или подкожного введения, включают следующие компоненты: стерильный разбавитель, например воду для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные вещества, например бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, например аскорбиновую кислоту или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, например этилендиаминтетрауксусную кислоту; буферы, например ацетаты, цитраты или фосфаты, и вещества, регулирующие тоничность, например хлорид натрия или декстрозу. Значение pH регулируют добавлением оснований или кислот, например гидроксида натрия или соляной кислоты. Парентеральные препараты могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных дозировок, изготовленные из стекла или пластика.

Фармацевтические композиции, пригодные для инъекционного применения, включают стерильные водные растворы (если вещества являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки, применяемые для приготовления стерильных водных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) или фосфатно-солевой буферный раствор (phosphate buffered saline (PBS)). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и достаточно текучей, чтобы ее можно было вводить через шприц. Она должна быть стабильна в условиях изготовления и хранения, и, кроме того, композиция должна быть защищена от загрязнения микроорганизмами, например бактериями и грибками. Носитель представляет собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и подобные им вещества) и подходящие смеси указанных веществ. Достаточную текучесть обеспечивают, например, при помощи покрытий, например из лецитина, которые в случае дисперсии позволяют сохранять желаемый размер частиц, и посредством использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение воздействия микроорганизмов осуществляют путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых веществ, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты и подобных им соединений. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические добавки, например сахара, полиспирты, например маннит, сорбит, и хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъецируемых композиций обеспечивают за счет включения в композицию добавки, замедляющей всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъецируемые композиции готовят введением требуемого количества (или дозы) вектора BBC, находящегося в подходящем растворителе, при необходимости - в одном из сочетаний ингредиентов, перечисленных выше, с проведение последующей фильтровальной стерилизацией. Обычно дисперсии готовят введением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты, выбираемые из перечисленных выше. В случае использования стерильных порошков, применяемых для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительно способы их приготовления включают вакуумную сушку и лиофилизацию, при которых порошок активного ингредиента и любого необходимого дополнительного ингредиента получают из предварительно приготовленного раствора указанных ингредиентов, прошедшего фильтровальную стерилизацию.

При введении способом ингаляции, соединения вводят в форме аэрозольных спреев из контейнера или распылительного устройства, находящегося под давлением, которое содержит подходящий газ-вытеснитель (например, такой газ как диоксид углерода или распылитель). Системное введение также может быть осуществлено при помощи мукозальных или трансдермальных средств. Для мукозального или трансдермального введения в состав включают проникающее вещество, пригодное для проникновения через конкретный барьер. Указанные проникающие вещества известны в данной области техники и в случае мукозального введения включают, например, детергенты, соли желчной кислоты и производные фусидовой кислоты. Для трансдермального введения используют назальные спреи или суппозитории. Соединения также готовят в виде суппозиториев (например, на традиционных основах, применяемых для приготовления суппозиториев, таких как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм, применяемых для перректального введения.

В некоторых примерах реализации, для облегчения введения и равномерного распределения дозировок, композиции, предназначенные для перорального или парентерального введения, удобно приготавливать в виде стандартных лекарственных форм. В соответствии с настоящим описанием стандартной лекарственной формой называются физически дискретные единицы, пригодные для введения в качестве одноразовых доз пациенту, подвергаемому лечению; каждая такая форма содержит заранее определенное количество активного компонента, в соответствии с предварительными расчетами позволяющее получать желаемый терапевтический эффект, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Указанные в настоящем описании технические требования к стандартным лекарственным формам продиктованы и непосредственно определяются уникальными характеристиками активного соединения и особым достигаемым терапевтическим эффектом, а также ограничениями, налагаемыми в соответствии с правилами данной области техники на приготовления подобных активных соединений, предназначенных для лечения индивидуальных пациентов.

ПРИМЕРЫ

Нижеследующие примеры выполнены при помощи стандартных методик, хорошо известных и не вызывающих затруднений у специалистов в данной области техники; исключения подробно рассмотрены в настоящем описании. Нижеследующие примеры даны лишь с целью иллюстрации изобретения и никоим образом не ограничивают область применения композиций и способов, раскрытых в настоящем описании. Примеры 1 и 2 относятся ко всем трем рассматриваемым конструкциям BBC (VSV). Примеры 3-9 относятся только к конструкции VSVIN N4CT9-gag1. Примеры 10-11 относятся только к конструкции VSVIN N4CT1-gag1. Пример 12 относится только к конструкции VSVNJ N4CT1-gag1.

Рекомбинантный BBC (серотип Indiana; rVSVIN), очищаемый в соответствии со следующими примерами, содержит ген ВИЧ gag в первой позиции генома BBC (gag1) и ген N, перетасованный в четвертое положение генома BBC (N4). В одной из конструкций BBC содержит ген G, имеющий усеченный цитоплазматический конец ("СТ9"); такая конструкция обозначена как "VSVIN N4CT9-gag1". В другой конструкции BBC содержит ген G, имеющий усеченный цитоплазматический конец ("CT1"); такая конструкция обозначена как "VSVIN N4CT1-gag1". В других примерах рекомбинантный BBC (серотип New Jersey; rVSVNJ), очищаемый в соответствии со следующими примерами, содержит ген ВИЧ gag в первой позиции генома BBC (gag1), ген N, перемещенный в четвертое положение генома BBC (N4), и ген G, имеющий усеченный цитоплазматический конец ("CT1"); такая конструкция обозначена как "VSVNJ N4CT1-gag1". Указанные конструкции и мутации подробно описаны в Международной патентной заявке No. WO 2005/098009, полностью включенной в настоящее описание по ссылке.

Тем не менее рассматриваемые в настоящем описании новые способы очистки не ограничены конкретной конструкцией рекомбинантного BBC или конкретными серотипами (например, Indiana, New Jersey и т.д.), и, как таковые, эти способы очистки включают очистку конструкций BBC, включающих геномные последовательности «дикого» типа, ослабленные геномные последовательности, последовательности«чужеродных» нуклеиновых кислот или любые другие сочетания перечисленных комбинаций (для обзора таких конструкций BBC см. Раздел III выше). Кроме того, способы получения рекомбинантных РНК вирусов хорошо известны и называются «спасением» или способами «обратной генетики». Примеры способов спасения рекомбинантного BBC описаны выше в Разделе III.

В следующих примерах описана очистка pBBC (рекомбинантного BBC) (на примерах конструкций VSVIN N4CT9-gag1, VSVIN N4CT1-gag1 или VSVNJN4CT1-gag1) из клеток Vero. Тем не менее описанные способы очистки BBC также могут быть применены для очистки BBC из любой подходящей культуры клеток млекопитающего, неограничивающие примеры которых включают эмбриональные клетки почечки человека (human embryonic kidney (HEK)) (например, клетки HEK 293), клетки яичников Китайского хомячка (Chinese hamster ovary (CHO)) и клетки почечки новорожденного хомячка (baby hamster kidney (BHK)).

ПРИМЕР 1: Анализы белков, ДНК и эффективности BBC

Для оценки способов очистки, описанных ниже в Примерах 2-12, применяли следующие аналитические методики.

Общая концентрация белков. Общую концентрацию белков определяли, используя анализ в присутствии бицинхониновой кислоты (БЦК) (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA), применяя в качестве стандарта белка бычий сывороточный альбумин (БСА).

SDS-PAGE и вестерн-блоттинг анализ. Для отделения и определения белков образцы BBC смешивали с три-глициновым буфером для образцов в отношении 1:1 (для конструкции VSVIN N4CT9-gag1) или 3:1 (для конструкции VSVIN N4CT1-gag1), кипятили в течение 10 минут при 100°С и разделяли при помощи электрофореза на полиакриламидном геле, содержащем 4-20% трис-глицин-додецилсульфата натрия (Tris-glycine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)), с последующим двойным окрашиванием серебряным красителем (Wako Chemicals USA, Inc.; Richmond, VA) и коллоидным красителем Coomassie® Blue (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). Чувствительность двойного окрашивания позволяла легко обнаруживать высокомолекулярные примеси в образцах BBC.

После электрофореза на геле, белки переносили электрофоретическим способом на мембрану из нитроцеллюлозы (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ). После блокировки, производимой в течение одного часа в солевом буферном растворе TRIS (трис-буферный солевой раствор; ТБС), содержащем 3% БСА, мембрану инкубировали в растворе антител (1% БСА в ТБС, содержащем 0,05% Tween-20 (ТТБС) и содержащем анти-BBC поликлональные антитела кролика, полученные из клеток ВНК, 1:1000 об./об.), и инкубировали с антителом козы против кролика, связанным с пероксидазой хрена (HRP, 1:1000 (об./об.)) (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA). После промывания ТТБС и ТБС, для определения добавили реактив, проявляющие окраску HRP (Bio-Rad Laboratories Inc.; Hercules, CA), и реакцию потушили дистиллированной водой. Окрашенный гель и проявленную мембрану фиксировали при помощи системы формирования изображений Alphalmager® (Alpha Innotech Corp.; San Leandro, CA), снабженной программным обеспечением AlphaEaseFC® software.

Эксклюзионная жидкостная хроматозрафия высокого разрешения для разделения по размерам (ЭЖХВР). Для быстрого отделения BBC от загрязняющих белков был разработан протокол эксклюзионной ЖХВР, позволяющий проводить качественный анализ способа очистки BBC. Таким образом, образцы BBC, находящиеся в процессе обработки (100 мкл) and purified bulk concentrate BBC (100 мкл), и очищенный общий концентрат BBC (100 мкл) загружали в аналитическую эксклюзионную колонку для разделения по размерам (колонка TSK-Gel PW G6000PWXL, размер частиц 17 микрон, размер пор 1000 Ангстрем) (Tosho Biosciences LLC; Montgomeryville, PA), уравновешенную фосфатным солевым буфером (без Ca2+ или Mg2+), и проявляли при скорости элюирования, равной 1 мл в минуту. Система работала при помощи системы подачи растворителя Agilent 1100™, управляемой программным обеспечением ChemStationTM (Agilent Technologies Inc.; Palo Alto, CA). Регистрацию УФ-спектров производили при помощи фотодиодного детектора, а хроматограммы получали, регистрируя поглощение УФ-света при 215 нм.

Анализ эффективности BBC. Эффективность BBC оценивали двумя разными способами: традиционным анализом бляшкообразования и иммунофлуоресцентным анализом бляшкообразования. Для проведения традиционного анализа бляшкообразования, клетки Vero, помещенные в DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)+10% телячьей сыворотки крови, высевали в 6-луночные планшеты при концентрации 1×106 клеток/лунка (и 2 мл клеточной культуры на лунку) и инкубировали в течение ночи при 37°С. Клетки проверяли на следующие сутки, чтобы убедиться в образовании сливающихся монослоев. Образцы вируса с неизвестным титром, а также образцы положительного и отрицательного контроля серийно разбавляли в отношении 1:10 следующей средой: DMEM+10 мл/л натриевой соли пировиноградной кислоты + 0,5 мл/л гентамицина (Gentamicin) до получения желаемых значений титра. Образцы положительного контроля представляли собой стандарты BBC с известным титром. Образцы отрицательного контроля (или слепые опыты) содержали только среду. Клеточную среду отсасывали с 6-луночных планшетов, затем в лунки добавляли разбавленный вирус (0,5 мл раствора вируса в лунку), в двух экземплярах. Вирус подвергали адсорбции при комнатной температуре в течение пятнадцати минут, затем инкубировали при 32°С в течение тридцати минут. Планшеты встряхивали вручную каждые 5-10 минут для поддержания монослои клеток во влажном состоянии. Для получения покровного агарового слоя объединяли агарозу (при 50°С) и DMEM (при 37°С, 10 мл/л натриевой соли пировиноградной кислоты + 0,5 мл/л гентамицина) в отношении 1:4. Вирус отсасывали с планшетов, и при помощи пипетки-ретранслятора наносили 3 мл на лунку покровного слоя. Покрытые планшеты охлаждали в вытяжном шкафу при комнатной температуре, затем переносили для инкубации при 32°С в течение 72 часов или до тех пор, пока не образуются ясно видимые бляшки (приблизительно диаметром 1 мм или более). Бляшки пересчитывали, направляя на планшеты свет от источников света. Исходя из подсчитанного количества бляшек, определяли титр каждого образца, который выражали в бляшкообразующих единицах (БОЕ) (plaque forming units (PFU)) на мл.

Анализ второго типа (иммунофлуоресцентный анализ бляшкообразования) проводили BBC заражением монослоев клеток Vero (на 48-луночных планшетах). Спустя двадцать четыре или тридцать шесть часов, клетки Vero фиксировали и сначала, в зависимости от используемой конструкции, производили пробу на VSVIN или VSVNJ с моноклональным антителом, а затем пробу со вторичным антителом, связанным с флуоресцентным красителем. Для определения флуоресцирующих очагов внутри монослоя клеток Vero, инфекционные частицы пересчитывали при помощи флуоресцентной микроскопии. Затем пересчитывали флуоресцирующие очаги, и титр образца выражали в инфекционных единицах (ИЕ) (infectious units (IU)) или бляшкообразующих единицах (БОЕ).

