Способ, реагент и набор для определения холестерина в остаточно-подобных частицах
Изобретение относится к медицине и касается определения холестерина в остаточно-подобных частицах без разделения компонентов исследуемой пробы. Изобретение обеспечивает достижение повышенной реакционной способности к ОПЧ-холестерину в пробах гиперлипидемии типа III и точное определение ОПЧ-холестерина в образцах гиперлипидемии типа III. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 8 ил., 13 табл.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к способу, реагенту и набору для количественного определения холестерина в остаточно-подобных частицах (далее сокращаемых как ОПЧ), рассматриваемых в клинических тестах в качестве факторов риска артериосклероза и т.п.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Кровь содержит различные типы липопротеинов. Последние классифицируются по своей плотности на хиломикроны (далее сокращаемые как ХМ), липопротеины очень низкой плотности (далее сокращаемые как ЛПОНП), липопротеины низкой плотности (далее сокращаемые как ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (далее сокращаемые как ЛПВП). Каждый класс липопротеинов характеризуется своим специфическим соотношением содержащихся в них компонентов, таких как холестерин, триглицериды, фосфолипиды и белки, и демонстрирует отличную от других классов активность in vivo.
В клинических тестах холестерин в составе ЛПВП рассматривается как отрицательный фактор риска артериосклероза, в то время как холестерин в составе ЛПНП рассматривается в качестве положительного фактора риска развития артериосклероза. Поэтому определение холестерина в составе этих классов липопротеинов часто используется в клинических тестах.
Было показано, что липопротеиновый холестерин, образующийся в ходе липидного метаболизма и т.п., является фактором риска, более тесно связанным с артериосклерозом, нежели холестерин в составе ЛПНП. Примером липопротеинов, образующихся в ходе липидного метаболизма, могут служить ОПЧ и т.п.
Недавно был разработан иммуноадсорбционный способ определения холестерина в составе ОПЧ (далее сокращаемого как Х-ОПЧ). В соответствии с этим способом ОПЧ отделяют от сыворотки иммуноаффинной хроматографией на аффинном геле, содержащем анти- ApoAI-специфичные моноклональные антитела, а также моноклональные антитела, специфически распознающие ApoB-100, но не ApoB-48, после чего в выделенных ОПЧ определяют холестерин. Реагент для определения холестерина в составе ОПЧ в соответствии с вышеописанным способом коммерчески доступен JIMRO Co., Ltd., (продукт: Набор для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II) (см. непатентные документы № 1 и 2). Иммуноадсорбционный способ определения Х-ОПЧ получил пункты в системе медицинского страхования от Министерства Здравоохранения, Труда и Социального Обеспечения Японии.
Однако вышеописанный способ подразумевает применение аффинной хроматографии с использованием антител и требует предварительного разделения компонентов пробы, что делает его трудоемким и требующим значительных временных затрат.
Известен также простой и чувствительный способ определения Х-ОПЧ без разделения компонентов пробы (см. патентный документ № 1).
Патентный документ № 1:
Опубликованная нерассмотренная патентная заявка Японии № 231597/01.
Непатентный документ № 1:
Arteriosclerosis, 25 (9, 10), 371 (1998).
Непатентный документ № 2:
Clinical Chemistry, 48 (2), 217.
РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ЗАДАЧИ, НА РЕШЕНИЕ КОТОРЫХ НАПРАВЛЕНО ИЗОБРЕТЕНИЕ
Целью настоящего изобретения является разработка способа, реагента и набора для простого и чувствительного определения Х-ОПЧ без разделения компонентов пробы.
СРЕДСТВА РЕШЕНИЯ ПОСТАВЛЕННЫХ ЗАДАЧ
Настоящее изобретение было сделано на основании того факта, что холестеринэстераза и холестериноксидаза или холестериндегидрогиназа специфически действуют на остаточно-подобные частицы в присутствии комбинации определенных поверхностно-активных веществ (далее сокращаемых как ПАВ) и фосфолипид-гидролизующего фермента. Настоящее изобретение относится к следующим пунктам с 1 по 20.
1. Способ количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, включающий в себя: введение исследуемой пробы в буфере на водной основе и в присутствии (а) (i) комбинации одного или более типов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, включающей: сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена, полиоксиэтилен-стиролсодержащий фениловый эфир и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир, содержащий длинную разветвленную алкильную группу (далее обозначается как ПАВ (d1)), и одного или более типов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, включающей в себя: полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкилариловый эфир, полиоксиэтиленалкилариловый эфир, полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир, содержащий короткую разветвленную алкильную группу (далее обозначается как ПАВ (d2)), либо (ii) комбинации сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена (далее обозначается как ПАВ (d3)) и одного либо двух типов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, включающей в себя: полиоксиэтиленалкилариловый эфир, полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир, содержащий короткую разветвленную алкильную группу (далее обозначается как ПАВ (d4)), и (b) фосфолипид-гидролизующего фермента во взаимодействие с (c) холестеринэстеразой и холестериноксидазой либо (d) холестеринэстеразой и холестериндегидрогеназой в присутствии окисленной формы кофермента, в результате которого холестеринэстераза и холестериноксидаза либо холестериндегидрогеназа действуют на холестерин в составе ОПЧ с образованием пероксида водорода либо восстановленной формы кофермента соответственно, которые и определяются на втором этапе анализа.
2. Способ в соответствии с вышеприведенным п.1, в котором определение образовавшегося пероксида водорода проводится за счет взаимодействия последнего в присутствии пероксидазы с хромогеном, приобретающим/изменяющим цвет в ходе окисления, с последующим определением образовавшегося красителя.
3. Способ в соответствии с вышеприведенным п.1, в котором определение восстановленной формы кофермента проводится путем измерения поглощения реакционной смеси.
4. Способ в соответствии с вышеприведенным п.1, в котором определение образовавшейся восстановленной формы кофермента проводится за счет взаимодействия последнего с хромогеном, приобретающим/изменяющим цвет в ходе восстановления, с последующим определением образовавшегося красителя.
5. Способ в соответствии с любым из вышеприведенных пп.1-4, в котором сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена представляет собой ПАВ общей формулы (I):
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или разветвленную либо неразветвленную алкильную группу).
6. Способ в соответствии с любым из вышеприведенных пп.1-4, в котором фосфолипид-гидролизующий фермент представляет собой фосфолипазу D, фосфолипазу С или фосфолипазу А2.
7. Реагент для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и комбинацию ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо ПАВ (d3) и ПАВ (d4).
8. Реагент в соответствии с вышеприведенным п.7, содержащий реагент для определения пероксида водорода.
9. Реагент для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, холестериндегидрогеназу, окисленную форму кофермента и комбинацию ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо ПАВ (d3) и ПАВ (d4).
10. Реагент в соответствии с вышеприведенным п.9, содержащий реагент для определения восстановленной формы кофермента.
11. Реагент в соответствии с любым из вышеприведенных пп.7-10, в котором сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена представляет собой ПАВ общей формулы (I):
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или разветвленную либо неразветвленную алкильную группу).
12. Реагент в соответствии с любым из вышеприведенных пп.7-11, в котором фосфолипид-гидролизующий фермент представляет собой фосфолипазу D, фосфолипазу С или фосфолипазу А2.
13. Набор для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий первый реагент, включающий в себя ПАВ (d1), и второй реагент, включающий в себя фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу и холестериноксидазу, причем данный набор содержит ПАВ (d2) по крайней мере в одном из двух реагентов.
14. Набор для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий первый реагент, включающий в себя ПАВ (d3), и второй реагент, включающий в себя фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу и холестериноксидазу, причем данный набор содержит ПАВ (d4) по крайней мере в одном из двух реагентов.
15. Набор в соответствии с любым из пп. 13-14, содержащий реагент для определения пероксида водорода по крайней мере в одном из двух реагентов.
16. Набор для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий первый реагент, включающий в себя ПАВ (d1), и второй реагент, включающий в себя фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу и холестериндегидрогеназу, причем данный набор содержит ПАВ (d2) по крайней мере в одном из двух реагентов и окисленную форму кофермента по крайней мере в одном из двух реагентов.
17. Набор для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий первый реагент, включающий в себя ПАВ (d3), и второй реагент, включающий в себя фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу и холестериндегидрогеназу, причем данный набор содержит ПАВ (d4) по крайней мере в одном из двух реагентов и окисленную форму кофермента по крайней мере в одном из двух реагентов.
18. Набор в соответствии с любым из пп. 16-17, дополнительно содержащий реагент для определения восстановленной формы кофермента по крайней мере в одном из двух реагентов.
19. Набор в соответствии с любым из пп. 13, 15, 16 или 18, в котором сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена представляет собой ПАВ общей формулы (I):
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или разветвленную либо неразветвленную алкильную группу).
20. Набор в соответствии с любым из вышеприведенных пп.13-19, в котором фосфолипид-гидролизующий фермент представляет собой фосфолипазу D, фосфолипазу С или фосфолипазу А2.
ЭФФЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение обеспечивает способ, реагент и набор для простого и чувствительного определения Х-ОПЧ без разделения компонентов пробы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг.1 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 4.
Фиг.2 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 5.
Фиг.3 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 6.
Фиг.4 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии со сравнительным примером 2.
Фиг.5 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 11.
Фиг.6 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 12.
Фиг.7 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 13.
Фиг.8 представляет собой диаграмму корреляции между результатами определения Х-ОПЧ, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) и при использовании способа в соответствии с примером 14.
НАИЛУЧШИЕ СПОСОБЫ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В контексте настоящего изобретения термин «остаточно-подобная частица (ОПЧ)» относится к остаткам ЛПОНП и ХМ. Термин «холестерин в составе остаточно-подобных частиц (Х-ОПЧ)» относится к этерифицированному и свободному холестерину в составе ОПЧ. В соответствии с этим Х-ОПЧ относится к этерифицированному холестерину в составе остатков ЛПОНП, свободному холестерину в составе остатков ЛПОНП, этерифицированному холестерину в составе остатков ХМ и свободному холестерину в составе остатков ХМ.
Способ согласно настоящему изобретению может быть использован для определения Х-ОПЧ в таких пробах, как цельная кровь, плазма и сыворотка.
Настоящее изобретение характеризуется тем, что комбинация одного или более типов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, включающей в себя: сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОБ-сополимер»), полиоксиэтилен-стиролсодержащий фениловый эфир (далее сокращаемый как «ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир») и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир, содержащий длинную разветвленную алкильную группу (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой») (далее обозначается как ПАВ (d1)), и одного или более типов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, включающей в себя: полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкилариловый эфир (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир), полиоксиэтиленалкилариловый эфир (далее сокращаемый как «ПОЭ-алкилариловый эфир), полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир) и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир, содержащий короткую разветвленную алкильную группу (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой») (далее обозначается как ПАВ (d2)), либо комбинации сополимера полиоксиэтилена и полиоксипропилена (далее сокращаемого как «ПОЭ-ПОП-сополимер») (далее обозначается как ПАВ (d3)) и одного либо двух типов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, включающей в себя: полиоксиэтиленалкилариловый эфир (далее сокращаемый как «ПОЭ-алкилариловый эфир), полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир) и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиловый эфир, содержащий короткую разветвленную алкильную группу (далее сокращаемый как «ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой») (далее обозначается как ПАВ (d4)), представляет собой превосходное поверхностно-активное вещество, позволяющее используемым в реакции определения холестерина ферментам действовать специфически на Х-ОПЧ в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента.
Т.е. данные комбинации поверхностно-активных веществ позволяют холестеринэстеразе и холестериноксидазе либо холестериндегидрогеназе действовать специфически на Х-ОПЧ в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента.
В соответствии с настоящим изобретением Х-ОПЧ в пробе может быть определен следующим образом: в водной среде в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента и комбинации поверхностно-активных веществ, позволяющих холестеринэстеразе и холестериноксидазе либо холестериндегидрогеназе действовать специфически на Х-ОПЧ, т.е. (i) комбинации ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо (ii) комбинации ПАВ (d3) и ПАВ (d4), исследуемая проба вводится во взаимодействие с (c) холестеринэстеразой и холестериноксидазой либо (d) холестеринэстеразой и холестериндегидрогеназой в присутствии окисленной формы кофермента, в результате которого холинестераза и холестериноксидаза либо холестериндегидрогеназа действуют на Х-ОПЧ с образованием пероксида водорода либо восстановленной формы кофермента соответственно, которые и определяются на втором этапе анализа.
За счет взаимодействия холестеринэстеразы и холестериноксидазы с Х-ОПЧ в присутствии кислорода, этерифицированный холестерин в составе содержащихся в пробе ОПЧ деэтерифицируется до свободного холестерина холестеринэстеразой, после чего кислород под действием холестериноксидазы окисляет свободный холестерин, образовавшийся в результате деэтерификации, и свободный холестерин в составе ОПЧ, с образованием пероксида водорода.
За счет взаимодействия холестеринэстеразы и холестериндегидрогеназы с Х-ОПЧ в присутствии окисленной формы кофермента, этерифицированный холестерин в составе содержащихся в пробе ОПЧ деэтерифицируется до свободного холестерина холестеринэстеразой, после чего окисленная форма кофермента под действием холестериндегидрогеназы окисляет свободный холестерин, образовавшийся в результате деэтерификации, и свободный холестерин в составе ОПЧ, с образованием восстановленной формы кофермента.
Ферментативные реакции проводят в водном растворе, таком как буферный раствор, содержащий холестеринэстеразу и холестериноксидазу либо холестериндегидрогеназу, необходимые для определения холестерина (при использовании холестериндегидрогеназы необходимо присутствие окисленной формы кофермента) в присутствии комбинации ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо комбинации ПАВ (d3) и ПАВ (d4), а также фосфолипид-гидролизующего фермента.
В комбинации ПАВ (d1) и ПАВ (d2) и в комбинации ПАВ (d3) и ПАВ (d4) в качестве ПАВ (d1), ПАВ (d2), ПАВ (d3) и ПАВ (d4) могут быть использованы один или более ПАВ, входящих в состав ПАВ (d1)-ПАВ (d4) согласно определенному ранее.
Примеры комбинаций ПАВ (d1) и ПАВ (d2) приведены в таблицах 1-7.
| ТАБЛИЦА 1 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ТАБЛИЦА 2 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ТАБЛИЦА 3 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ТАБЛИЦА 4 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ТАБЛИЦА 5 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ТАБЛИЦА 6 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ТАБЛИЦА 7 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир |
ПОЭ-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер ПОЭ-стиролсодержащий фениловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с длинной разветвленной алкильной группой |
ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-алкилариловый ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
Среди возможных комбинаций ПАВ (d1) и ПАВ (d2) предпочтительными являются такие комбинации, которые оказывают сильное положительное влияние на способность холестеринэстеразы и холестериноксидазы либо холестериндегидрогеназы действовать специфически на холестерин в составе остаточно-подобных частиц в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента.
Так, предпочтительные комбинации ПОЭ-ПОБ-сополимера и ПАВ (d2) приведены в таблице 1.
Среди возможных комбинаций ПОЭ-ПОБ-сополимера и ПАВ (d2) более предпочтительными являются комбинации, приведенные ниже в таблице 8.
| ТАБЛИЦА 8 | |
| ПАВ (d1) | ПАВ (d2) |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОБ-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
Примеры комбинаций ПАВ (d3) и ПАВ (d4) приведены ниже в таблице 9.
| ТАБЛИЦА 9 | |
| ПАВ (d3) | ПАВ (d4) |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
Среди возможных комбинаций ПАВ (d3) и ПАВ (d4) предпочтительными являются такие комбинации, которые оказывают сильное положительное влияние на способность холестеринэстеразы и холестериноксидазы либо холестериндегидрогеназы действовать специфически на холестерин в составе остаточно-подобных частиц в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента.
Так, комбинации, приведенные ниже в таблице 10, являются предпочтительными.
| ТАБЛИЦА 10 | |
| ПАВ (d3) | ПАВ (d4) |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
| ПОЭ-ПОП-сополимер | ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир с короткой разветвленной алкильной группой |
Определение образовавшихся в результате реакции пероксида водорода или восстановленной формы кофермента проводится способом, который сам по себе является известным.
В случае необходимости реакция может быть проведена в присутствии циклодекстрина или его производного, альбумина либо липопротеин-агрегирующего агента. Использование циклодекстрина или его производного, альбумина либо липопротеин-агрегирующего агента является предпочтительным, поскольку данные агенты ингибируют действие ферментов на холестерин, не входящий в состав остаточно-подобных частиц, т.е. входящий в состав других липопротеинов.