Анализ остаточных ДНК. Количественное и качественное определение ДНК клеток-хозяев проводили с использованием набора для микроанализа PicoGreen® Quant-iT™ DNA (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA). Микроанализ проводили в соответствии с инструкциями производителя, используя в качестве стандарта лямбда-ДНК.

ПРИМЕР 2: Получение BBC в культуре клеток Vero

Экспериментальные партии BBC получали в биореакторе емкостью 10 литров, используя культуры клеток Vero (почечные клетки Африканской мартышки) на микроносителях. Применяемые клетки Vero были предоставлены клеточным банком cGMP Master Cell Bank. Клетки Vero выращивали на микроносителях Cytodex™ I (Amersham Biosciences Corp.; Piscataway, NJ) при плотности 7,5 граммов сухих гранул на литр. Рабочий объем культуры в биореакторе составлял от 5,5 до 6,5 литров. Для инокуляции клетки Vero соединяли с микроносителями CytodexTM I при общем объеме, равном приблизительно 2 литра. Целевая плотность высева культуры составляла 5×105 клеток/мл. Для прикрепления клеток к микроносителям производили переменное циклическое перемешивание в течение 2 часов в указанном сниженном объеме. Культуру перемешивали в течение 5 минут при 40 об/мин, а затем оставляли осаждаться при 0 об/мин в течение четырех полных циклов.

После циклического перемешивания отбирали образцы культуры, и, если прикрепление было удовлетворительным, к культуре добавляли бессывороточную среду для выращивания вируса (Virus Production Serum-Free Medium (VP-SFM)) до получения рабочего объема, равного от 5,5 до 6,5 литров. Клетки выращивали при 2-4×106 клеток/мл при 37°С и 40 об/мин. К покровному слою постоянно подводили воздух со скоростью 50 см3/мин. Кислород и диоксид углерода подводили к покровному слою при необходимости, со скоростью 50 см3/мин. Если объем кислорода, требуемый для развития культуры, превышал объем, поставляемый покровным слоем, кислород вводили в культуру через металлокерамический барботер (scintered sparger) при начальной скорости 6 см3/мин. Скорость повышали вручную по мере увеличения потребности в кислороде. Для контроля pH, значения которого для культуры устанавливали равным 7,30, применяли диоксид углерода (кислоту) и 7,5% (масс./об.) бикарбонат натрия (основание). Свежую культуральную среду в количестве половины исходного объема вливали в культуру каждые сутки, начиная приблизительно спустя 48 часов после начала культивирования. Инфицирование клеток Vero рекомбинантным BBC производили при 32°С при множественности заражения (М3), равной 0,01. Для усиления адсорбции вируса на клетках, сразу после добавления вируса в культуру биореактора производили одночасовой цикл переменного перемешивания. Культуру перемешивали в течение 6 минут при 40 об/мин, а затем оставляли осаждаться в течение 24 часов при 0 об/мин в течение двух полных циклов. После одночасового переменного перемешивания остальной цикл инфицирования проводили в периодическом режиме при 40 об/мин. Для определения цитопатического эффекта (ЦПЭ) образцы инфицированной культуры отбирали каждые 6-16 часов, считали клетки и собирали образцы вирусной жидкости над клетками для определения кинетики роста.

Клеточную культуру собирали спустя приблизительно 44 часа после инфицирования в случае VSVINN4CT9-gag1, спустя приблизительно 48 часов после инфицирования в случае VSVINN4CT1-gag1 и спустя приблизительно 60 часов после инфицирования в случае VSVNJN4CT1-gag1, путем самопроизвольного осаждения микроносителей и сбора культуральной надосадочной жидкости. Для конструкции VSVNJN4CT1-gag1 объединяли жидкость, полученную из двух биореакторов.

ПРИМЕР 3: Способ очистки BBC: Первичное осветление культуральной жидкости, содержащей BBC, для VSVINN4CT9-gag1

После отбора клеточной культуры из биореактора клетки/осколки клеток и другие порошкообразные примеси удаляли способом, известным как «извлечение продукта». Так как BBC выделялся из клеток Vero в культуральную жидкость, BBC получали в осветленной культуральной жидкости. Таким образом, культуральную жидкость, содержащую BBC и находящуюся над осадком (например, приблизительно 4,0-4,5 л из 10-литровой загрузки биореактора), осветляли либо объемным фильтрованием, либо низкоскоростным центрифугированием.

Осветление объемным фильтрованием производили при комнатной температуре, и BBC получали в фильтрате. Проводили испытания следующих модулей для объемного фильтрования: модуля Whatman® Polycap™ HD (Whatman Inc.; Florham Park, NJ), модуля Sartorius Sartoclear™ P (Sartorius Corp.; Edgewood, NY), модуля Millipore® Millistak+® HC (Millipore; Billerica, MA) и модуля CUNO 05/60HP (CUNO Inc., a 3M® company, Meriden, CT). Объемные фильтры загружали фильтратом до полного насыщения фильтра (приблизительно 100-500 мл фильтрата).

Осветляющую эффективность модулей для объемного фильтрования определяли при помощи нефелометра, а количество полученного вируса определяли при помощи анализа бляшкообразования. Характеристики различных фильтров указаны в Таблице 1.

Высокий выход вируса может быть достигнут при использовании модуля Whatman Polycap HD 75. Тем не менее при крупномасштабном производстве наблюдали низкую эффективность удаления мутности и низкую фильтрующую способность. Другие фильтры, поставляемые другими производителями, могут быть подобраны и использованы в указанных способах осветления на основании оценки выхода вирусного продукта при использовании конкретного фильтра.

Таблица 1
Показатели осветления клеточной культуры при использовании различных объемных фильтров
Фильтры Мутность фильтрата1 Удаление мутности Эффективность фильтра2 Полученный титр
Millipore Co НС 1,24 96,3% >6,5 4,4%
Sartorius Sartoclear™ P (1,5 мкм) 4,0 94,0% >8,0 19,3%
Sartorius Sartoclear™ P 7,0 89,6% >8,7 8,4%
(4,0 мкм)
Whatman® Polycap™ HD 13,8 79,4% 1,25 82,0%
CUNO 05/60HP 6,4 96,9% 9,0 33,9%
CUNO 05/60HP 6,7 85,4% >32 41,1%
Мутность фильтрата1 = НЕМ (нефелометрическая единица мутности)
Эффективность фильтра2 = (литры культуры/фут2)

Осветление при помощи низкоскоростного центрифугирования производили при 6238×g (5000 об/мин) в течение тридцати минут при комнатной температуре на центрифуге Beckman (5×1 л сосудов для центрифугирования общим объемом 4,5 л); BBC получали в надосадочной жидкости. Как видно из нижеследующей Таблицы 2, низкоскоростное центрифугирование позволяет достичь большего удаления мутности при эквивалентной степени извлечения по сравнению с объемным фильтрованием при помощи модуля Whatman PolyCapTM HD75.

Таблица 2
Сравнение первичного осветления жидкости клеточной культуры посредством низкоскоростного центрифугирования и объемного фильтрования
Способ осветления Мутность1 Удаление мутности Полученный титр
Центрифугирование
Экспериментальная партия 1
8,45 74,4% 67,8%
Whatman PolyCap™ HD75
Экспериментальная партия 1
18,13 45,5% 66,6%
Центрифугирование
Экспериментальная партия 2
9,03 86,5% 55,7%
Whatman PolyCap™ HD75
Экспериментальная партия 2
13,8 79,4% 82,0%
Центрифугирование 10,13 77,6% 68,3%
Экспериментальная партия 3
Центрифугирование 10,80 85,5% 77,0%
Экспериментальная партия 4
Мутность1 = Мутность фильтрата или надосадочной жидкости, НЕМ

ПРИМЕР 4: Способ очистки BBC: Вторичное осветление культуральной жидкости, содержащей BBC

После выполнения первичного осветления, описанного в Примере 3, надосадочную жидкость (или фильтрат) обрабатывали далее (вторичное осветление) с целью понижения уровня мутности. Испытывали несколько фильтров для микрофильтрации (от 0,2 до 0,25 мкм) (Таблица 3), которые включали фильтровальную установку Millipore Millex®-GV (Millipore; Billerica, MA), фильтровальную установку Millipore Millex®-GP, фильтровальную установку Pall Supor® (Pall Corp.; East Hills, NY), фильтровальную установку Sartorius SartobranTM (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и фильтровальную установку Sartorius SartoporeTM 2. Оптимальный фильтр должен ограниченно связывать или вовсе не связывать BBC, но при этом по возможности полно удалять порошкообразные загрязнения.

Для загрузки в выбранные фильтры для микрофильтрации использовали BBC, полученный до высевания (исходный материал), в который добавляли 1 (глутамат-фосфат сахарозы (ГФС) (sucrose phosphate glutamate (SPG)). Тот же загрузочный материал фильтровали в соответствии с инструкциями, полученными от производителей. Так как количество осветляемого материала клеточной культуры было ограничено, вместо фильтра с высокой производительностью использовали шприц-фильтр или дисковый фильтр. Как показано в Таблице 3, наибольший выход титра BBC получали на стерильных фильтрах Pall Supor® и Sartorius Sartobran™.

Таблица 3
Вторичное осветление - испытание фильтров
Фильтровальная установка Выход*
Millipore Millex®-GV 66,13%
Millipore Millex®-GP 87,08%
Pall Acrodic™ Supor™ 96,08%
Sartorius Sartobran™ 94,61%
Sartorius Sartobran™ 2 82,84%
Выход*: к загрузочному раствору добавляли 1×ГФС раствор. ГФС=глутамат-фосфат сахарозы.

Далее оценивали вторичное осветление BBC, производимое при помощи фильтровальной установки Sartorius Sartobran™; результаты представлены в Таблице 4.

Таблица 4
Вторичное осветление с использованием фильтра Sartobran™
Фильтрование Sartobran™ Мутность раствора1 Удаление мутности Полученный титр
Эксперимент 1 0,62* 50,8% 65,8%
Эксперимент 2 (масс./1×ГФС) 4,45 НД 85,9%
Эксперимент 3 (масс./1×ГФС) 6,27 54,6% 110,0%
Мутность раствора1=НЕМ
0,62*: низкая мутность фильтрата обусловлена низкой мутностью загрузки
НД = недоступно
ГФС = глутамат-фосфат сахарозы.

Данные Таблицы 4 показывают, что мутность раствора в Эксперименте 2 и Эксперименте 3 была снижена при приемлемом выходе. В этих Экспериментах также было показано, что добавление 1×ГФС к загрузочному раствору (т.е. Эксперимент 2: 85,9% полученного титра и Эксперимент 3: 110% полученного титра) значительно увеличивает выход продукта BBC по сравнению с Экспериментом 1, в котором не добавляли ГФС (65,8% полученного титра).

ПРИМЕР 5: Способ очистки BBC: Хроматография на колонке

После проведения операции вторичного осветления, описанной в Примере 4, очистку фильтрата, содержащего BBC, определяли/сравнивали, используя различные хроматографические смолы. Поскольку размеры BBC превышают размеры загрязняющих белков, испытанию подвергали лишь смолы с большим размером пор, которые включали анионообменную смолу UNOsphere™ Q (Bio-Rad Laboratories Inc.), катионообменную смолу UNOsphere™ S (Bio-Rad Laboratories Inc.), смолу СНТ на основе керамического гидроксиапатита типа I (Bio-Rad Laboratories Inc.), смолу CFT на основе керамического фторапатита типа I (Bio-Rad Laboratories Inc.) и смолу CST I смешанного типа (GE Healthcare). Для сравнения также оценивали две смолы, применяемые в аффинной хроматографии, смолу Matrex™ Cellufine® Sulfate (Millipore) и гепарин-сефарозную смолу (GE Healthcare). Эксперименты проводили в периодическом режиме при комнатной температуре. Образцы, полученные в различных условиях промывки и элюирования, собирали и испытывали при помощи анализа SDS-PAGE и бляшкообразования.

В начальных экспериментах с анионообменной UNOsphere™ Q и катионообменной UNOsphere™ S смолами было показано, что BBC связывается с анионообменной смолой UNOsphere™ Q только при нейтральном pH, что указывает на то, что при нейтральном pH BBC заряжен отрицательно.

Оценка очистки BBC на анионообменной смоле Bio-Rad® UNOsphere™ Q. Очищенный BBC загружали на колонку, содержащую смолу UNOsphere™ Q. На колонке не происходило заметного разделения между продуктом, содержащим BBC, и загрязняющими белками, и большая часть вируса оставалась в связанном состоянии на колонке даже после элюирования 2 М NaCl в 10 мМ буфере, содержащем фосфат натрия (данные не показаны).

Оценка очистки BBC на смоле Bio-Rad® на основе керамического гидроксиапатита типа I (CHT I). BBC эффективно адсорбировался на гидроксиапатитовой колонке. Данные SDS-PAGE (не показаны), указывают на некоторое отделение BBC от загрязняющих белков, но значительная часть BBC оставалась в связанном состоянии на колонке даже после элюирования 0,8 М фосфатом натрия, pH 6,88, после чего связанный BBC был элюирован из колонки при помощи очистки 1 М раствором NaOH.