Реакционная смесь для проведения ферментативных реакций может также в случае необходимости содержать активатор ферментов, обычно используемый для активации холестеринэстеразы и холестериноксидазы либо холестериндегидрогеназы, стабилизирующий агент, ингибитор интерференции и различные типы солей для перевода в раствор различных белков биологической пробы, таких как альбумин - при условии, что все эти дополнительные агенты не оказывают отрицательного эффекта на специфичность реакции определения Х-ОПЧ.
Последовательные реакции гидролиза этерифицированного холестерина и последующего окисления либо дегидрогенирования свободного холестерина могут быть успешно проведены в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента и комбинации ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо комбинации ПАВ (d3) и ПАВ (d4). Реакции с участием холестерина могут быть проведены путем введения исследуемой пробы во взаимодействие с поверхностно-активными веществами в водном растворе с последующим добавлением в реакционную смесь фосфолипид-гидролизующего фермента и ферментов, участвующих в деэтерификации и окислении либо дегидрогенировании холестерина. Реакции с участием холестерина могут быть проведены в водном растворе, уже содержащем все необходимые для определения Х-ОПЧ компоненты, либо эти компоненты могут быть разделены на две или более группы, последовательно добавляемые в реакционную смесь. Предпочтительно, определение Х-ОПЧ проводится с использованием описанного ниже набора для определения Х-ОПЧ.
В водной среде холестеринэстераза, холестериноксидаза и холестериндегидрогеназа обычно используются в диапазоне концентраций от 0,001 до 400 Ед/мл, предпочтительно от 0,01 до 200 Ед/мл, более предпочтительно от 0,05 до 100 Ед/мл.
Концентрация фосфолипид-гидролизующего фермента в водной среде особым образом не ограничена, однако предпочтительно составляет от 0,001 до 400 Ед/мл, более предпочтительно от 0,01 до 200 Ед/мл и в особенности предпочтительно от 0,05 до 100 Ед/мл.
В водной среде концентрация каждого из ПАВ (d1), ПАВ (d2), ПАВ (d3) и ПАВ (d4) предпочтительно составляет от 0,001 до 5% (вес/объем), более предпочтительно от 0,005 до 2,5% (вес/объем) и в особенности предпочтительно 0,05 до 1% (вес/объем).
Ферментативные реакции обычно проводятся в диапазоне температур от 10 до 50°С, предпочтительно от 20 до 40°С, и завершаются в диапазоне времени от 2 до 30 мин.
Образовавшийся пероксид водорода определяют, к примеру, вводя последний в реакцию с хромогеном, подвергающимся окислительной конверсии в краситель под действием пероксида водорода в присутствии пероксидазы, с последующим измерением изменения поглощения реакционной смеси при длине волны, соответствующей, к примеру, максимуму поглощения образовавшегося красителя. Пероксид водорода также можно определить, к примеру, вводя последний в реакцию с хемилюминесцентным субстратом, таким как люминол, изолюминол, люцигенин или эфир акридиния, с последующей детекцией выделившейся в виде светового излучения энергии.
Восстановленная форма кофермента может быть определена, к примеру, путем измерения поглощения раствора, содержащего восстановленную форму кофермента, в диапазоне длин волн от 300 и 500 нм, предпочтительно от 330 до 400 нм, более предпочтительно около 340 нм. Восстановленная форма кофермента может быть определена, к примеру, путем введения последней в реакцию с хромогеном, подвергающимся восстановительной конверсии в краситель под действием восстановленной формы кофермента в присутствии диафоразы или переносчика электронов с последующим измерением изменения поглощения реакционной смеси при длине волны, соответствующей, к примеру, максимуму поглощения образовавшегося красителя. Примером переносчика электронов может служить метосульфат 1-метокси-5-метилфеназиния.
Концентрация Х-ОПЧ в пробе может быть вычислена при помощи калибровочной кривой, предварительно полученной с использованием проб с известной концентрацией Х-ОПЧ и отражающей зависимость между концентрацией холестерина и количеством образовавшегося пероксида водорода или восстановленной формы кофермента.
В качестве холестеринэстеразы могут быть использованы ферменты, гидролизующие этерифицированный холестерин, к примеру, собственно холестеринэстераза или липопротеинлипаза. Эти ферменты могут быть выделены из тканей животных или растений, микроорганизмов либо получены с использованием методов генной инженерии и опционально химически модифицированы. Примеры химически модифицированных ферментов включают в себя ферменты, содержащие в своем составе модифицирующие группы, такие как группа, основным компонентом которой является полиэтиленгликоль или полипропиленгликоль; группа, содержащая сополимер полипропиленгликоля и полиэтиленгликоля; группа, включающая в себя водорастворимый полисахарид; сульфопропил-группа; сульфобутил-группа; полиуретановая группа; хелатирующая группа. В особенности предпочтительным является фермент, модифицированный путем введения группы, основным компонентом которой является полиэтиленгликоль. Примеры водорастворимых полисахаридов включают в себя декстран, пуллулан и растворимый крахмал.
Примеры реагентов для химической модификации (химических модификаторов) включают в себя соединения, содержащие в своем составе как модифицирующую группу (см. выше), так и функциональную группу или структуру, способную реагировать с амино-, карбоксил-, сульфгидрильной и т.п. группой модифицируемого фермента. Примеры функциональных групп или структур, способных реагировать с аминогруппой фермента, включают в себя карбоксил-группу, активированные эфирные группы (к примеру, N-гидроксисукцинимидную группу), ангидриды и хлорангидриды карбоновых кислот, альдегидную группу, эпокси-группу, 1,3-пропансультон и 1,4-бутансультон. Примером функциональной группы или структуры, способной реагировать с карбоксильной группой фермента, может служить аминогруппа. Примеры функциональных групп или структур, способных реагировать с сульфгидрильной группой фермента, включают в себя малеимидную группу, дисульфидную и α-галогензамещенные сложноэфирные группы (к примеру, α-йодзамещенную сложноэфирную группу).
Примерами химических модификаторов могут служить модификаторы Sunbright VFM-4101, Sunbright MEAC-50HS и Sunbright MEC-50HS, содержащие N-гидроксисукцинимидную группу и полиэтиленгликоль в качестве основного компонента (производитель - NOF Corporation), модификаторы серий Sunbright АКМ (к примеру, Sunbright АКМ-1510), Sunbright АDМ и Sunbright АСМ, содержащие ангидридную структуру и полиалкиленгликоль в качестве основного компонента (производитель - NOF Corporation), EPOX-3400 и M-EPOX-5000, содержащие эпокси-группу и полиэтиленгликоль в качестве основного компонента (производитель - Sheawater Polymers), ангидрид диэтилентриамин-N,N,N',N'',N''-пентауксусной кислоты, содержащий ангидридную структуру и хелатирующую группу (ангидрид DTPA, Dojindo Laboratories), активированный полиуретан p4000 для полиуретановой модификации (Boehringer Mannheim), декстран Т40 и активированный TCT (Boehringer Mannheim).
Химическая модификация фермента может быть выполнена, к примеру, следующим образом.
Холестеринэстеразу растворяют в буферном растворе pH 8,0 или выше, таком как буфер HEPES, после чего в полученный раствор при температуре от 0 до 55°С добавляют химический модификатор в мольном отношении к холестеринэстеразе от 0,01 до 500. После добавления модификатора реакционную смесь перемешивают от 5 мин до 5 часов. Полученная реакционная смесь может быть использована в энзиматических реакциях согласно настоящему изобретению либо сама по себе, либо, при необходимости, после очистки полученной химически модифицированной холестеринэстеразы от непрореагировавшего химического модификатора путем ультрафильтрации.
Используемая в контексте настоящего изобретения холестериноксидаза может быть выделена из тканей животных или растений, микроорганизмов либо получена с использованием методов генной инженерии и опционально химически модифицирована.
Химически модифицированные ферменты могут быть получены в соответствии с вышеописанным способом химической модификации.
В качестве холестериндегидрогеназы могут быть использованы ферменты, способные приводить к образованию восстановленной формы кофермента в ходе окисления холестерина в присутствии окисленной формы кофермента. Эти ферменты могут быть выделены из тканей животных или растений, микроорганизмов либо получены с использованием методов генной инженерии и опционально химически модифицированы. Химически модифицированные ферменты могут быть получены, к примеру, в соответствии с вышеописанным способом химической модификации и с использованием вышеуказанного химического модификатора.