В другом эксперименте в качестве буфера элюирования использовали 0,9 М раствор фосфата калия. Отделение BBC от загрязняющих белков было незначительным (данные не показаны). Большая часть вируса оставалась в связанном состоянии на колонке, и для элюирования потребовался 1,0 М раствор NaOH. Аналогичные результаты (т.е. плохое отделение от загрязняющих белков и прочное связывание со смолой) наблюдали при использовании смолы на основе керамического фторапатита типа I (CFT) и смолы CST I.

Оценка очистки BBC на смоле для аффинной хроматографии Matrex™ Cellufine® Sulfate. Очищенный раствор, содержащий BBC, загружали на предварительно заполненную равновесным буфером (1,47 мМ фосфат калия, 8,06 мМ фосфат натрия, 140 мМ NaCl, pH 7,0) колонку, заполненную Cellufine™ Sulfate (объем капсулы (ОК)=2 мл) при расходе 3 мл/минута. Колонку промывали 10 OK равновесного буфера, который представлял собой солевой раствор фосфатного буфера (1,47 мМ фосфата калия, 8,06 мМ фосфата натрия, 140 мМ NaCl, pH 7,0). Промывные воды и элюат объединяли. Затем адсорбированные материалы подвергали линейно-градиентному элюированию 30 ОК с до получения 10 мМ фосфата натрия, 1,5 М NaCl, pH 7,0. Анализ SDS-PAGE показал, что разделение между загрязняющими белками и вирусом при элюировании было неэффективным, и BBC обнаружили во всех фракциях элюирования (данные не показаны). Большое количество BBC также оставалось в связанном состоянии на колонке. Общий выход BBC (т.е. из всех собранных фракций элюирования; F3-F25) составил лишь 45,2% (Таблица 5). Аналогичные результаты (т.е. низкий выход BBC) наблюдали при разделении на гепарин-сефарозной смоле.

Таблица 5
Очистка BBC на колонке Matrix Cellufine® Sulfate
Образцы Объем (мл) Титр вируса Полученное количество
(БОЕ/мл) (БОЕ)
Загрузка 22 1,3900×106 3,06×107 -
Элюирование и промывка 32 4,4100×104 1,14×109 4,6%
Ф3-4 4 1,00×104 4,00×104 0,1%
Ф5 2 1,00×105 2,00×105 0,7%
Ф6-9 8 1,00×105 8,00×105 2,6%
Ф10-25 32 4,00×105 1,28×107 41,9%
Итого: 45,2%
Ф3-Ф25 - фракции элюирования 3-25

ПРИМЕР 6: Способ очистки BBC: Анионообменный мембранный адсорбер

Как описано выше в Примере 5, выход BBC оказался относительно низким при очистке фильтрата, получаемого при втором осветлении (т.е. на фильтре Sartobran™ с размером пор 0,2 мкм), на смолах UNOsphere™ Q, UNOsphere™ S, СНТ I, CFT I, CST I, Cellufine® или гепарин-сефарозной смоле. Таким образом, была произведена оценка очистки фильтрата, содержащего BBC и полученного в Примере 4, при помощи двух анионообменных мембранных адсорберов: мембранного адсорбера Sartobind™ Q (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) и мембранного адсорбера Mustang™ Q (Pall Corp.; East Hills, NY).

Очистка BBC в мембранном адсорбере Sartobind™ Q. Загрузка BBC (исходного материала), которую очищали при помощи мембранного адсорбера, представляла собой концентрат, полученный на стадии разделения проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) (с использованием мембраны для ПФ, предел пропускания по молекулярной массе которой составлял 750 кДа). Концентрат BBC, полученный при ПФ разделении (который включал BBC и примеси/загрязняющие белки и ДНК), затем хранили либо при 4°С, либо при -70°С.

Исходные исследования очистки при помощи мембранного адсорбера Sartobind™ Q проводили на концентрате BBC, который хранили при 4°С, при использовании в качестве равновесного буфера 20 мМ HEPES (pH 7,1); концентрат подвергали адсорбции в мембранном адсорбере Sartobind™ Q (объем мембраны 2,1 мл). Белки примеси были эффективно элюированы буфером для элюирования, содержащим 20 мМ HEPES (pH 7,1) и 1,0 М NaCl (данные не показаны). Тем не менее ни в одной из фракций элюирования не был обнаружен титр BBC. Буфер HEPES заменили буфером, содержащим фосфат натрия, но получили аналогичные результаты (т.е. отсутствие титра BBC во всех собранных фракциях), даже при высоких (1,5 М) концентрациях NaCl в фосфатном буфере для элюирования.

Напротив, если в качестве исходного материала использовали концентрат BBC, который хранили при -70°С а затем подвергали адсорбции в мембранном адсорбере Sartobind™ Q (равновесный буфер: 20 мМ HEPES, pH 7,1), то во фракциях элюирования был обнаружен BBC (буфер для элюирования: 20 мМ HEPES и 1,0 М NaCl), в то время как по данным БЦК, 74,2% загрязняющих белков обнаруживали в элюате и в объединенных промывных водах (данные не показаны). Общий массовый баланс белков показан в нижеследующей Таблице 6.

При использовании линейно-градиентного элюирования 30%-ным буфером В для исходного BBC материала, выдержанного при -70°С, на хроматограмме наблюдали два основных пика (данные не показаны). Буфер А (равновесный буфер) содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 0,3 М NaCl. Буфер В (буфер элюирования) содержал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0), 2,0 М NaCl и 10 мМ сахарозы, в то время как 30% В включали приблизительно 0,81 М NaCl.

Первый пик представлял собой BBC (фракции 4-10) относительно высокой чистоты. Второй пик включал ДНК загрязнения клеток-хозяев (фракции 11-20). Результаты анализа PicoGreen® (данные не показаны) указывают на то, что 97,3% остаточных ДНК клеток-хозяев были удалены мембранным адсорбером Sartobind™ Q. Таким образом, полученные данные указывают на то, что мембранный адсорбер Sartobind™ Q обеспечивает эффективное удаление загрязняющих ДНК клеток-хозяев из получаемого BBC. Тем не менее результаты оценки титра BBC (данные не показаны) указывают на то, что выход ВС при очистке в Sartobind™ Q составляет менее 30% титра вируса. Более высокую степень извлечения наблюдали при использовании мембранного адсорбера Mustang™ Q на том же самом исходном материале.

Таблица 6
Общий массовый баланс белков после прохождения мембранного адсорбера Sartobind™ Q
Образцы, отбираемые во время очистки Объем (мл) Общее количество белков Полученное количество
(мг/мл) (мг)
Загрузка 15 115,8 1737 100%
Элюирование и промывка 32,5 39,68 1289,6 74,2%
Ф3 2 3,79 7,58 0,4%
Ф4-5 4 24,86 99,44 5,7%
Ф6-10 10 12,27 122,7 7,1%
Ф11-20 20 6,17 123,4 7,1%
Ф22-24 6 4,27 25,62 1,5%
Ф36 2 0 0 0,0%
Ф37 2 17,86 35,72 2,1%
Ф38-40 6 7,38 44,28 2,5%
Итого: 94,6%
Ф3-Ф40 - фракции элюирования 3-40

Очистка BBC в мембранном адсорбере Mustang™ Q

В качестве средства для очистки BBC также исследовали мембранный адсорбер The Mustang™ Q. Производили оптимизацию для рабочих условий адсорбера Mustang™ Q, которые описаны ниже.

Сахароза увеличивает выход BBC, элюируемого из мембраны Mustang™ Q. Первоначальные наблюдения, проведенные при оптимизации условий очистки в Mustang™ Q, показали важность включения сахарозы в хроматографический буфер. Например, параллельно были проведены эксперименты по очистке с буферами, приготовленными с добавлением сахарозы (Фиг.2А и 2В) и без добавления сахарозы (Фиг.3А и 3В). Применяли следующие хроматографические буферы: буфер А (равновесный буфер) включал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0) и 300 мМ NaCl. Буфер В (буфер элюирования) включал 10 мМ фосфата натрия (pH 7,0), 1 М NaCl, с добавлением и без добавления сахарозы (т.е. +/-2% сахарозы).

В обоих экспериментах (т.е. +/-2% сахарозы) был получен BBC высокой чистоты. Анализ бляшкообразования (данные не показаны) показал, что степень выход BBC был значительно выше (32,8% в сравнении с 19,0%) в том случае, когда буфер содержал сахарозу.

Показатель pH буфера и связывание BBC с мембраной Mustang™ Q. Для определения значения pH, оптимального для связывания BBC с мембраной Mustang™ Q, испытывали три различных буферных значения pH (pH 6,5, 7,0 и 7,5). В этих экспериментах кондиционированная свежая клеточная культура после осветления была загружена на мембрану Mustang™ Q, уравновешенную либо буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия при pH 6,5, буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия при pH 7,0, либо буфером, содержащим 10 мМ фосфата натрия при pH 7,5 (каждый буфер также включал 300 мМ NaCl и 2% сахарозы).

BBC элюировали из мембраны пошаговым элюированием (буфер элюирования: 10 мМ фосфата натрия (pH 6,5, 7,0 или 7,5), 720 мМ NaCl и 2% сахарозы) со скоростью 3,5 мл в минуту (10 ОК/мин). Чистота BBC, элюируемого из Mustang™ Q (определяли при помощи анализа SDS-PAGE и вестерн-блоттинга; данные не показаны), была сравнима для всех значений pH испытуемого буфера. Тем не менее при pH 6,5 значительное количество BBC было обнаружено в прошедшей среде, промывных водах и фракциях элюирования, полученных при хроматографировании, и при указанном pH (см. Таблицу 7) в объединенных фракциях элюирования был обнаружен более низкий титр BBC.

Таблица 7
Получение BBC при различных pH связывания
pH связывания Получение BBC (определение титра)
6,5 15%
7,0 33%
7,5 28%

Ионная сила и связывание BBC с мембраной Mustang™ Q. При адсорбции BBC на мембране Mustang™ Q определяли влияние двух различных концентраций NaCl (0,15 М NaCl и 0,3 М NaCl) в буфере связывания (равновесном), содержащем 10 мМ фосфата натрия. Лучшее разделение между BBC и загрязняющими белками было обнаружено при концентрации NaCl, равной 0,3 М. Например, при использовании 0,3 М NaCl в буфере связывания, содержащем фосфат натрия, высокомолекулярные примеси извлекались в элюат, в то время как BBC оставался на мембране в связанном состоянии (данные не показаны).

Ионная сила и элюирование BBC из мембраны Mustang™ Q. Ионную силу буфера элюирования (буфера В) (т.е. концентрацию NaCl в буфере элюирования) определяли линейно-градиентным элюированием, при котором концентрацию буфера элюирования (буфера В) повышали от 0% до 60% в 30 OK при расходе, равном 3,5 мл/минуту. Равновесный буфер (буфер А) включал 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, и 300 мМ NaCl, а буфер элюирования (буфер В) включал 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, 2 М NaCl и 10 мМ сахарозы. По хроматограмме видно (данные не показаны), что для элюирования 73,3% BBC из мембранного адсорбера Mustang™ Q требуется концентрация NaCl, равная 0,6 М.

Сравнение линейно-градиентного элюирования с одностадийным элюированием. Высококачественный BBC был получен как при линейно-градиентном элюировании (описано выше), так и «одностадийном» элюировании (данные не показаны). Одностадийное элюирование включает использование равновесного буфера (буфера А; например, 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, 300 мМ NaCl) и буфера элюирования (буфера В; например, 10 мМ фосфата натрия, pH 7,1, 2 М NaCl, 10 мМ сахарозы). В отличие от линейно-градиентного элюирования, одностадийное элюирование позволяет вымывать BBC из мембранного адсорбера непосредственно при добавлении буфера В, имеющего конкретную конечную концентрацию соли (например, мгновенным добавлением буфера В, имеющего конкретную конечную концентрацию NaCl, равную 0,6 М). Одностадийное элюирование позволяет удалять более 99% загрязняющих белков (анализ БЦК; данные не показаны), в то время как 70-95% BBC извлекают во фракциях элюирования (анализ бляшкообразования; данные не показаны). Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением будет использовано одностадийное элюирование, поскольку эта простая одностадийная операция позволяет получать BBC с высоким титром.

Рабочий расход элюата. Было исследовано влияние двух различных скоростей элюирования, т.е. 10 объемов капсулы (ОК) в минуту и 20 ОК/минуту. Ни одна из скоростей не влияла на очистку.

Обработка бензоназой®. Нуклеаза Бензоназа® представляет собой эндонуклеазу, полученную способами генной инженерии. Она разрушает все формы ДНК и РНК (однонитевые, двухнитевые, линейные и кольцевые), но не оказывает протеолитического действия. Ее действие эффективно в широком диапазоне условий и имеет высокую специфичность воздействия. Таким образом, нуклеаза Бензоназа® идеальна для проведения удаления нуклеиновых кислот из рекомбинантных продуктов, и ее применение позволяет соблюдать условия загрязнения нуклеиновых кислот, указанные в руководстве Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Federal Drug Administration (FDA)).

В соответствии с настоящим изобретением, было обнаружено, что нуклеаза Бензоназа® значительно снижает концентрацию ДНК при проведении очистки BBC и в готовом объединенном концентрате BBC. Тем не менее добавление нуклеазы Бензоназа® до проведения очистки при помощи мембранного адсорбера Mustang™ Q приводит к снижению титра вируса (данные не показаны). Напротив, обработка нуклеазой Бензоназа® после проведения очистки способом мембранной хроматографии не приводит к таким последствиям (т.е. не снижает титра).

Тем не менее, из-за того, что рассматриваемый в настоящем описании способ очистки BBC (например, см. Фиг.1) позволяет удалять более 99% загрязнений, обусловленных клеточной культурой, концентрации ДНК в готовом очищенном объединенном концентрате BBC оказываются ниже уровней, предусмотренных спецификацией (например, спецификация ВОЗ определяет < 10 нг/доза) даже без обработки нуклеазой Бензоназа®. Таким образом, использование обработки нуклеазой Бензоназа® не обязательно для очистки BBC в соответствии с предлагаемым способом, который предоставляет заметные усовершенствования по сравнению с традиционными способами очистки продуктов, содержащих вирус/вирусные вакцины (которые обязательно включают обработку нуклеазой Бензоназа®).

Связывающая способность Mustang™ Q. Связывающую способность мембранного адсорбера Mustang™ Q определяли на основании проскока BBC через мембранный адсорбер Mustang™ Q малого объема (0,35 мл) (т.е. Mustang™ Q coin). При загрузке и очистке кондиционированной культуральной жидкости в Mustang™ Q coin, в конечном итоге было обнаружено, что проскок BBC не может быть определен, исходя из УФ поглощения, поскольку оно перекрывалось УФ поглощением примесей. Таким образом, в указанном эксперименте, фракции элюата, содержащие BBC, собирали и определяли присутствие BBC при помощи анализа SDS-PAGE и определения титра BBC. Равновесный буфер Mustang™ Q включал 10 мМ HEPES при pH 7,5, 0,3 мМ NaCl и 2% сахарозы.

Неожиданно оказалось, что традиционный хроматографический 1%-ный проскок не происходил (см. нижеследующую Таблицу 8) даже после загрузки 400 мл клеточной культуральной жидкости на Mustang™ Q coin (титр культуральной жидкости BBC составлял 6,9×106/мл). Тем не менее, как показано в Таблице 8, в элюате наблюдали более высокий титр BBC при загрузке в Mustang™ Q coin образца культуральной жидкости объемом 400 мл. Кроме того, при возрастании объема загрузки до 400 мл, дифференциальное давление в мембране возрастало до 1,8 бар (185 кПа). Таким образом, на основании эксперимента можно заключить, что загрузочная емкость фильтра составляет 350 мл на 0,35 мл мембранного адсорбера Mustang™ Q, что эквивалентно 500 мл клеточной культуры/мл мембранного адсорбера. В альтернативном случае, связывающая способность Mustang™ Q может быть представлена в виде 6,9×109 БОЕ/мл мембраны. В трех проверочных экспериментах действительная загрузочная емкость (в единицах титра вируса) оказалась несколько выше указанной связывающей способности, что не влияет на характеристики способа. Таким образом, данные показывают, что оцененная связывающая способность представляет собой консервативный коэффициент загрузки и, как таковая, может быть легко использована при расчете крупномасштабного производства.

Таблица 8
Исследование загрузочной емкости Mustang™ Q
Объем загрузки1 (мл) Титр BBC2 в элюате (БОЕ/мл)
0-200 (Э1) Не определяли
200-300 (Э2) 6,80×103
300-350 (Э3) 8,80×103
350-400 (Э4) 1,30×103
Объем загрузки1 рассчитывали, исходя из объема культуры
Титр BBC2: титр BBC при загрузке составлял 6,9×106/мл;
Объем мембраны фильтра Mustang™ Q составлял 0,35 мл
Э1-Э4 - элюаты 1-4, соответственно

Заключение об эффективности мембранного адсорбера Mustang™ Q. При очистке в мембранном адсорбере Mustang™ Q был получен высококачественный продукт, содержащий BBC. По сравнению с традиционными 20 хроматографическими способами, способ очистки с использованием Mustang™ Q (кроме очевидных преимуществ одностадийности и эффективности) имеет несколько преимуществ. Например, этот способ позволяет получать продукт, содержащий BBC, более высокого качества по сравнению с ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы (например, см. Фиг.6А и 5В). Кроме того, (а) высокая связывающая способность мембранного адсорбера Mustang™ Q позволяет использовать менее крупногабаритное производственное оборудование, что обеспечивает меньшие производственные затраты, (b) более высокая скорость элюирования по сравнению с испытанными выше хроматографическими смолами позволяет увеличить расход и производительность, и (с) использование одноразовых установок, включающих мембранный адсорбер Mustang™ Q, устраняет необходимость проверки чистоты и рабочего состояния оборудования.

Ниже кратко перечислены рабочие условия для Mustang™ Q, обнаруженные при проведении вышеуказанных экспериментов: (а) загрузочная емкость = 0,5 л клеточной культуры на 1 миллилитр объема мембранного адсорбера Mustang™ Q, (b) расход (скорость истечения)=20 объемов капсулы (ОК) в минуту, (с) pH связывания BBC = pH 7,5±0,1 единиц pH, (d) ионная сила связывания BBC = 0,3±0,2 М соли; (е) элюирование BBC = пошаговый градиент через 15 ОК, и (f) ионная сила элюирования BBC = 0,7 М соль.

ПРИМЕР 6: Способ очистки BBC: Проточная фильтрация вдоль направления потока, глубокое фильтрование (polishing), буферный обмен

Концентрирование BBC и буферный обмен производили с использованием системы ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ), обеспечивающей проточную фильтрацию вдоль направления потока (ПФ). Объединенные элюаты BBC, полученные в мембранном адсорбере Mustang™ Q, содержались в буфере, включающем 10 мМ HEPES с высокой концентрацией соли (0,7 М NaCl), которые также содержали следовые количества примесей. Таким образом, для удаления остаточных загрязнений и получения готового продукта, содержащего BBC в подходящем для рецептур буфере, было необходимо провести операцию УФ/ДФ.

Объединенные элюаты из пяти экспериментов, проведенных с использованием Mustang™ Q, объединяли и использовали в следующем эксперименте. Применяли ПФ мембранный картридж из полого волокна площадью 16 см2, предел пропускания по молекулярной массе которого составлял 750 кДа (GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, NJ). Объединенные растворы вначале сконцентрировали до объема 10 мл. Затем произвели пять (5×) обменов буфера на солевой раствор фосфатного буфера (буфер, содержащий 10 мМ фосфата калия (ФСБР) при pH 7,1, и 138 мМ NaCl).

Анализ SDS-PAGE образцов, находящихся в обработке, показал, что BBC присутствовал только в концентрате и промывных водах, и потери BBC в пермеате (фильтрате, который образуется при обратном осмосе) не были обнаружены ни при помощи окрашивания серебром, ни при помощи вестерн-блоттинга (данные не показаны). Данные SDS-PAGE показывают, что выход BBC в указанном способе был приемлемым, и удаление примесей фиксировали после каждой смены буферного раствора (данные не показаны). Для полного удаления примесей требовалось проведение от пяти до шести замен буферного раствора.

Оптимизация рабочих условий УФ/ДФ. Было исследование воздействия состава буферного раствора на характеристики очистки ПФ УФ/ДФ. Во всех экспериментах в качестве загрузки использовали один и тот же объединенный элюат, полученный в Mustang™ Q (Таблица 9). Первые три эксперимента проводили на мембране из полого волокна площадью 16 см2 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), в то время как последний эксперимент производили на мембране площадью 420 см2 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.). Во всех экспериментов качество продукта было аналогичным (на основании анализа SDS-PAGE и Э-ЖХВР).

Таблица 9
Эксперимент, показывающий влияние состава буферного раствора на ПФ
Номер эксперимен
та
Буфер Полученное количество (%)
Эксперимент 1 10 мМ HEPES, 0,15 М NaCl, pH 7,4, 4% сахарозы 100,5
Эксперимент 2 10 мМ NaPi, pH 7,4, 4% сахарозы 88,8
Эксперимент 3 10 мМ NaPi, 0,15 М NaCl, pH 7,4, 4% сахарозы 80,6
Эксперимент 4 ФСБР, pH 7,2, 4% сахарозы 80,0

Вне зависимости от использованного буферного раствора, в пермеате диафильтрации не был обнаружен продукт, содержащий BBC (на основании анализа SDS-PAGE/окрашивания серебром, данные не показаны). Тем не менее анализ общего количества белка и ДНК указывает на то, что приблизительно 34-41% общего количества белка и 33-40% ДНК были удалены в двух первых объемах, применяемых для диафильтрации. В отношении замены буфера, следует сказать, что пять объемов диафильтрации (ОД) были достаточными для снижения проводимости пермеата до удовлетворительного уровня.

Таким образом, были приняты следующие рабочие условия для ПФ УФ/ДФ:

(a) Мембранный картридж для ПФ: картридж ПФ из полого волокна (750 кДа),

(b) Емкость мембраны для ПФ: 95 л клеточной культуры/т2,

(c) Рабочее давление: р1=3-4 фунт/дюйм2 (3-4×6894,757 Па); р2=1-2 фунт/дюйм2 (1-2×6894,757 Па); трансмембранное давление=1,5-2,5 фунт/дюйм2 (1,5-2,5×6894,757 Па),

(d) Рабочая температура: комнатная температура,

(e) Расход поперечного потока: 700 литров/м2·ч,

(f) Расход пермеата: > 30 литров/м2·ч, и

(д) 5× Концентрирование и 6х диафильтрация в ФСБР + 4% сахарозы (10 мМ фосфат калия, 138 мМ NaCl, pH 7,2);

где р1 представляет собой давление на входе и р2 представляет собой давление на выходе.

ПРИМЕР 8: Способ очистки BBC: Окончательное фильтрование

Последней операцией способа очистки BBC было окончательное фильтрование материала, очищенного ПФ, описанной выше. Для удаления возможных биозагрязнений при минимальных потерях BBC использовали фильтровальную установку Sartorius Sartobran™ с размером пор 0,2 мкм (0,45/0,2 мкм) (Sartorius Corp.; Edgewood, NY) при расходе, равном 100 мл в минуту. Буферный раствор включал 10 мМ фосфат калия (pH 7,1-7,3), 138 мМ NaCl и 7,5% сахарозы.

ПРИМЕР 9: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVINN4CT9-gag1

Были проделаны четыре крупномасштабных эксперимента с использованием 4,5 л клеточной культуры. Данные этих крупномасштабных экспериментов указаны ниже в Таблице 10 и Таблице 11 и Фиг.6. Были выполнены анализы SDS-PAGE (данные не показаны), общего белка (Таблица 11), титра вируса (Таблица 10 и Фиг.6) и Э-ЖХВР (данные не показаны). В каждом из крупномасштабных экспериментов, проводимых в соответствии со способом, показанным на Фиг.1, были получены стабильные рабочие характеристики (т.е. качество BBC продукта) и удаление примесей.

Таблица 10
Крупномасштабные эксперименты
Экспери
мент
Загрузка Очищенный объединенный концентрат
Объем (мл) Титр (БОЕ/мл) Объем (мл) Титр (БОЕ/мл)
1 4192 5,60×107 475 2,40×108
2 4392 9,10×07 440 3,40×108
3 4425 5,20×107 475 1,10×108
4 4450 5,01×107 435 2,00×108
Таблица 11
Удаление белковых загрязнений при крупномасштабной очистке BBC
Операция способа Общее удаление белков (%)
Эксперимент 1 Эксперимент 2 Эксперимент 3 Эксперимент 4
Низкоскоростное центрифугирование НО 91,0 73,2 91,5
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр (разбавление) 89,9 75,2 71,3 68,0
Последующее фильтрование через 0,2 мкм фильтр (Sartobran™) 100,6 97,3 102,6 98,1
Mustang™ Q 0,43 0,39 0,33 0,41
УФ/ДФ 42,7 52,0 48,7 47,5
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр 95,7 106,8 104,5 99,4
Последующее фильтрование через 0,2 мкм фильтр (Sartobran™) 87,7 82,7 81,5 93,8
Общее удаление белков (%) НО 99,9 99,9 99,9
НО = не определяли

Анализ способа крупномасштабной очистки BBC

Целью разработки нового способа очистки, рассматриваемого в настоящем описании (например, см. Фиг.1), является получение BBC высокой чистоты с высоким выходом очищенного продукта, содержащего BBC. Ниже дан анализ очистки BBC и его стабильности, приведенный на основании четырех крупномасштабных экспериментов с использованием 4,5 л клеточной культуры.