Что касается фосфолипид-гидролизующего фермента, то на него помимо способности гидролизовать фосфолипиды не накладывается никаких дополнительных специальных ограничений. К примеру, могут быть использованы фосфолипид-гидролизующие ферменты, выделенные из тканей животных или растений, либо из микроорганизмов. Так, примерами фосфолипид-гидролизующих ферментов могут служить фосфолипаза D, фосфолипаза C, фосфолипаза А2 и лизофосфолипаза.
Примерами окисленных форм коферментов, используемых в способе определения холестерина в составе ОПЧ с использованием холестериндегидрогеназы согласно настоящему изобретению, могут служить НАД, НАДФ, тио-НАД и тио-НАДФ.
ПАВ (d1) согласно настоящему изобретению, используемое в комбинации с ПАВ (d2) согласно настоящему изобретению, позволяет холестеринэстеразе и холестериноксидазе либо холестериндегидрогеназе действовать специфически на Х-ОПЧ в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента. Будучи использованным вне комбинации со вторым ПАВ из пары ПАВ (d1) и ПАВ (d2), каждое из них по отдельности необязательно должно оказывать сильное положительное влияние на способность холестеринэстеразы и холестериноксидазы либо холестериндегидрогеназы действовать специфически на Х-ОПЧ.
ПАВ (d3) согласно настоящему изобретению, используемое в комбинации с ПАВ (d4) согласно настоящему изобретению, позволяет холестеринэстеразе и холестериноксидазе либо холестериндегидрогеназе действовать специфически на Х-ОПЧ в присутствии фосфолипид-гидролизующего фермента. Будучи использованным вне комбинации со вторым ПАВ из пары ПАВ (d3) и ПАВ (d4), каждое из них по отдельности необязательно должно оказывать сильное положительное влияние на способность холестеринэстеразы и холестериноксидазы либо холестериндегидрогеназы действовать специфически на Х-ОПЧ.
ПОЭ-ПОБ-сополимеры включают в себя неупорядоченные и блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксибутилена, к примеру, определяемые общей формулой (I):
RO-(C2H4O)A-(C4H8O)B-(C2H4O)C-H (I)
(где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или разветвленную либо неразветвленную алкильную группу) (далее соединения общей формулы (I) обозначаются как соединение (I)). R в общей формуле (I) предпочтительно представляет собой атом водорода.
Неразветвленные и разветвленные алкильные группы в соединении (I) включают в себя алкильные группы, содержащие от 1 до 30 атомов углерода, такие как метил-, этил-, пропил-, изопропил-, бутил-, изобутил-, трет-бутил-, пентил-, изопентил-, неопентил-, гексил-, изогексил-, гептил-, изогептил-, октил-, изооктил-, нонил-, изононил-, децил-, изодецил-, ундецил-, изоундецил-, додецил-, изододецил-, тридецил-, изотридецил-, тетрадецил-, изотетрадецил-, пентадецил-, изопентадецил-, гексадецил-, изогексадецил-, гептадецил-, изогептадецил-, октадецил-, изооктадецил-, нонадецил-, изононадецил-, эйкозил-, изоэйкозил-, генэйкозил-, изогенэйкозил-, докозил-(бегенил-), изодокозил-, трикозил-, изотрикозил-, тетракозил-, изотетракозил-, пентакозил-, изопентакозил-, гексакозил-, изогексакозил-, гептакозил-, изогептакозил-, октакозил-, изооктакозил-, нонакозил-, изононакозил-, триаконтил- и изотриаконтил-группы.
Молекулярный вес полиоксибутиленового фрагмента предпочтительно составляет 700 и более, более предпочтительно 1000 и более, в особенности предпочтительно 1500 и более.
Частные примеры соединения (I) включают в себя Plonon B-204 и Plonon B-208 (производитель - NOF Corporation).
Примерами ПОЭ-стиролсодержащих фениловых эфиров могут служить коммерчески доступные BLAUNON DSP-9, BLAUNON DSP-12,5, BLAUNON DSP-20, BLAUNON DSP-10, BLAUNON TSP-5, BLAUNON TSP-7.5, BLAUNON TSP-16, BLAUNON TSP-20 и BLAUNON TSP-50 (производитель - Aoki Oil Industrial Co., Ltd.).
Длинные разветвленные алкильные группы в ПОЭ-ПОП-алкиловом эфире с длинной разветвленной алкильной группой включают в себя, к примеру, разветвленные алкильные группы, содержащие от 20 до 30 атомов углерода, такие как изоэйкозил-, изогенэйкозил-, изодокозил-, изотрикозил-, изотетракозил-, изопентакозил-, изогексакозил-, изогептакозил-, изооктакозил-, изононакозил- и изотриаконтил-группы. Примером ПОЭ-ПОП-алкилового эфира с длинной разветвленной алкильной группой может служить коммерчески доступный UNILIB MT-0620B (производитель - NOF Сorporation).
Алкильные группы в ПОЭ-ПОП-алкилариловом и ПОЭ-алкилариловом эфирах включают в себя, к примеру, алкильные группы, содержащие 8 и более атомов углерода, такие как октил- и нонил-группы. Арильные группы в ПОЭ-ПОП-алкилариловом и ПОЭ-алкилариловом эфирах включают в себя, к примеру, фенил- и нафтил-группы. Фенильная группа является предпочтительной арильной группой.
Алкильные группы в ПОЭ-ПОП-алкиловом эфире включают в себя, к примеру, алкильные группы, содержащие от 6 до 30 атомов углерода, такие как гексил-, гептил-, октил-, нонил-, децил-, ундецил-, додецил- (лаурил-), тридецил-, тетрадецил- (миристил-), пентадецил-, изопентадецил-, гексадецил- (цетил-), гептадецил-, октадецил- (стеарил-), нонадецил-, изононадецил-, эйкозил-, генэйкозил-, докозил-(бегенил-), трикозил-, тетракозил-, пентакозил-, гексакозил-, гептакозил-, октакозил-, нонакозил- и триаконтил-группы.
Короткие разветвленные алкильные группы в ПОЭ-ПОП-алкиловом эфире с короткой разветвленной алкильной группой включают в себя, к примеру, разветвленные алкильные группы, содержащие от 6 до 19 атомов углерода, такие как изогексил-, изогептил-, изооктил-, изононил-, изодецил-, изоундецил-, изододецил-, изотридецил-, изотетрадецил-, изопентадецил-, изогексадецил-, изогептадецил, изооктадецил- и изононадецил-группы.
Примером ПОЭ-ПОП-алкиларилового эфира может служить полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкилфениловый эфир. Частные примеры включают в себя коммерчески доступные Emulgen L-40 (производитель - Kao Corporation) и Acronesess KP-189R (производитель - NOF Corporation).
Примером ПОЭ-алкиларилового эфира может служить полиоксиэтиленалкилфениловый эфир. Частные примеры включают в себя коммерчески доступные Emulgen 911 и Emulgen 810 (производитель - Kao Corporation), а также Nonion HS-210, Nonion HS-215, Nonion HS-208.5 и Nonion HS-208 (производитель - NOF Corporation).
Среди всех ПОЭ-ПОП-алкиловых эфиров и ПОЭ-ПОП алкиловых эфировых с разветвленной алкильной группой предпочтительными являются те, значения гидрофильно-липофильного баланса которых составляют от 9 до 20. Частные примеры ПОЭ-ПОП-алкиловых эфиров включают в себя коммерчески доступные Wondersurf RL-100 и Wondersurf S-1000 (производитель - Aoki Oil Industrial Co., Ltd.). Частные примеры ПОЭ-ПОП-алкиловых эфиров с короткой разветвленной группой включают в себя коммерчески доступные Wondersurf ID-70 и Wondersurf ID-90 (производитель - Aoki Oil Industrial Co., Ltd.).
ПОЭ-ПОП-сополимеры включают в себя неупорядоченные и блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена, к примеру, определяемые общей формулой (II):
RO-(C2H4O)A-(C3H6O)B-(C2H4O)C-H (II)
(где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или разветвленную либо неразветвленную алкильную группу) (далее соединения общей формулы (II) обозначаются как соединение (II)). R в общей формуле (II) предпочтительно представляет собой атом водорода.
Неразветвленные и разветвленные алкильные группы в соединении (II) включают в себя те же алкильные группы, что и в описанном выше соединении (I).
Молекулярный вес полиоксипропиленового фрагмента предпочтительно составляет 2050 и более, более предпочтительно 2750 и более, в особенности предпочтительно 3250 и более.
Частные примеры соединения (II) включают в себя коммерчески доступные Pluronic F-108, Pluronic L-121, Pluronic L-122, Pluronic L-101 и Pluronic L-103 (производитель - Adeka Corporation), а также Plonon 102, Plonon 104, Plonon 201, Plonon 204, Plonon 208 и Plonon 202B (производитель - NOF Corporation).
Примеры водных сред включают в себя деионизованную воду, дистиллированую воду и буферный раствор, предпочтительной водной средой является буферный раствор. Примеры буферных систем, которые могут быть использованы в приготовлении буферных растворов, включают в себя трис(гидроксиметил)аминометановый буфер, фосфатный буфер, боратный буфер и буфер Гуда.
Примеры буферных систем Гуда включают в себя 2-(N-морфолино)этансульфоновую кислоту (MES), бис(2-гидроксиэтил)иминотрис(гидроксиметил)метан (Bis-Tris), N-(2-ацетамидо)иминодиуксусную кислоту (ADA), пиперазин-N,N'-бис(2-этансульфоновую кислоту) (PIPES), N-(2-ацетамидо)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (ACES), 3-морфолин-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (MOPSO), N,N-бис(2-гидроксиэтил)-2-аминоэтансульфоновую кислоту (BES), 3-морфолинопропансульфоновую кислоту (MOPS), N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-аминоэтансульфоновую кислоту (TES), 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]этансульфоновую кислоту (HEPES), 3-[N,N-бис(2-гидроксиэтил)aмино]-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (DIPSO), N-[трис(гидроксиметил)метил]-2-гидрокси-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPSO), пиперазин-N,N'-,бис(2-гидроксипропан-3-сульфоновую кислоту) (POPSO), 3-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинил]-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (HEPPSO), 3-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазининил]пропансульфоновую кислоту [(H)EPPS], N-[трис(гидроксиметил)метил]глицин (Tricine), N,N-бис(2-гидроксиэтил)глицин (Bicine), N-трис(гидроксиметил)метил-3-аминопропансульфоновую кислоту (TAPS), N-циклогексил-2-аминоэтансульфоновую кислоту (CHES), N-циклогексил-3-амино-2-гидроксипропансульфоновую кислоту (CAPSO) и N-циклогексил-3-аминопропансульфоновую кислоту (CAPS).
pH буферного раствора обычно составляет от 4 до 10, предпочтительно от 5 до 9, и концентрация буферизующего компонента в растворе обычно составляет от 0,001 до 0,5 моль/л, предпочтительно от 0,005 до 0,2 моль/л, более предпочтительно от 0,01 до 0,1 моль/л.
Хромогены, используемые для определения пероксида водорода, представляют собой, к примеру, хромогены, подвергающиеся окислительной конверсии в краситель под действием пероксида водорода в присутствии пероксидазы. Примерами хромогенов могут служить хромогены лейко-типа, а также хромогены, приобретающие свойства красителя в ходе реакции окислительного присоединения. Хромоген лейко-типа представляет собой соединение, способное осуществлять аутоконверсию в краситель в присутствии пероксида водорода и пероксидативного реагента, такого как пероксидаза.
Примерами хромогенов лейко-типа могут служить 10-N-карбоксиметилкарбамоил-3,7-бис(диметиламино)-10H-фенотиазин (CCAP), 10-(N-метилкарбамоил)-3,7-бис(диметиламино)-10H-фенотиазин (MCDP), натриевая соль N-(карбоксиметиламинокарбoнил)-4,4'-бис(диметиламино)дифениламина (DA-64), 4,4'-бис(диметиламино)дифениламин и бис[3-бис(4-хлорфенил)метил-4-диметиламинофенил]амин (BCMA).
Хромогены второго из вышеуказанных типов приобретают свойства красителя в ходе реакции окислительного присоединения к некоторому второму компоненту в присутствии пероксида водорода и пероксидативного реагента, такого как пероксидаза. Примерами вторых компонентов могут служить анилин и фенол.
Примерами хромогенов, приобретающих свойства красителя в ходе реакции окислительного присоединения, могут служить 4-аминоантипирин (4-AA) и 3-метил-2-бензотиазолинонгидрaзин. Примеры анилинов включают в себя N-(3-сульфопропил)анилин, N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3-метиланилин (TOOS), N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметиланилин (MAOS), N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилин (DAOS), N-этил-N-(3-сульфопропил)-3-метиланилин (TOPS), N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилин (HDAOS), N,N-диметил-3-метиланилин, N,N-ди(3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилин, N-этил-N-(3-сульфопропил)-3-метоксианилин, N-этил-N-(3-сульфопропил)анилин, N-этил-N-(3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилин, N-(3-сульфопропил)-3,5-диметоксианилин, N-этил-N-(3-сульфопропил)-3,5-диметиланилин, N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-3-метоксианилин, N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)анилин, N-этил-N-(3-метилфенил)-N'-сукцинилэтилeндиамин (EMSE), N-этил-N-(3-метилфенил)-N'-ацетилэтилeнeдиамин и N-этил-N-(2-гидрокси-3-сульфопропил)-4-фтор-3,5-диметоксианилин (F-DAOS). Примеры фенолов включают в себя фенол, 4-хлорфенол, 3-метилфенол и 3-гидрокси-2,4,6-трийодбензойную кислоту (HTIB).
Пероксидаза обычно используется в диапазоне концентраций от 1 до 100 кЕд/л. Хромоген обычно используется в диапазоне концентраций от 0,01 до 10 г/л.
Хромогены, используемые для определения восстановленной формы кофермента, представляют собой, к примеру, хромогены, подвергающиеся восстановительной конверсии в краситель под воздействием восстановленной формы кофермента в присутствии диафоразы или переносчика электронов. Примеры подобных хромонов включают в себя бромид 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия (MTT) и мононатриевые соли 2-(4-йодфенил)-3-(4-нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолия (WST-1) и 2-(4-йодфенил)-3-(2,4-динитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2H-тетразолия (WST-3).
Диафораза и переносчик электронов обычно используются в диапазоне концентраций от 1 до 100 кЕд/л. Хромоген обычно используется в диапазоне концентраций от 0,01 до 10 г/л.
Примерами циклодекстрина или его производных могут служить циклодекстрин, диметилциклодекстрин, триметилциклодекстрин, гидроксиэтилциклодекстрин, гидроксипропилциклодекстрин, карбоксиметилциклодекстрин, гликозилциклодекстрин, мальтозилциклодекстрин, циклодекстринсульфат и полициклодекстрин, предпочтительными являются гидроксиэтилциклодекстрин и гидроксипропилциклодекстрин.
Примерами циклодекстрина могут служить α-циклодекстрин, β-циклодекстрин и γ-циклодекстрин.
Примерами диметилциклодекстрина могут служить диметил-α-циклодекстрин, диметил-β-циклодекстрин и диметил-γ-циклодекстрин.
Примерами триметилциклодекстрина могут служить триметил-α-циклодекстрин, триметил-β-циклодекстрин и триметил-γ-циклодекстрин.
Примерами гидроксиэтилциклодекстрина могут служить гидроксиэтил-α-циклодекстрин, гидроксиэтил-β-циклодекстрин и гидроксиэтил-γ-циклодекстрин.
Примерами гидроксипропилциклодекстрина могут служить гидроксипропил-α-циклодекстрин, гидроксипропил-β-циклодекстрин и гидроксипропил-γ-циклодекстрин.
Примерами карбоксиметилциклодекстрина могут служить карбоксиметил-α-циклодекстрин, карбоксиметил-β-циклодекстрин и карбоксиметил-γ-циклодекстрин.
Примерами гликозилметилциклодекстрина могут служить гликозилметил-α-циклодекстрин, гликозилметил-β-циклодекстрин и гликозилметил-γ-циклодекстрин.
Примерами мальтозилметилциклодекстрина могут служить мальтозилметил-α-циклодекстрин, мальтозилметил-β-циклодекстрин и мальтозилметил-γ-циклодекстрин.
Примерами циклодекстринсульфата могут служить α-циклодекстринсульфат, β-циклодекстринсульфат и γ-циклодекстринсульфат.
Примером полициклодекстрина может служить поли-β-циклодекстрин. Два или более циклодекстринов и/или их производного могут быть использованы в комбинации.
В водной среде концентрация циклодекстрина или его производного предпочтительно составляет от 0,001 до 5% (вес/объем), более предпочтительно от 0,005 до 2,5% (вес/объем) и в особенности предпочтительно 0,01 до 1% (вес/объем).