Анализ SDS-PAGE и удаление загрязняющих белков. Важным аспектом способа очистки было обеднение получаемого BBC загрязняющими белками клеточной культуры (или их удаление). Как указано в Примере 1, приведенный пример конструкции rVSVIN представлял собой конструкцию VSVINN4CT9-gag1. Получаемый BBC отслеживали по присутствию основных белков этого вируса, М (27 кДа), N/P (49 кДа), G (55 кДа) и L (250 кДа). BBC белки М и N/P имели более высокий уровень экспрессии по сравнению с белками G (CTg) и L, и при этом уровень белка L был наиболее низким. Таким образом, полосы белков М и N/P при анализе геля SDS-PAGE были более интенсивными, чем полосы G и L белков. Во всех экспериментах на гель загружали образцы одинаковых объемов (в противном случае это отмечали). Кроме того, вместо способа однократного обнаружения белков, такого как окрашивание серебром или окрашивание Coomassie®, использовали способ двукратного окрашивания серебром/Coomassie® Blue, дающий более точные результаты.

Анализ SDS-PAGE для крупномасштабного эксперимента 4 (Фиг.4А и 4В) показал, что большая часть белков была удалена в первой операции осветления путем низкоскоростного центрифугирования (Фиг.4А, 4В, линии 1 и 2), который позволял удалять осколки клеток. По данным БЦК анализа было удалено 91,5% общего содержания белка; следовательно, низкоскоростное центрифугирование является важной операцией для удаления белковых примесей.

Жидкость, полученную при центрифугировании, разбавляли буфером, содержащим 10 мМ HEPES (pH 7,5 после добавления 1 × глутамат-фосфата сахарозы (ГФС; 7,5% сахарозы, 10 мМ фосфата калия, 5 мМ глутамата)), 0,465 М NaCl и 2% сахарозы (Фиг.4А, 4В, линия 3), при этом из-за разбавления наблюдали более бледную полосу окрашивания. Разбавленный раствор затем прокачивали через фильтр с размерами пор 0,2 мкм для удаления оставшихся порошкообразных загрязнений (в этой операции не производили удаление загрязняющих белков; Фиг.4А, 4В, линия 4). Фильтрат, содержащий BBC, собирали и использовали в качестве загрузки в мембранный адсорбер Mustang™ Q.

В мембранном адсорбере Mustang™ Q производили удаление более 99,5% оставшихся загрязняющих белков (Таблица 11). Определение оставшихся загрязняющих белков производили при помощи анализа SDS-PAGE (Фиг.4А, 4В, линии 4 и 5); при этом из мембраны Mustang™ Q элюировали BBC высокого качества (Фиг.4А, 4В, линия 6).

Элюированный BBC концентрировали и подвергали диафильтрации в буферный раствор ФСБР (+7,5% сахарозы). Более 48% оставшихся загрязняющих белков удаляли при проведении операции УФ/ДФ (Таблица 11), в результате чего наблюдали очень интенсивные полосы белков BBC (Фиг.4А, 4В, линия 7). В объединенном пермеате УФ/ДФ обнаруживали лишь следовые количества загрязняющих белков (Фиг.4А, 4В, линия 8). Как до, так и после конечного фильтрования через фильтр с размером пор 0,2 мкм не наблюдали никаких обнаруживаемых изменений в качестве BBC или профиле загрязняющих белков (Фиг.4А, 4В, линии 9 и 10).

Объединенный очищенный концентрат BBC, полученный в соответствии с предлагаемым способом, также имеет более высокую чистоту и низкий уровень остаточных примесей по сравнению с продуктом, получаемым центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Например, полосы окрашивания белков BBC (М, N, P, G и L), полученного в соответствии с предлагаемым способом (Фиг.5А, 5В, линия 9), более интенсивны, чем полосы окрашивания белков BBC, очищенного центрифугированием в градиенте плотности сахарозы (Фиг.5А, 5В, линия 11) (при менее интенсивных полосах окрашивания загрязняющих белков), что указывает на получение более высококачественного BBC продукта в соответствии с предлагаемым способом очистки, изображенным на Фиг.1. По данным профиля загрязняющих белков и интенсивности полос окрашивании белков BBC, во всех четырех крупномасштабных экспериментах был получен продукт аналогичного качества (данные не показаны).

Эксклюзионная жидкостная хроматография высокого разрешения (Э-ЖХВР). Был разработан анализ Э-ЖХВР для BBC (см., Пример 1), обеспечивающий простой и удобный способ отделения BBC от загрязняющих белков, а также способ количественного анализа очистки BBC. Для защиты колонки на нее загружали только осветленные образцы. BBC вымывают из колонки с получением пика элюирования, имеющего время удержания, равное 7,5 минут (данные не показаны). Пики примесей загрязняющих белков (имеющих большее время удержания в колонке) вымываются из колонки после вывода пика BBC, и, следовательно, их не нужно удалять/извлекать из получаемого BBC. Большую часть примесей извлекали в элюат и промывные воды, получаемые в Mustang™ Q, что подтверждали результаты анализа SDS-PAGE. При проведении операции УФ/ДФ извлекали примеси, связанные с буфером, и в пермеатах не обнаруживали потерь BBC (данные не показаны). После окончательного фильтрования через фильтр с размером пор 0,2 мкм, полученный BBC элюировали из колонки для Э-ЖХВР в виде одного основного пика, имеющего время удержания, равное 7,5 минут, за которым следовали более мелкие пики, соответствующие холостому буферному раствору (данные не показаны).

Удаление остаточной ДНК клеток-хозяев. ДНК клеточной культуры (клеток-хозяев) являются основными примесями, удаляемыми при очистке с использованием рекомбинантного способа. Общая концентрация ДНК в объединенном очищенном концентрате BBC не должна превышать 10 нг/дозу (107 БОЕ). Профили удаления ДНК, полученные в четырех крупномасштабных экспериментах, приведены в нижеследующей Таблице 12, из которой видно, что на каждом этапе очистки осуществляли постепенное удаление ДНК. Основное удаление ДНК наблюдали на стадии получения продукта (т.е. осветлении 1° путем низкоскоростного центрифугирования с последующим проведением осветления 2° фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм) и на стадии мембранной адсорбции на Mustang™ Q. Более 80% остаточных ДНК удаляли на стадии очистки на Mustang™ Q, и более 60% ДНК удаляли на стадии очистки посредством УФ/ДФ. Общий процент удаления ДНК составлял 99,89±0,03% во всех четырех крупномасштабных экспериментах. Кроме того, остаточная концентрация ДНК составляла гораздо менее 10 нг/дозу (Таблица 13).

Таблица 12
Данные по удалению ДНК клеток-хозяев (%)
Операция способа Эксп.1 Эксп.2 Эксп.3 Эксп.4 Среднее Стандартное отклонение
Выход продукта1 95,70 93,97 96,1 93,62 94,85 1,23
Mustang™ Q 82,69 84,7 85,43 84,61 84,36 1,17
ПФ 74,51 66,63 64,42 61,80 66,89 5,45
Фильтрова
ние
44,81 64,23 55,34 57,73 55,53 8,07
Всего 99,90 99,89 99,91 99,84 99,89 0,03
Выход продукта1 представляет собой осветление культуральной жидкости при низкоскоростном центрифугировании с последующим фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
Таблица 13
Данные о концентрации ДНК в объединенном очищенном концентрате BBC
Остаточная концентрация ДНК (нг/107 БОЕ-доза)
Эксперимент 1 1,46
Эксперимент 2 0,97
Эксперимент 3 3,00
Эксперимент 4 1,93

Удаление белка gag. Концентрацию белка gag определяли при помощи анализа ELISA, который позволил получить данные для определения остаточной концентрации gag в получаемом BBC. Профиль белка gag, наблюдаемый в способе-очистке, указан в нижеследующей Таблице 14. Большая часть белка Gag была удалена при проведении операции вторичного осветления (т.е. фильтрования через фильтр с размером пор 0,2 мкм) и операции мембранной адсорбции на Mustang™ Q. Как показано в Таблице 15, остаточная концентрация белка Gag в готовом объединенном очищенном концентрате составляла от 0,08 до 8,93 нг/дозу (107БОЕ).

Таблица 14.
Данные по уменьшению остаточной концентрации gag
Способ Объем Остаточная концентрация gag Общая степень удаления gag
нг/мл нг
Неосветленная культура 4425 4,330 19160,3 -
После центрифугирования 4373 3,530 15436,7 19,43%
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр 9272 0,750 6954,0 63,71%
Последующее фильтрование через 0,2 мкм фильтр 9200 0,690 6384,0 66,87%
Элюаты + промывные воды 9800 0,660 6468,0 -
Элюирование через Mustang™ Q 1600 0,680 1088,0 94,32%
Концентрат ПФ 450 4,100 1845,0 90,37%
Предварительное фильтрование через 0,2 мкм фильтр 495 3,410 1688,0 91,19%
Объединенный очищенный концентрат 475 0,930 441,8 97,69%
Таблица 15
Данные по остаточной концентрации gag в объединенном очищенном концентрате BBC
Удаление gag (%) Остаточная концентрация gag (нг/107 БОЕ-доза)
Эксперимент 1 80,0 8,93
Эксперимент 2 87,1 6,76
Эксперимент 3 97,7 0,08
Эксперимент 4 87,1 8,50

ПРИМЕР 10: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVINN4CT1-gag1

Изначально разработка способа очистки для конструкции VSVINN4CT1-gag1 была осложнена низким титром продукта в культуральной клеточной жидкости (<106 БОЕ/мл), что приводило к низкому титру продукта и высокому загрязнению ДНК в объединенном готовом концентрате. Тем не менее способ очистки, описанный в Примере 9 для VSVINN4CT9-gag1, был успешно применен к данной конструкции, а объем (культуральной клеточной жидкости) увеличен до 10 л. Применение указанного способа очистки позволило получить BBC продукт высокого качества.

В соответствии со способом очистки операции первичного и вторичного осветления были по существу аналогичны соответствующим операциям, описанным в Примерах 3 и 4. Операцию анионообменной мембранной очистки с использованием адсорбера Mustang™ Q оптимизировали, как описано ниже. Проточную фильтрацию вдоль направления потока производили, применяя систему Quixstand™ или Flexstand™, снабженную мембранными картриджами, изготовленными из полого волокна (GE Healthcare; Piscataway, NJ). В этом исследовании применяли мембраны для ультрафильтрации GE из полиэфирсульфона, имеющие предел пропускания по молекулярной массе, равный 750 кДа. Номинальная площадь фильтрующей поверхности всех мембран составляла 420 см2 или 1200 см2. Эксперименты по мембранной хроматографии проводили с использованием зонда АКТА™ и системы AKTAPilot™ (GE Healthcare; Piscataway, NJ) и мембранных адсорберов Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills, NY).

Первая экспериментальная очистка VSVINN4CT1-gag1 с использованием Mustang™ Q. Адсорбция на Mustang™ Q была проведена с использованием буферных растворов, аналогичных описанным выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Вкратце, клетки и остатки клеток сначала удаляли центрифугированием. После добавления 10 × глутамата-фосфата сахарозы (ГФС) в отношении 1:9 (об./об.) и 2-кратного разбавления буфером, содержащим 10 мМ HEPES, 0,465 М NaCl, при pH 7,5, 2% сахарозы, раствор прокачивали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фильтрат загрузили на предварительно уравновешенный мембранный адсорбер Pall Mustang™ Q (объем капсулы 0,35 мл) и собирали объединенные элюат и промывные воды. Получаемый BBC извлекали с объединенным элюатом в условиях элюирования, описанных выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Получали вирусный продукт высокого качества (данные не показаны). Тем не менее одну треть продукта обнаруживали в объединенных элюате и промывных водах (Таблица 16), и титр вируса в объединенном элюате из Mustang™ Q был очень низким из-за низкого выхода титра вируса в биореакторе (4,6×105 БОЕ/мл для VSVINN4CT1-gag1 в сравнении с >1,0×107 БОЕ/мл для VSVINN4CT9-gag1).

Таблица 16
Анализ способа - выход титра при очистке на Mustang™ Q
Операция Объем (мл) Титр вируса (БОЕ/мл) Титр вируса (БОЕ) Выход (%)
Загрузка 250 9,90×104 2,48×107 100
Элюат и промывные воды 300 3,20×104 9,60×108 38,8
Элюирование 35 5,70×105 2,00×107 80,6
Регенерация 15 1,44×105 2,16×108 8,7

Условия связывания указанной конструкции на адсорбере Mustang™ Q далее были оптимизированы следующим образом. Условия эксперимента описаны в Таблице 17. Во всех экспериментах, на основании pH, ранее установленного для конструкции VSVINN4CT9-gag1, pH загрузки и элюата составлял от 6,5 до 7,5. Кроме того, концентрация NaCl в буфере загрузки в этих экспериментах составляла от 0,28 до 0,32 М, а в буфере элюирования - от 0,6 до 0,7 М. Скорость истечения (расход) составляла 3,5-10,5 мл/мин, что соответствовало 10-30 объемам капсулы (ОК)/мин.