Примеры альбумина включают в себя альбумин, полученный из тканей коров, лошадей, овец и человека, предпочтительным является использование бычьего сывороточного альбумина (BSA). Также может быть использован альбумин, полученный методами генной инженерии. Два или более типа альбуминов могут быть использованы в комбинации. В водной среде концентрация альбумина предпочтительно составляет от 0,001 до 5% (вес/объем), более предпочтительно от 0,005 до 2,5% (вес/объем) и в особенности предпочтительно 0,01 до 1% (вес/объем).
Примеры липопротеин-агрегирующих агентов включают в себя полианионы, такие как фосфовольфрамат-анион, декстрансульфат и гепарин, а также соли двухвалентных металлов, таких как магний, кальций и кобальт. В водной среде концентрация липопротеин-агрегирующего агента предпочтительно составляет от 0,001 до 5% (вес/объем) (для каждого из компонентов (полианион, соль металла и т.п.)), более предпочтительно от 0,005 до 2,5% (вес/объем) и в особенности предпочтительно 0,01 до 1% (вес/объем).
Примеры активаторов ферментов включают в себя анионные поверхностно-активные вещества, такие как желчные кислоты и алкилсульфонаты. Примерами желчных кислот могут служить холевая кислота, дезоксихолевая кислота, таурохолевая кислота и хенодезоксихолевая кислота. Примерами алкилсульфонатов могут служить 1-пентасульфонат, 1-гексасульфонат, 1-гептасульфонат и 1-октасульфонат. Примерами солей алкилсульфонатов могут служить соли аммония, лития, натрия, калия, магния и кальция.
Примерами стабилизирующих агентов могут служить ЭДТУ (этилендиаминтетрауксусная кислота), сахароза и хлорид кальция.
Примерами антисептиков могут служить азид натрия и антибиотики.
Примеры ингибиторов интерференции включают в себя аскорбатоксидазу для ингибирования эффекта аскорбиновой кислоты и гексацианоферрат (II) калия для ингибирования эффекта билирубина.
Примерами солей могут служить хлорид лития, сульфат лития, хлорид натрия, сульфат натрия, хлорид калия, сульфат калия, хлорид магния, сульфат магния, ацетат магния, нитрат магния, хлорид аммония и нитрат кальция.
Некоторые воплощения способа определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению проиллюстрированы ниже.
СПОСОБ 1
Способ, подразумевающий:
проведение ферментативной реакции в водной среде в присутствии исследуемой пробы, фосфолипид-гидролизующего фермента, ПАВ (d1), ПАВ (d2), холестеринэстеразы и холестериноксидазы;
определение образовавшегося пероксида водорода; и
определение концентрации Х-ОПЧ в пробе, исходя из значения, полученного на этапе (2), и предварительно построенной калибровочной кривой.
СПОСОБ 2
Способ, подразумевающий:
проведение ферментативной реакции в водной среде в присутствии исследуемой пробы, фосфолипид-гидролизующего фермента, ПАВ (d3), ПАВ (d4), холестеринэстеразы и холестериноксидазы;
определение образовавшегося пероксида водорода; и
определение концентрации Х-ОПЧ в пробе, исходя из значения, полученного на этапе (2), и предварительно построенной калибровочной кривой.
СПОСОБ 3
Способ, подразумевающий:
проведение ферментативной реакции в водной среде в присутствии исследуемой пробы, фосфолипид-гидролизующего фермента, ПАВ (d1), ПАВ (d2), холестеринэстеразы, окисленной формы кофермента и холестериндегидрогеназы;
определение образовавшейся восстановленной формы кофермента; и
определение концентрации Х-ОПЧ в пробе, исходя из значения, полученного на этапе (2), и предварительно построенной калибровочной кривой.
СПОСОБ 4
Способ, подразумевающий:
проведение ферментативной реакции в водной среде в присутствии исследуемой пробы, фосфолипид-гидролизующего фермента, ПАВ (d3), ПАВ (d4), холестеринэстеразы, окисленной формы кофермента и холестериндегидрогеназы;
определение образовавшейся восстановленной формы кофермента; и
определение концентрации Х-ОПЧ в пробе, исходя из значения, полученного на этапе (2), и предварительно построенной калибровочной кривой.
РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Х-ОПЧ
В одном из воплощений настоящего изобретения реагент для определения Х-ОПЧ содержит фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и комбинацию ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо комбинацию ПАВ (d3) и ПАВ (d4). Данный реагент может также содержать реагент для определения пероксида водорода. Примером реагента для определения пероксида водорода может служить реагент, содержащий пероксидазу и вышеописанный хромоген, подвергающийся окислительной конверсии в краситель под действием пероксида водорода в присутствии пероксидазы.
В одном воплощении настоящего изобретения реагент для определения Х-ОПЧ содержит фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериноксидазу и комбинацию ПАВ (d1) и ПАВ (d2) либо комбинацию ПАВ (d3) и ПАВ (d4). Данный реагент может также содержать реагент для определения восстановленной формы кофермента. Примером реагента для определения восстановленной формы кофермента может служить реагент, содержащий диафоразу или переносчик электронов и вышеописанный хромоген, подвергающийся восстановительной конверсии в краситель под действием восстановленной формы кофермента в присутствии диафоразы или переносчика электронов.
Некоторые воплощения реагента для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению проиллюстрированы ниже.
РЕАГЕНТ 1
Реагент, содержащий холестеринэстеразу, холестериноксидазу, ПАВ (d1), ПАВ (d2) и реагент для определения пероксида водорода.
РЕАГЕНТ 2
Реагент, содержащий холестеринэстеразу, холестериноксидазу, ПАВ (d3), ПАВ (d4) и реагент для определения пероксида водорода.
РЕАГЕНТ 3
Реагент, содержащий холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериндегидрогеназу, ПАВ (d1) и ПАВ (d2).
РЕАГЕНТ 4
Реагент, содержащий холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериндегидрогеназу, ПАВ (d3) и ПАВ (d4).
РЕАГЕНТ 5
Реагент, содержащий холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериндегидрогеназу, ПАВ (d1), ПАВ (d2) и реагент для определения восстановленной формы кофермента.
РЕАГЕНТ 6
Реагент, содержащий холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериндегидрогеназу, ПАВ (d3), ПАВ (d4) и реагент для определения восстановленной формы кофермента.
НАБОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Х-ОПЧ
Реагент для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению предпочтительно хранится, распространяется и используется в составе набора. Набор может включать в себя два или три реагента, предпочтительно набор включает в себя два реагента.
В наборе, состоящем из двух реагентов (первый реагент и второй реагент), холестеринэстераза и холестериноксидаза или холестериндегидрогеназа могут содержаться в различных реагентах, однако предпочтительно они содержаться в одном реагенте, особенно предпочтительно - во втором. Фосфолипид-гидролизующий фермент может содержаться в любом из двух реагентов либо в обоих реагентах, однако предпочтительно он содержится во втором реагенте.
ПАВ (d1) и ПАВ (d2) могут содержаться в любом из двух реагентов либо в обоих реагентах, однако ПАВ (d1) предпочтительно содержится в первом реагенте. ПАВ (d3) и ПАВ (d4) могут содержаться в любом из двух реагентов либо в обоих реагентах, однако ПАВ (d3) предпочтительно содержится в первом реагенте.
Окисленная форма кофермента содержится по крайней мере в одном из двух реагентов. Реагент для определения пероксида водорода содержится по крайней мере в одном из двух реагентов, однако в случае использования хромогена, приобретающего свойства красителя в ходе реакции окислительного присоединения, два компонента, формирующих краситель в ходе окислительного присоединения, предпочтительно содержатся в разных реагентах. Реагент для определения восстановленной формы кофермента содержится по крайней мере в одном из двух реагентов.
Некоторые воплощения набора для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению проиллюстрированы ниже.
НАБОР 1
Первый реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d1) и часть компонентов реактива для определения пероксида водорода.
Второй реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d2), фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и не вошедшую в первый реагент часть компонентов реагента для определения пероксида водорода.
НАБОР 2
Первый реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d3) и часть компонентов реактива для определения пероксида водорода.
Второй реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d4), фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и не вошедшую в первый реагент часть компонентов реагента для определения пероксида водорода.
НАБОР 3
Первый реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d1).
Второй реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d2), фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента и холестериндегидрогеназу.
НАБОР 4
Первый реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d3).
Второй реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d4), фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента и холестериндегидрогеназу.
НАБОР 5
Первый реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d1).