Таблица 17
Оптимизированные условия для операции с использованием Mustang™ Q
Эксп. No. pH загрузки NaCl загрузки (М) pH элюирования NaCl элюирования (М) Расход (мл/мин)
1 7,0 0,30 7,0 0,6 7,0
2 6,5 0,32 6,5 0,7 3,5
3 7,5 0,32 6,5 0,5 3,5
4 7,5 0,32 7,5 0,7 10,5
5 6,5 0,28 6,5 0,5 10,5
6 7,5 0,28 6,5 0,7 10,5
7 7,5 0,28 7,5 0,5 3,5
8 7,0 0,30 7,0 0,6 7,0
9 6,5 0,28 7,5 0,7 3,5
10 6,5 0,32 7,5 0,5 10,5

Посредством анализа SDS-PAGE (не показан), во всех объединенных элюатах, полученных из Mustang™ Q, был обнаружен высококачественный BBC. Результаты, полученные при удалении загрязняющих белков в этой операции, показаны на Фиг.7. В этой единственной операции было извлечено более 99% загрязняющих белков, что превышает значение, полученное при очистке VSVINN4CT9-gag1. Выход способа и результаты и определение ДНК клеток-хозяев в объединенных элюатах показаны в Таблице 18. Остаточная концентрация ДНК в объединенных элюатах в этих экспериментах была чрезвычайно низкой, что указывает на достаточную легкость очистки от ДНК. Тем не менее полученный титр вируса изменялся, в зависимости от условий способа.

Таблица 18
Полученный титр вируса и остаточная концентрация ДНК в объединенных элюатах Mustang™ Q
No. эксперимента Полученный титр (%) Остаточная концентрация ДНК (нг/мл)
1 78,1 1
2 32,2 Н.П.*
3 23,9 1
4 35,7 1
5 39,1 Н.П.
6 58,3 Н.П.
7 52,2 3
8 87,5 Н.П.
9 55,1 Н.П.
10 23,7 Н.П.
* Н.П. - концентрация ДНК ниже порога определения

Выход способа был определен на основании титра вируса, определяемого в анализе бляшкообразования. Как видно из контурного графика (данные не показаны), при pH буфера загрузки, составляющем от 6,6 до 7,5, и концентрации NaCl, составляющей от 0,28 до 0,30 М, был получен приемлемый выход продукта. Оптимальное значения параметров буфера было следующим: 0,29 М NaCl в 10 мМ HEPES, 2% сахарозы, pH 7,0. Учитывая, что при загрузке предпочтительно не регулировать pH, для равновесного буфера Mustang™ Q было принято значение pH, равное 7,5. В то же время, в качестве параметров для буфера элюирования в Mustang™ Q были приняты следующие параметры: 0,60-0,70 М NaCl и pH 6,75-7,25. Оптимальные параметры буфера элюирования составляли: 10 мМ HEPES, 0,65 М NaCl, 2% сахарозы, pH 7,0. Параметры буфера элюирования для Mustang™ Q показаны в Таблице 19. При этих параметрах загрязняющие ДНК в объединенных элюатах были снижены до приемлемого уровня (данные не показаны).

Таблица 19
Параметры буферов для Mustang™ Q
Операция pH Концентрация NaCl (M)
Уравновешивание 6,6-7,5 0,28-0,30
Элюирование 6,75-7,25 0,60-0,70

Результаты других экспериментов согласовывались с вышеуказанными результатами и показали, что в некоторых примерах реализации предпочтительные параметры буфера в операции связывания, которые обеспечивали высокий выход продукта и приемлемую концентрацию загрязняющих ДНК, включали от 0,28 М до 0,30 М NaCl и pH 7,2-7,5.

ПРИМЕР 11: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVINN4CT1-gag1

Были проделаны три мелкомасштабных испытания на соответствие техническим условиям с использованием материалов, аналогичных применяемым для разработки параметров очистки на Mustang™ Q. Равновесный буфер включал 10 мМ HEPES, 0,29 М NaCl, pH 7,5, 2% сахарозы, а буфер элюирования - 10 мМ HEPES, 0,65 М NaCl, pH 7,0, 2% сахарозы. Во всех экспериментах поддерживали одинаковые рабочие условия: один и тот же расход, один и тот же объем загрузки и один и тот же объем элюирования. Результаты экспериментов представлены в Таблице 20. На основании выхода продукта, определенного по результатам анализа титра, можно заключить, что разработанный способ имеет устойчивые технические характеристики.

Таблица 20
Испытания Mustang™ Q на соответствие техническим условиям
No. эксперимента Выход (%)
А 73,0
В 81,4
С 70,8

Увеличение объема очистки VSVINN4CT1-gag1, испытания на соответствие техническим условиям и для внедрения методики в производство

После удаления микроносителей, культуральную клеточную жидкость, содержащую VSVINN4CT1-gag1, использовали в качестве исходного материала для проведения полного способа очистки. Способ включает осветление клеточной культуры посредством низкоскоростного центрифугирования и получение BBC в надосадочной жидкости; фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости, через фильтр с отверстиями размером 0,45/0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе; загрузку отфильтрованного раствора, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер, элюирование продукта, содержащего BBC, и сбор элюированных фракций; очистку выделенного BBC проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет 750 кДа, и получение BBC в концентрате; и, наконец, фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером 0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе. Были успешно произведены три испытания с увеличенным объемом/ на соответствие техническим условиям (CR), с использованием 6 л культуры, и одно испытание (TTR) с использованием 10 л культуры. Экспериментальные параметры указаны в Таблице 21.

Таблица 21
Испытания с увеличенным объемом/ на соответствие техническим условиям для VSVINN4CT1-gag1
Операция Условия проведения операции
Получение продукта центрифугированием Центрифуга периодического действия, 6238×g, 30 минут, 20-24°С
Получение продукта фильтрованием Sartorius Sartobran™ 300 (для 6 литров загрузки), 500 (для 10 литров загрузки), расход: 200 мл/мин (для 6 литров загрузки) и 300 мл/мин (для 10 литров загрузки)
Хроматография на
Mustang™ Q
Pall Mustang™ Q, 10-мл капсула, расход: 200 мл/мин;
Pall Mustang™ Q, 60-мл капсула, расход: 600 мл/мин
Ультрафильтрация/ диафильтрация GE Healthcare, молек. масса: 750 кДа, пять буферных обменов; CR: 420 см2, скорость поперечного течения: 500-550 мл/мин, трансмембранное давление: 1,0-2,0 psi; TTR: 1200 см2, скорость поперечного течения: 1800 мл/мин, трансмембранное давление: 2,0 psi
Конечное фильтрование Sartorius Sartobran™ 150, 100 мл/мин

Результаты экспериментов показаны в Таблицах 22 и 23. Был проделан обычный анализ SDS-PAGE (данные не показаны). Различие в выходе операций в различных экспериментах объясняется различением в эффективности анализа (анализ бляшкообразования). Наблюдали хорошее согласование общего выхода способа во всех экспериментах. Также наблюдали хорошее согласование степени удаления белков и загрязняющих ДНК. Во всех экспериментах получали вирусный продукт высокого качества.

Таблица 22
Параметры испытаний на соответствие техническим условиям для VSVINN4CT1-gag1
Увеличение масштаба CR#1 CR#2 TTR#1
Серия VSV060405 VSV060816 VSV060831 LP#1
Сбор клеточной культуры: объем (мл) 6612 5696 5692 8000
Сбор клеточной культуры: титр (БОЕ/мл) 5,55×105 2,15×105 1,69×106 8,14×105
Очищенный объединенный концентрат: объем (мл) 280 530 280 850
Очищенный объединенный концентрат: титр (БОЕ/мл) 1,45×106 2,08×105 3,00×106 7,81×105
Выход способа (%) 11,7 9,1 8,7 10,2
Остаточные ДНК (нг/мл) 32 12 13 6
Загрязняющие белки (5) Н.О. 99,97 99,98 99,92
Н.О. = не определяли
Таблица 23
Анализ способа по выходу продукта
Операция способа CR#1 CR#2 Увеличение масштаба Среднее1 Станд. откл.2 TTR#1
Сбор 100,0 100,0 100,0 100
Центрифугирование 56,6 70,0 79,3 68,6 11,4 Н.О.
Предварительное SB разбавление 137,0 112,5 Н.О. 124,8 17,3 23,7
Фильтрование через Sartobran 96,5 71,8 98,1 88,8 14,7 257,2
Хранение в течение ночи 89,8 41,9 Н.О. 65,9 33,9 48,6
Mustang™ Q 43,4 100,1 32,9 58,8 36,2 93,0
УФ/ДФ 58,4 99,2 110,0 89,2 27,2 26,4
Фильтрование через 0,2 мкм фильтр 53,6 37,0 39,4 43,3 9,0 139,7
Общий выход 9,1 8,7 11,7 9,8 1,6 10,2
1, 2: Среднее и станд. откл. из CR#1-3;
Н.О. = не определяли

Данный способ очистки VSVINN4CT1-gag1 успешно приводит к получению высококачественного продукта. Объем очистки был доведен до 10 л (объем культуральной клеточной жидкости), и параметры способа при этом оставались стабильными. Общий выход способа, рассчитанный на основании титра BBC, полученного при анализе бляшкообразования, был ниже, чем соответствующий выход при очистке VSVINN4CT9-gag1 и VSVNJN4CT1-gag1. Основные потери титра наблюдали при конечном фильтровании через фильтр с размером пор 0,2 мкм и также, возможно, при очистке на Mustang™ Q. Потери титра могут быть объяснены неспецифическим связыванием, в особенности при проведении очистки исходного материала, имеющего низкое значение титра. Чем ниже титр, тем большая часть вируса будет потеряна при фильтровании. Хорошим решением этой проблемы является повышение титра BBC в клеточной культуре. Можно полагать, что специалист в данной области техники, не прибегая к проведению ненужных экспериментов, может произвести в предлагаемой системе очистки изменения, включающие применение других компонентов буферов, наполнителей и условий проведения, которые могут снизить потери титра при очистке, а также применение благоприятной для вирусного продукта буферной среды.

ПРИМЕР 12: Способ крупномасштабной очистки BBC для конструкции VSVNJN4CT1-gag1

К этой конструкции успешно применяли способ очистки, описанный в Примере 9 для VSVINN4CT9-gag1, и затем объем был увеличен до 10 л (объем клеточной культуры). В этом способе очистки был получен BBC высокого качества.

В соответствии с этим способом очистки, операции первичного и вторичного осветления были по существу аналогичны соответствующим операциям, описанным в Примерах 3 и 4. Операцию анионообменной мембранной очистки с использованием адсорбера Mustang™ Q оптимизировали, как описано ниже. Проточную фильтрацию вдоль направления потока производили, применяя систему Quixstand™ или Flexstand™, снабженную мембранными картриджами, изготовленными из полого волокна (GE Healthcare; Piscataway, NJ). В этом исследовании применяли мембраны для ультрафильтрации GE из полиэфирсульфона, имеющие предел пропускания по молекулярной массе, равный 750 кДа. Номинальная площадь фильтрующей поверхности всех мембран составляла 420 см2 или 1200 см2. Эксперименты по мембранной хроматографии проводили с использованием зонда АКТА™ и системы AKTAPilot™ (GE Healthcare; Piscataway, NJ) и мембранных адсорберов Pall Mustang™ Q (Pall Corporation; East Hills, NY).

Первая экспериментальная очистка VSVNJN4CT1-gag1 с использованием условий, описанных выше для очистки VSVINN4CT9-gag1, позволила получить продукт высокого качества, что было подтверждено анализом SDS-PAGE. Тем не менее, в объединенных элюатах, содержащих продукт, были обнаружены высокие концентрации остаточных ДНК. Для достижения высокой степени очистки и получения высококачественного BBC продукта, условия связывания и элюирования на Mustang™ Q были оптимизированы с использованием мембранной хроматографии. Высокая воспроизводимость параметров способа была показана в последующих экспериментах, включавших испытания с увеличенным объемом/ на соответствие техническим условиям (CR), проводимые в следующих условиях.

Способ очистки также был успешно модифицирован для применения в контрактной производственной организации (КПО), где его применяли для получения материала, используемого для клинических испытаний.