Второй реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d2), фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериндегидрогеназу и реагент для определения восстановленной формы кофермента.
НАБОР 6
Первый реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d3).
Второй реагент
Реагент, содержащий ПАВ (d4), фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, окисленную форму кофермента, холестериндегидрогеназу и реагент для определения восстановленной формы кофермента.
Реагент и набор для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению могут быть использованы для определения Х-ОПЧ в пробе.
Описанные выше в контексте способа определения Х-ОПЧ фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстераза, холестериноксидаза, окисленная форма кофермента, холестериндегидрогеназа, ПАВ (d1), ПАВ (d2), ПАВ (d3), ПАВ (d4), реагент для определения пероксида водорода и реагент для определения восстановленной формы кофермента могут быть использованы в качестве компонентов реагента и набора для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению.
Реагент и набор для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению могут также при необходимости содержать вышеописанные буферный раствор на водной основе, циклодекстрин или его производное, альбумин, липопротеин-агрегирующий агент, активатор фермента, стабилизирующий агент, антисептик, ингибитор интерференции, а также различные соли для перевода в раствор белков биологической пробы, таких как глобулин.
Реагент и набор для определения Х-ОПЧ согласно настоящему изобретению содержат ферменты и два типа поверхностно-активных веществ в количествах, определенных выше в контексте описания способа определения Х-ОПЧ.
Некоторые воплощения настоящего изобретения проиллюстрированы в нижеследующих примерах, которые не должны рассматриваться как каким-либо образом ограничивающие объем настоящего изобретения. В практическом воплощении нижеследующих примеров были использованы оборудование и реактивы нижеследующих производителей:
MOPS (буфер Гуда, Dojindo Laboratories), TOOS (реагент Триндера (хромоген, приобретающий свойства красителя в ходе реакции окислительного присоединения), Dojindo Laboratories), 4-аминоантипирин (Nakalai Tesque, Inc.), сульфат натрия (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Plonon B-208 (ПОЭ-ПОБ-сополимер, ПАВ (d1), NOF Corporation), Plonon B-204 (ПОЭ-ПОБ-сополимер, ПАВ (d1), NOF Corporation), Wondersurf RL-100 (ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир, ПАВ (d2), Aoki Oil Industrial Co., Ltd.), Wondersurf ID-70 (ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир c короткой разветвленной алкильной группой, ПАВ (d2), Aoki Oil Industrial Co., Ltd.), Wondersurf ID-90 (ПОЭ-ПОП-алкиловый эфир c короткой разветвленной алкильной группой, ПАВ (d2), Aoki Oil Industrial Co., Ltd.), Emulgen L-40 (ПОЭ-ПОП-алкилариловый эфир, ПАВ (d2), Kao Corporation), Pluronic F-108 (ПОЭ-ПОП-сополимер, ПАВ (d1), Adeka Corporation), фосфолипаза D (Asahi Kasei Corporation), холестериноксидаза (CHOD, Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), холестеринэстераза (CHER, Toyobo Co., Ltd.), пероксидаза (POD, Toyobo Co., Ltd.) и аскорбатоксидаза (AOD, Asahi Kasei Corporation).
ПРИМЕР 1
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-208 | 8 г/л | |
| Wondersurf RL-100 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Wondersurf RL-100 | 1 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 2
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-204 | 8 г/л | |
| Wondersurf ID-70 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Wondersurf ID-70 | 1 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 3
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-208 | 8 г/л | |
| Emulgen L-40 | 2 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Emulgen L-40 | 3 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 1
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов. Состав данной композиции взят из примера 1 опубликованной нерассмотренной патентной заявки Японии № 231597/01.
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Pluronic F-108 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Emulgen L-40 | 2 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 4
Определение Х-ОПЧ
Определение Х-ОПЧ в 64 свежих пробах сывороток крови человека было проведено на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 с использованием набора согласно примеру 1 по следующей методике.
(1) Построение калибровочной кривой.
В качестве стандартной сыворотки использовалась сыворотка с концентрацией Х-ОПЧ 32,4 мг/дл (концентрацию стандартного раствора определяли с использованием набора «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.)); в качестве проб для построения калибровочной кривой использовались подходящие разведения стандартной сыворотки.
Калибровочную кривую строили путем определения концентрации Х-ОПЧ в каждом из разведений стандартной сыворотки на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 с использованием набора согласно примеру 1 по следующей методике.
В реакционную ячейку помещали 3,8 мкл разведения сыворотки и 0,18 мкл первого реагента, после чего полученную смесь инкубировали при 37°С 5 мин. Поглощение реакционной массы (Е1) измеряли при длине главной волны 600 нм и длине субволны 700 нм (фотометрическая точка: 16). Далее к реакционной массе добавляли 0,06 мл предварительно нагретого до 37°С второго реагента, после чего полученную смесь вновь инкубировали при 37°С 5 мин и поглощение реакционной массы (Е2) измеряли при длине главной волны 600 нм и длине субволны 700 нм (фотометрическая точка: 32). Калибровочную кривую строили на основании зависимости между изменениями поглощения в ходе реакции (Е2-Е1) и концентрациями Х-ОПЧ в разведениях стандартной сыворотки.
(2) Определение Х-ОПЧ в свежей сыворотке крови человека (64 пробы)
Реакцию проводили аналогично описанному в п.1 настоящего примера с использованием аликвот 64 свежих сывороток крови человека вместо разведений стандартной сыворотки и концентрацию Х-ОПЧ в каждой из проб определяли исходя из поглощения реакционной смеси после проведения реакции с использованием калибровочной кривой, построенной согласно описанному в п.1.
ПРИМЕР 5
Определение Х-ОПЧ
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 64 свежих сывороток крови человека, использованных в примере 4, определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 аналогично описанному в примере 4 с использованием набора согласно примеру 2 вместо набора согласно примеру 1.
ПРИМЕР 6
Определение Х-ОПЧ
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 64 свежих сывороток крови человека, использованных в примере 4, определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 аналогично описанному в примере 4 с использованием набора согласно примеру 3 вместо набора согласно примеру 1.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР 2
Определение Х-ОПЧ
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 64 свежих сывороток крови человека, использованных в примере 4, определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 аналогично описанному в примере 4 с использованием набора согласно сравнительному примеру 1 вместо набора согласно примеру 1.
ТЕСТОВЫЙ ПРИМЕР 1
Корреляция с результатами, полученными с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.)
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из вышеупомянутых 64 свежих сывороток крови человека определяли с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.).
Корреляция результатов определения Х-ОПЧ, полученных с использованием способов согласно примерам 4-6 и сравнительному примеру 2 с одной стороны, и результатов определения Х-ОПЧ, полученных с использованием набора «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) с другой, была исследована путем расчета коэффициента корреляции. Полученные значения коэффициента корреляции приведены в таблице 11. Соответствующие диаграммы корреляции приведены на фигурах 1-4.
| ТАБЛИЦА 11 | |
| Способ определения | Коэффициент корреляции с результатами измерений, полученными с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II |
| Пример 4 | 0,9513 |
| Пример 5 | 0,9447 |
| Пример 6 | 0,9319 |
| Сравнительный пример 2 | 0,9253 |
Как видно из таблицы 11, по сравнению с результатами измерений, полученными с использованием способа согласно сравнительному примеру 2 (определение проводилось с использованием набора согласно примеру 1 опубликованной нерассмотренной патентной заявки Японии № 231597/01), результаты измерений, полученные с использованием способов согласно настоящему изобретению, демонстрируют хорошую корреляцию с таковыми, полученными с использованием «JIMRO» II.
ТЕСТОВЫЙ ПРИМЕР 2
Определение Х-ОПЧ в сыворотках крови пациентов с гиперлипидемией III типа
Концентрацию Х-ОПЧ в сыворотках крови пациентов с гиперлипидемией III типа определяли с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.), а также с использованием наборов согласно примерам 1-3 и сравнительному примеру 1. В качестве стандартной сыворотки использовалась сыворотка с концентрацией Х-ОПЧ 32,4 мг/дл (концентрацию стандартного раствора определяли с использованием набора «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.)); в качестве проб для построения калибровочной кривой использовались подходящие разведения стандартной сыворотки. Результаты приведены в таблице 12.
| ТАБЛИЦА 12 | |
| Набор | Концентрация Х-ОПЧ в сыворотках крови пациентов с гиперлипидемией III типа (мг/дл) |
| Пример 1 | 28,6 |
| Пример 2 | 31,4 |
| Пример 3 | 26,5 |
| Сравнительный пример 1 | 20,0 |
| JIMRO | 18,8 |
Известно, что уровень остатков ЛПОНП особенно высок в сыворотках крови пациентов с гиперлипидемией III типа. Как видно из таблицы 12, реактивность на холестерин в остатках ЛПОНП при использовании способов определения согласно настоящему изобретению улучшена по сравнению со способом согласно сравнительному примеру 1 (в котором определение проводилось с использованием набора согласно примеру 1 опубликованной нерассмотренной патентной заявки Японии № 231597/01). Также видно, что реактивность на Х-ОПЧ при использовании способов определения согласно настоящему изобретению выше, нежели при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II.