Первая экспериментальная очистка VSVNJN4CT1-gag1 с использованием Mustang™ Q. Операция очистки на Mustang™ Q была проведена с использованием клеточной культуральной жидкости и буферных растворов и условиях проведения очистки, аналогичных описанным выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Коротко говоря, клетки и осколки клеток сначала удаляли центрифугированием. После кондиционирования посредством добавления 1X глутамат-фосфата сахарозы (ГФС) и 2-кратного разбавления буфером, содержащим 10 мМ HEPES, 0,465 М NaCl, при pH 7,5, 2% сахарозы, раствор прокачивали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Фильтрат загружали на предварительно уравновешенный мембранный адсорбер Mustang™ Q и собирали объединенные элюат и промывные воды. Получаемый BBC извлекали с объединенным элюатом в условиях элюирования, описанных выше для очистки VSVINN4CT9-gag1. Кроме того, собирали раствор, полученный при регенерации с использованием раствора, включающего 10 мМ HEPES, 1,0 М NaCl, при pH 7,5, 2% сахарозы. Наконец, Mustang™ Q очищали 1,0 М раствором NaOH. В эксперименте наблюдали высокую BBC-связывающую способность. Тем не менее в объединенных элюатах обнаружили лишь небольшое количество продукта (данные не показаны). В основном вирусный продукт обнаруживали в объединенном растворе для регенерации, и более половины вирусного продукта было потеряно (См. Таблицу 24). Как в элюатах, так и в объединенном растворе для регенерации обнаруживали большое количество загрязняющих ДНК. С целью увеличения выхода продукта и снижения концентраций остаточных ДНК, затем были оптимизированы условия связывания и элюирования для Mustang™ Q с учетом новой вирусной конструкции.

Таблица 24
Анализ очистки на Mustang™ Q - выход титра и удаления ДНК
Способ: Загрузка Элюирование и промывка Элюирование Регенерация
Объем (мл) 312 330 35 15
Титр вируса (БОЕ/мл) 6,71×105 Н.П. 5,94×105 5,00×106
Титр вируса (БОЕ) 2,09×108 Н.П. 2,08×107 7,50×107
Выход вируса (%) 100,0 0,0 9,9 35,8
ДНК (нг/мл) 123 16 84 782
ДНК (нг) 38376 5280 2940 11730
Количество ДНК 100,0 13,76 7,66 30,57
ДНК (нг/доза) 1833,1 Н.А. 1414,1 1564,0
1 доза = 1,0×107БОЕ;
Н.П. - ниже порога определения
Н.А. - не анализировали

Как уже было упомянуто выше, в очистке VSVINN4CT9-gag1 затруднительным было удаление остаточной ДНК из готового продукта. Для дальнейшей оптимизации условия проведения очистки применяли Merck KGaATM ТМАЕ и Pall MustangTM Q.

Разработка очистки BBC с использованием смолы ТМАЕTM

Было проведено исследование влияния параметров буфера связывания 15 BBC на смоле ТМАЕ™ (триметиламиноэтиловая смола) с использованием полнофакторного эксперимента, как указано в Таблице 25. Загрузкой были осветленные культуральные жидкости, имеющие различные буферные параметры. Количество BBC в элюатах анализировали с помощью вестерн-блоттинга.

Таблица 25
Полнофакторный эксперимент условий связывания на ТМАЕ™
Факто
ры
pH Концентрация NaCl в равновесном буфере (мМ)
Значе
ние
6,5; 7,0; 7,5 0, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400

Как показал вестерн-блоттинг (не показано), при концентрации NaCl в равновесном буфере, равной 200 мМ, в объединенных элюатах было обнаружено значительное количество BBC. Для получения достаточной связующей способности ТМАЕ™ по отношению к BBC, концентрация NaCl в равновесном буфере должна быть ниже 200 мМ. Связующая способность BBC при тестируемых значениях pH изменялась незначительно. Тем не менее анализ содержания BBC в объединенных элюатах (оценка при помощи интегрирования площадей под кривыми, полученными при помощи Э-ЖХВР анализа объединенных элюатов ТМАЕ (Фиг.8А, 8В и 8С)), указывает на то, что при одинаковой концентрации NaCl в буфере связывания более высокая связывающая способность достигается при более высоких значениях pH (pH 7,5 по сравнению с pH 7,0 и 6,5).

Экспериментальная очистка BBC с использованием колонки с ТМАЕ

Клетки и осколки удаляли из культуральной клеточной жидкости, содержащей VSVINN4CT9-gag1 центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 минут при 20-24°С. После смешивания полученной жидкости с 10Х количеством маточного раствора в отношении 9 к 1, ее прокачивали через 0,45/0,2-мкм фильтр. Фильтрат использовали для загрузки на колонку с ТМАЕ (2 мл) при скорости истечения, равной 4 мл/мин, колонку предварительно уравновешивали раствором, содержащим 10 мМ HEPES, 0,145 М NaCl, 2% сахарозы и имеющим pH 7,4. После прогона через колонку равновесного буфера в количестве 10 объемов колонки (КО) адсорбированные материалы вымывали из колонки при элюировании линейным градиентом 10 мМ HEPES, 1,5 М NaCl, 2% сахарозы при pH 7,5 в 30 объемах колонки. Собирали различные элюаты.

Таблица 26
Элюирование BBC из колонки с ТМАЕ
Образцы Описание Объем (мл)
Загрузка Последующее фильтрование через 0,2-мкм 130
фильтр
Э+ПВ 150
Элюаты и промывочные растворы
F1 16
А3-10
F2 6
А11-В12
F3 22
В11-В1
F4 6
C12-D11 (0,5MNaOH)

При проведении SDS-PAGE электрофореза на геле (не показан) в профиле элюирования наблюдали два основных пика. Первый пик F1 соответствовал низкому соотношению UV254/280, что указывало на более высокое отношение белки/вирус. Второй пик F2 соответствовал высокому соотношению UV254/280, что указывало на более высокое содержание нуклеиновых кислот. Данные анализа PicoGreen® подтвердили, что концентрация ДНК во фракции F1 чрезвычайно низка (данные не показаны). Таким образом, эту колонку использовали для удаления ДНК. По данным анализа бляшкообразования выход титра в этом пике составлял 81,4%. Тем не менее отмечали высокое содержание загрязняющих белков.

Очистка BBC с использованием мембранного адсорбера MustangTM Q

Выполняли поиск условий связывания BBC на мембранном адсорбере MustangTM Q с использованием полнофакторного эксперимента, данные которого указаны в Таблице 27. Загрузка представляла собой осветленную культуральную жидкость, параметры которой доводили до необходимых буферных значений. Объединенные элюаты, получаемые из MustangTM Q, анализировали при помощи анализа SDS-PAGE (не показан).

Таблица 27
Полнофакторный эксперимент по поиску условий связывания BBC на Mustang™ Q
Факторы pH Концентрация NaCl в равновесном буфере (М)
Значение 6,5; 7,0; 7,5 0,15; 0,20; 0,22; 0,24; 0,26; 0,28

SDS-PAGE анализ поиска условий связывания BBC на адсорбере Mustang™ Q проводили при различных связывающих концентрациях NaCl, соответственно: 0,15; 0,20; 0,22; 0,24; 0,26; 0,28 М. Когда концентрация NaCl в равновесном буфере достигала 0,26 М, высокомолекулярные загрязняющие белки извлекались из элюатов при всех тестируемых значениях pH.

Поиск условий элюирования

Осветленную культуральную жидкость, содержащую VSVINN4CT9-gag1, разбавляли в два раза маточным раствором HEPES (10 мМ HEPES, 0,415 М NaCl, 2% сахарозы, pH 7,25) до достижения конечной концентрации NaCl, равной 0,28 М. Приготовленный раствор использовали в качестве загрузочного в этом эксперименте. Условия эксперимента указаны в Таблице 28. После связывания на Mustang™ Q MA, BBC элюировали буферными растворами для элюирования, имеющими различные концентрации NaCl.

Таблица 28
Полнофакторный эксперимент по поиску условий элюирования из Mustang™ Q
Факто
ры
pH Концентрация NaCl в буфере для элюирования (М)
Значе
ние
6,5; 7,0; 7,5 0,55; 0,60; 0,65; 0,70; 0,75

Анализ контурного изображения выхода способа (не показан) указывает на то, что для достижения разумного выхода (>55%), параметры буфера элюирования должны быть следующими: pH=6,5-6,9 и концентрация NaCl=0,55-0,70 М. Как показывает SDS-PAGE анализ элюатов, полученных из Mustang™ Q (не показан), при этих параметрах получают высококачественный продукт, содержащий BBC.

Оптимизация условий работы Mustang™ Q при помощи методики DOE

Последующая оптимизация операции очистки на Mustang™ Q позволила увеличить степень связывания BBC и улучшить условия элюирования, что позволило улучшить очистку продукта от ДНК и увеличить выход продукта. Условия эксперимента показаны в Таблице 29. На основании исходных исследований и предыдущих экспериментов с VSVINN4CT9-gag1 были выбраны значения pH для загрузки и элюирования, составляющие от 6,5 до 7,0. По результатам исходных исследований также были выбраны различные концентрации NaCl для загрузочных буферов и буферов элюирования. Расход (скорость истечения) во всех экспериментах был принят равным 7,0 мл/мин, что составляло 20 объемов капсулы (ОК)/мин.

Таблица 29
Очистка BBC на адсорбере Mustang™ Q
No. эксп. Связывающая концентрация NaCl (М) pH связывания Концентрация NaCl для элюирования (М) РН элюирования
1 0,26 6,5 0,550 6,50
2 0,26 6,5 0,700 6,75
3 0,26 7,0 0,625 7,00
4 0,26 7,5 0,550 6,75
5 0,26 7,5 0,700 6,50
6 0,28 6,5 0,550 7,00
7 0,28 6,5 0,625 6,50
8 0,28 7,0 0,550 6,50
9 0,28 7,0 0,625 6,75
10 0,28 7,0 0,625 6,75
11 0,28 7,0 0,625 6,75
12 0,28 7,0 0,625 6,75
13 0,28 7,5 0,700 7,00
14 0,30 6,5 0,550 6,50
15 0,30 6,5 0,700 7,00
16 0,30 7,0 0,625 6,75
17 0,30 7,0 0,700 6,50
18 0,30 7,5 0,550 7,00
19 0,30 7,5 0,625 6,50

Экспериментальные результаты

Выход способа был рассчитан на основании титра продукта, содержащего BBC, определяемого в соответствии с анализом бляшкообразования. Результаты показаны на профиле прогноза (prediction profile) (не показан). Для получения максимального выхода способа были предложены следующие условия проведения адсорбции на Mustang™ Q:

Концентрация NaCl в буфере загрузки: 0,26-0,30 М

pH буфера загрузки: 7,0-7,5

Концентрация NaCl в буфере элюирования: 0,55-0,65

pH буфера элюирования: 6,5-7,0

Остаточные концентрации ДНК в элюатах, поступающих из Mustang™ Q, полученных в различных условиях связывания, показаны на контурных изображениях (не показаны). Параметры буферов для Mustang™ Q были дополнительно уточнены на основании результатов по удалению ДНК:

Концентрация NaCl в буфере загрузки: 0,27-0,29 М

pH буфера загрузки: 7,0-7,5

Концентрация NaCl в буфере элюирования: 0,55-0,65

pH буфера элюирования: 6,5-7,0

Чистоту BBC, получаемого в элюатах, поступающих из Mustang™ Q, оценивали при помощи денситометрии SDS-PAGE (не показана). Анализировали чистоту продукта, полученного в различных условиях связывания и при различных параметрах буферного раствора для элюирования. Учитывая отклонения в денситометрическом анализе, во всех случаях не было обнаружено значительного различия в чистоте получаемого BBC. Во всех экспериментах получали высококачественный BBC.

Диапазон рабочих режимов Mustang™ Q

Параметры буферов связывания и элюирования при проведении мембранной хроматографии на Mustang™ Q были определены посредством экспериментов, в которых исследовали большее количество значений рабочих условий, как внутри, так и вне принятого диапазона; результаты показаны в Таблице 30. Равновесные буферные растворы/буферные растворы элюирования включали 10 мМ HEPES, 2% сахарозы и различные количества NaCl при различных значениях pH. Во всех экспериментах поддерживали одинаковые рабочие условия: один и тот же расход, один и тот же объем загрузки и объем элюирования. Как видно из Таблицы 30, воспроизводимость характеристик проведения способа очистки была хорошей: анализ SDS-PAGE показал, что полученный BBC имеет высокое качество, во всех элюатах, поступающих из Mustang™ Q, были обнаружены допустимые уровни остаточных ДНК и, кроме того, был получен хороший выход продукта.

Таблица 30
Определение диапазон рабочих режимов Mustang™ Q
РН загруз
ки
Концентрация NaCl в загрузке (М) pH элюирования Концентрация NaCl при элюировании (М) Выход (%, титр) Чистота (%, SDS-PAGE) ДНК (нг/мл)
7,5 0,30 6,75 0,60 52,0 72,0 34
7,0 0,30 6,75 0,60 85,7 80,0 33
7,5 0,26 6,75 0,60 49,1 76,1 34
7,0 0,26 6,75 0,60 68,0 73,0 39
7,5 0,28 7,00 0,65 85,7 79,6 21
7,5 0,28 6,50 0,65 70,9 82,3 18
7,5 0,28 6,50 0,55 49,5 82,8 15
7,5 0,28 7,00 0,55 59,9 83,3 21
7,5 0,28 6,75 0,60 52,6 Н.О. 17
7,5 0,28 6,75 0,60 107,2 Н.О. 30
Н.О. = не определено

Испытания на соответствие техническим условиям для VSVINN4CT1-gag1

Все операции способа были проделаны при очистке культуральной клеточной жидкости, содержащей VSVINN4CT9-gag1. Способ включает: осветление клеточной культуры посредством низкоскоростного центрифугирования и выделение BBC в надосадочную жидкость; фильтрование полученной после центрифугирования надосадочной жидкости, через фильтр с отверстиями размером 0,45/0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе; загрузку фильтрата, содержащего BBC, на анионообменный мембранный адсорбер; элюирование BBC из анионообменного мембранного адсорбера и получение BBC; очистку полученного BBC с применением проточной фильтрации вдоль потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет 750 кДа, и получение BBC в концентрате; и, наконец, фильтрование концентрата, содержащего BBC, через фильтр с отверстиями размером 0,2 мкм и получение BBC в отфильтрованном растворе. Wyeth были произведены испытания на соответствие техническим условиям: одно испытание с использованием 10 л культуры и два испытания с использованием 6 л культуры, и Henogen были произведены два испытания внедрения методики в производство с использованием 10 л культуры. Экспериментальные параметры указаны в Таблице 31.