ПРИМЕР 7
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-208 | 8 г/л | |
| Emulgen L-40 | 1 г/л | |
| Wondersurf ID-70 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент |
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Wondersurf ID-70 | 1 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 8
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-208 | 8 г/л | |
| Emulgen L-40 | 1 г/л | |
| Wondersurf ID-70 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Wondersurf ID-70 | 1 г/л | |
| Emulgen L-40 | 1 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 9
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-208 | 8 г/л | |
| Emulgen L-40 | 1 г/л | |
| Wondersurf ID-90 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Wondersurf ID-90 | 1 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 10
Набор для определения Х-ОПЧ
Был сделан набор для определения Х-ОПЧ, состоящий из нижеследующих первого и второго реагентов:
| Первый реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| TOOS | 0,3 г/л | |
| Сульфат натрия | 2 г/л | |
| Plonon B-208 | 8 г/л | |
| Emulgen L-40 | 1 г/л | |
| Wondersurf ID-90 | 1 г/л | |
| Пероксидаза (POD) | 10 Ед/мл | |
| Аскорбатоксидаза (AOD) | 2 Ед/мл | |
| Второй реагент | ||
| MOPS (pH 6,8) | 20 ммоль/л | |
| 4-аминоантипирин | 0,5 г/л | |
| Wondersurf ID-90 | 1 г/л | |
| Emulgen L-40 | 1 г/л | |
| Пероксидаза | 10 Ед/мл | |
| Холестеринэстераза (CHER) | 1 Ед/мл | |
| Холестериноксидаза (CHOD) | 3 Ед/мл | |
| Фосфолипаза D | 5 Ед/мл |
ПРИМЕР 11
Определение Х-ОПЧ
Была выполнена процедура, аналогичная описанной в примере 4 с использованием набора согласно примеру 7 вместо набора согласно примеру 1 и с использованием 35 свежих сывороток крови человека вместо использованных в примерах 5-8 64 проб. Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 35 проб определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170.
ПРИМЕР 12
Определение Х-ОПЧ
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 35 свежих сывороток крови человека определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 аналогично описанному в примере 11 с использованием набора согласно примеру 8 вместо набора согласно примеру 7.
ПРИМЕР 13
Определение Х-ОПЧ
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 35 свежих сывороток крови человека определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 аналогично описанному в примере 11 с использованием набора согласно примеру 9 вместо набора согласно примеру 7.
ПРИМЕР 14
Определение Х-ОПЧ
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 35 свежих сывороток крови человека определяли на автоматическом анализаторе Hitachi-7170 аналогично описанному в примере 11 с использованием набора согласно примеру 10 вместо набора согласно примеру 7.
ТЕСТОВЫЙ ПРИМЕР 3
Корреляция с результатами, полученными с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.)
Концентрацию Х-ОПЧ в каждой из 35 свежих сывороток крови человека, использованных в примерах 11-14, определяли с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.).
Корреляция результатов определения Х-ОПЧ, полученных с использованием способов согласно примерам 11-14 и сравнительному примеру 2 с одной стороны, и результатов определения Х-ОПЧ, полученных с использованием набора «JIMRO» II (JIMRO Co., Ltd.) с другой, была исследована путем расчета коэффициента корреляции. Полученные значения коэффициента корреляции приведены в таблице 13. Соответствующие диаграммы корреляции приведены на фигурах 5-8.
| ТАБЛИЦА 13 | |
| Способ определения | Коэффициент корреляции с результатами измерений, полученными с использованием набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II |
| Пример 11 | 0,9764 |
| Пример 12 | 0,9826 |
| Пример 13 | 0,9756 |
| Пример 14 | 0,9745 |
Как видно из таблицы 13, результаты измерений, полученные при использовании наборов, содержащих два типа поверхностно-активных веществ в качестве ПАВ (d2), также хорошо коррелируют с результатами, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II. Путем сопоставления результатов, приведенных в таблице 13, с результатами, полученными согласно примерам 4-6 (приведенными в таблице 11), было выяснено, что результаты определения Х-ОПЧ, полученные при использовании наборов, содержащих в своем составе два типа ПАВ (d2), демонстрируют лучшую корреляцию с результатами, полученными при использовании набора для определения Х-ОПЧ «JIMRO» II, нежели результаты определения, полученные при использовании наборов, содержащих в своем составе один тип ПАВ (d2).
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Настоящее изобретение относится к способу, реагенту и набору для количественного определения Х-ОПЧ, применимым для диагностики артериосклеротических заболеваний.
1. Способ количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, который включает в водной среде, содержащей пробу и в присутствии (а) комбинации из сополимера полиоксиэтилена и полиоксибутилена, и одного или более типов поверхностно-активных веществ (ПАВ), выбранных из группы, состоящей из полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкиларилового простого эфира, полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкилового простого эфира и полиоксиэтилен-полиоксипропиленалкилового простого эфира, содержащего короткую разветвленную алкильную группу и (b) фосфолипид-гидролизующего фермента, позволяющего (с) холестеринэстеразе и холестериноксидазе действовать на холестерин в составе остаточно-подобных частиц в пробе с образованием пероксида водорода и определять образовавшийся пероксид водорода.
2. Способ по п.1, в котором определение пероксида водорода проводится за счет взаимодействия образованного пероксида водорода в присутствии пероксидазы с хромогеном, приобретающим/изменяющим цвет в ходе окисления, и определением образовавшегося красителя.
3. Способ по п.1 или 2, в котором сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена представляет собой ПАВ общей формулы (I)
где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или неразветвленную либо разветвленную алкильную группу.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором фосфолипид-гидролизующий фермент представляет собой фосфолипазу D, фосфолипазу С или фосфолипазу А2.
5. Реагент для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу, холестериноксидазу и комбинацию сополимера полиоксиэтилена и полиоксибутилена и одного или более видов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, состоящей из полиоксиэтилен-полиоксипропилен алкиларилового простого эфира, полиоксиэтилен-полиоксипропилен алкилового простого эфира и полиоксиэтилен-полиоксипропилен алкилового простого эфира, содержащего короткую разветвленную алкильную группу.
6. Реагент по п.5, дополнительно содержащий реагент для определения пероксида водорода.
7. Реагент по п.5 или 6, в котором сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена представляет собой ПАВ общей формулы (I)
где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или неразветвленную либо разветвленную алкильную группу.
8. Реагент по любому из пп.5-7, в котором фосфолипид-гидролизующий фермент представляет собой фосфолипазу D, фосфолипазу С или фосфолипазу А2.
9. Набор для количественного определения холестерина в составе остаточно-подобных частиц в пробе, содержащий первый реагент, включающий сополимер полиоксиэтилена-полиоксибутилена, и второй реагент, включающий фосфолипид-гидролизующий фермент, холестеринэстеразу и холестериноксидазу, причем данный набор дополнительно содержит один или более видов поверхностно-активных веществ, выбранных из группы, состоящей из полиоксиэтилен-полиоксипропилен алкиларилового простого эфира, полиоксиэтилен-полиоксипропилен алкилового простого эфира и полиоксиэтилен-полиоксипропилен алкилового простого эфира, содержащего короткую разветвленную алкильную группу по меньшей мере в одном первом реагенте или втором реагенте.
10. Набор по п.9, дополнительно содержащий реагент для определения пероксида водорода по меньшей мере в одном из первого и второго реагентов.
11. Набор по п.9 или 10, в котором сополимер полиоксиэтилена и полиоксибутилена представляет собой ПАВ общей формулы (I)
где А, В и С представляют собой одинаковые либо различные целые числа от 1 до 200; R представляет собой атом водорода или неразветвленную или разветвленную алкильную группу.
12. Набор по любому из пп.9-11, в котором фосфолипид-гидролизующий фермент представляет собой фосфолипазу D, фосфолипазу С или фосфолипазу А2.