Таблица 31
Параметры способа для эксперимента с VSVINN4CT9-gag1
Операция Условия проведения операции
Получение продукта прицентрифугированием Центрифуга периодического действия, 6238×g, 30 минут, 20-24°С
Получение продукта прифильтрованием Sartorius Sartobran™ 300 (для 6 литров загрузки), 500 (для 10 литров загрузки), расход: 200 мл/мин (для 6 литров загрузки) и 300 мл/мин (для 10 литров загрузки)
Хроматография на Mustang™ Q Pall Mustang™ Q, 10-мл капсула, расход: 200 мл/мин;
Pall Mustang™ Q, 60-мл капсула, расход: 600 мл/мин
Ультрафильтрация / диафильтрация GE Healthcare, молек. масса: 750 кДа, пять буферных обменов; CR: 420 см2, скорость поперечного течения: 500-550 мл/мин, трансмембранное давление: 1,0-2,0 psi; TTR: 1200 см2, скорость поперечного течения: 1800 мл/мин, трансмембранное давление: 2,0 psi
Конечное фильтрование Sartorius Sartobran™ 150, расход: 00 мл/мин

Для выполнения трех испытаний на соответствие техническим условиям (CR) и одного испытания внедрения методики в производство использовали капсулу Mustang™ Q объемом 10 мл. Капсулу Mustang™ Q объемом 60 мл использовали только в одном испытании TTR. Расход для 10-мл капсулы составлял 200 мл/мин, а для 60-мл капсулы - 600 мл/мин. В испытаниях на соответствие техническим условиям использовали ПФ мембрану площадью 420 см2, в то время как для TTR экспериментов использовали ПФ мембрану площадью 1200 см2. Скорость поперечного течения изменяли линейно в соответствии с площадью мембраны.

Результаты экспериментов показаны в Таблицах 32 и 33. Наблюдали хорошее согласование общего выхода способа во всех экспериментах. Различие в выходах операций в различных экспериментах объясняется различением в эффективности анализа (Таблица 33). Во всех экспериментах наблюдали хорошее согласование степени удаления белков и загрязняющих ДНК (Таблица 32). Для оценки способа был проделан обычный анализ SDS-PAGE (данные не показаны). Во всех экспериментах получали вирусный продукт высокого качества.

Таблица 32
Параметры испытаний на соответствие техническим условиям для VSVNJN4CT1-gag1
CR#1 CR#2 CR#3 TTR#1 TTR#2
Серия # VSV060629 VSV060712 VSV060728 Henogen #1 Henoge n#2
Сбор клеточной культуры: объем (мл) 8927 5704 5607 8072 7980
Сбор клеточной культуры: титр (БОЕ/мл) 1,28×107 2,81×10 2,56×107 1,27×107 8,14×106
Очищенный объединенный концентрат: объем (мл) 800 670 600 855 550
Очищенный объединенный концентрат: титр (БОЕ/мл) 8,22×107 1,45×108 1,16×108 2,86×107 5,36×107
Выход способа (%) 57,7 60,8 55,8 23,9 45,4
Остаточные ДНК (нг/мл) 18 22 11 51 21
Загрязняющие белки (5) 99,83 99,84 99,89 99,72 Н.Д.
Н.Д. = недоступно
Таблица 33
Анализ способа на основании выхода продукта
Операция способа CR#1 CR#2 CR#3 Среднее Станд.
откл.2
TTR#1 TTR#2
Сбор 100 100 100 100 0 100 100
Центрифугирова
ние
113,8 97,6 96,3 102,6 9,8 188,6 71,2
Фильтрование через Sartobran™ 106,7 90,8 123,6 107,3 16,4 23,8 71,6
Хранение в течение ночи Н.О. 76,8 85,5 81,2 6,2 Н.О. Н.О.
Mustang™ Q 37,5 70,7 42,7 50,3 17,9 309,3 60,2
УФ/ДФ 116,7 102,8 129,9 116,5 13,6 16,5 123,4
Фильтрование через 0,2 мкм фильтр 107,7 131,2 85,8 108,2 22,7 134,2 119,9
Общий выход 57,7 60,8 48,8 55,8 6,2 23,9 45,4
1,2: Среднее и станд. откл. из CR#1-3;
Н.О. = не определяли

Таким образом, был успешно разработан способ очистки VSVNJN4CT1-gag1, и обнаруженные условия проведения очистки были адаптированы для объема 10 л (объем клеточной культуры) при сохранении первоначальных технологических характеристик способа очистки. Успешное осуществление способа было подтверждено проведением трех испытаний на соответствие техническим условиям и двух испытаний внедрения методики в производство, включающих использование 10 л и 6 л клеточной культуры, соответственно. При помощи разработанного способа был получен вирусный продукт высокого качества с приемлемым выходом и степенью очистки от примесей.

Все патенты и публикации, цитируемые в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание по ссылке.

1. Способ очистки вируса везикулярного стоматита (ВВС) из жидкости клеточной культуры, полученной из культуры клеток млекопитающего, зараженных ВВС, который включает:
(a) осветление указанной жидкости клеточной культуры при помощи низкоскоростного центрифугирования при скорости ниже 10000 об/мин или при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, с получением указанного ВВС в надосадочной жидкости;
(b) фильтрование указанной надосадочной жидкости, полученной на стадии (а), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,45 мкм, и получение указанного ВВС в отфильтрованном растворе;
(c) загрузку содержащего ВВС указанного отфильтрованного раствора, полученного на стадии (b), на анионообменный мембранный адсорбер, уравновешенный первым буферным солевым раствором, при этом первый буферный солевой раствор обладает ионной силой по меньшей мере от примерно 100 мМ до примерно 400 мМ, элюирование указанного ВВС из указанного анионообменного мембранного адсорбера вторым буферным солевым раствором, при этом указанный ВВС элюируется с указанного мембранного адсорбера при добавлении указанного второго буферного солевого раствора в одну стадию, при этом концентрация соли в указанной одностадийной элюции составляет от 500 мМ до 750 мМ, и сбор элюированных фракций, содержащих ВВС;
(d) очистку указанного ВВС, выделенного на стадии (с), проточной фильтрацией вдоль направления потока (ПФ) с использованием мембраны, предел пропускания по молекулярной массе которой составляет от 300 кДа до 1000 кДа, и получение указанного ВВС в концентрате; и
(е) фильтрование содержащего ВВС указанного концентрата, полученного на стадии (d), через фильтр с отверстиями размером от 0,2 до 0,22 мкм и получение указанного ВВС в отфильтрованном растворе,
причем указанный способ очистки не включает использование человеческих эмбрионов.

2. Способ по п.1, согласно которому фильтрование на стадии (е) осуществляют до достижения степени очистки указанного ВВС от загрязняющих его белков клеточной культуры и нуклеиновых кислот, от по меньшей мере 90,0% до примерно 99,0%.

3. Способ по п.1, согласно которому указанные клетки млекопитающего выбирают из группы, включающей эмбриональные клетки почки человека (НЕК), клетки НЕК 293, клетки яичников Китайского хомячка (СНО), клетки почки новорожденных хомячков (ВНК), клетки почки Африканской зеленой мартышки (AGMK) и клетки Vero AGMK.

4. Способ по п.1, согласно которому скорость указанного низкоскоростного центрифугирования составляет от 4000 × g до 8000 × g.

5. Способ по п.1, согласно которому указанный первый буферный солевой раствор или указанный второй буферный солевой раствор, используемый на стадии (с), независимо обладает одной или более характеристиками, выбранными из группы, состоящей из следующего:
(a) содержит соль, независимо выбранную из NaCl или KCl;
(b) содержит соль, ионная сила раствора которой составляет от 100 мМ до 400 мМ;
(c) содержит буфер, pKa которого составляет от 6,0 до 8,5;
(d) имеет значение рН от 6,5 до 8,0;
(e) содержит буфер, выбираемый из группы, состоящей из фосфатного буфера, буфера, включающего N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES) или трис(гидроксиметил)аминометан (TRIS); и
(f) содержит сахарозу в концентрации от 1,5% до 5%.

6. Способ по п.5, согласно которому соль в указанном втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl и согласно которому указанный ВВС элюируют из указанного мембранного адсорбера добавлением указанного второго рН-буферного солевого раствора в одну стадию, и согласно которому концентрация указанного NaCl при элюировании, проводимом в одну стадию, составляет от 500 мМ до 750 мМ.

7. Способ по п.6, согласно которому скорость элюирования указанным вторым буферным солевым раствором составляет от 10 объемов капсулы в минуту (ОК/минуту) до 30 ОК/минуту.

8. Способ по п.5, согласно которому соль в указанном втором буферном солевом растворе представляет собой NaCl и согласно которому ионную силу указанного второго буферного солевого раствора указанного NaCl линейно увеличивают от 1 мМ до 750 мМ при скорости элюирования, составляющей от 10 ОК/минуту до 30 ОК/минуту.

9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому указанная мембрана ПФ обладает одной или более характеристиками, выбираемыми из группы, состоящей из:
(a) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 300 кДа;
(b) предел пропускания по молекулярной массе, составляющий 750 кДа; и
(c) мембранный модуль изготовленный из полого волокна.

10. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому указанная ПФ включает концентрирование указанного ВВС, полученного на стадии (с), проводимое по меньшей мере 5 раз, с последующим проведением по меньшей мере однократной или по меньшей мере пятикратной замены буфера.

11. Способ по п.10, согласно которому указанный буфер, применяемый при буферном обмене, обладает одной или более характеристиками, выбираемыми из группы, состоящей из следующего:
(a) представляет собой фосфатный буфер;
(b) представляет собой буфер, содержащий HEPES;
(c) представляет собой буфер, содержащий TRIS;
(d) концентрация буфера составляет от 5 мМ до 15 мМ, а рН составляет от 7,2 до 7,5; и
(e) буфер также содержит от 100 мМ до 200 мМ NaCl и от 3,5% до 4,5% сахарозы.

12. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому операции очистки (а)-(е) проводят при значении температуры или значениях температуры, составляющих или находящихся в диапазоне от 15°С до 25°С.

13. Способ по любому из пп.1-8, 11, согласно которому осветление указанной культуральной жидкости клеточной культуры, проводимое на стадии (а), осуществляют при помощи модуля объемного фильтрования, размер пор которого составляет от 1,0 мкм до 4,5 мкм, и при этом из операции (а) исключают проведение низкоскоростного центрифугирования.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении нового биопрепарата для очистки воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси- -масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении нового биопрепарата для очистки воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси- -масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении нового биопрепарата для очистки воды, почвы, промышленных стоков от устойчивых к разложению пестицидов, выбранных из хлорфеноксиуксусных кислот, таких как 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д), трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т), хлорфеноксиуксусная кислота (ХФУК), феноксиуксусная кислота (ФУК), -2,4-дихлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2-метил-4-хлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2,4,5-трихлорфенокси- -пропионовой кислоты, 2,4-дихлорфенокси- -масляной кислоты, метил-[1-(бутиламино)карбонил]-1Н-бензимидазол-2-илкарбамата, 2,4-дихлорфенола, имидоклаприда, гексахлоргексана, а также фенола.
Изобретение относится к области микробиологии. .
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при выращивании дрожжей Saccharomyces cerevisiae. .
Изобретение относится к биотехнологии. .

Изобретение относится к биотехнологии, молочной промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу очистки рекомбинантных аденовирусов млекопитающих и человека. .
Изобретение относится к области медицины и касается способа получения живой культуральной гриппозной вакцины. .
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита (КЭ) из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению питательных сред для культивирования клеток, и может быть использовано для значительного снижения вариаций продукции рекомбинантных белков, которые имеют место при культивировании клеток с использованием разных партий коммерчески доступного соевого гидролизата.

Изобретение относится к биотехнологии и вирусологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. .

Изобретение относится к устройству для очистки вирусов и может быть использовано в микробиологической промышленности. .

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа концентрации вирусов из жидких сред. .
Изобретение относится к области вирусологии. .
Изобретение относится к области биотехнологии
Наверх