Способ определения растворимой формы димера cd50 антигена в сыворотке крови человека

Изобретение относится к медицине и касается способа определения растворимой формы димера CD50 антигена в сыворотке крови человека, включающего использование CD50-специфических моноклональных антител, при котором реакцию проводят на планшете с применением тетраметилбензидина в качестве субстрата. Изобретение обеспечивает обнаружение растворимой формы димера CD50 антигена в сыворотке крови человека.

 

Изобретение относится к области биологии и медицины, в частности к молекулярной иммунологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики мелкоклеточного рака легкого.

В настоящее время охарактеризовано более 240 мембранных дифференцировочных антигенов клеток иммунной системы, классифицированных на Международных рабочих совещаниях. Для более чем 40 мембранных антигенов белковой природы продемонстрировано существование растворимых форм. Эти белки относятся к разным семействам и суперсемействам. Эффекторное действие растворимых форм мембранных антигенов клеток иммунной системы зависит от того, находится ли белок в мономерной или олигомерной форме, то есть от особенностей структурной организации.

Известны способы определения растворимых форм некоторых антигенов крови человека, основанные на иммуноферментном анализе. В частности, разработан метод оценки сывороточного содержания растворимого CD38 антигена (Mallone R., Ferrua S., Morra M. et al. Characterization of a CD38-like 78-kilodalton soluble protein released from В cell lines derived from patients with X-linked agammaglobulinemia // J. Clin. Invest., 1998, Vol.101, №12, P.2821-2830), а также иммуноферментный способ выявления его димерной формы (Егорова Н.И., Курников Г.Ю., Новиков В.В. Сывороточное содержание суммарной и олигомерной фракций растворимых форм CD54 и CD38 антигенов при урогенитальном хламидиозе. // Матер. Росс. науч-практ. конф. «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», С.-Петербург, 2004, с.83). Также известны методы определения растворимых форм антигенов адгезии в сыворотке крови человека, относящиеся к различным семействам белков - иммуноглобулины, интегрины, селектины (del Pozo M.A., Pulido R., Munoz C. Regulation of ICAM-3 (CD50) membrane expression on human neutrophils through a proteolytic shedding mechanism // Eur. J. Immunol., 1994, Vol.24 (11), P.2586-2594; Tsujisaki M., Imai K., Hirata H. et al. Detection of circulating intercellular adhesion molecule-1 antigen in malignant diseases // Clin. Exp. Immunol., 1991, Vol.85 (1), P.3-8). Некоторые из этих методов используются с применением специфических моноклональных антител серии ИКО (Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. Моноклональные антитела, Москва, 1997, 212 с.), очистка которых сульфатом аммония и риванолом производится общепринятыми методами (Фримель Г. Иммунологические методы. - M.: Медицина, 1987, с.390-413). Для приготовления субстратного раствора обычно используют цитратный буфер и тетраметилбензидин, а для отмывки непрореагировавших компонентов - фосфатно-солевой раствор с твином (ФСР-Т) (например, Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. - М.: Высш. шк., 1991,288 с.).

Объектом изобретения является способ, позволяющий выявить в сыворотке крови человека новую форму растворимого мембранного белка CD50, содержание которой, как показали проведенные исследования, коррелирует с различными морфологическими вариантами рака легкого (плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, плоскоклеточный ороговевающий рак легкого, железистый рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, смешанная форма рака легкого, злокачественный карциноид). Молекулярная масса обнаруженного белка соответствует растворимой форме димера CD50 антигена.

По имеющимся сведениям какая-либо информация о выявленном белке и его связь с морфологическими вариантами рака легкого отсутствует.

Таким образом, получаемый при использовании настоящего изобретения технический результат заключается в обнаружении растворимой формы димера CD50 антигена в сыворотке крови человека.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в лунки планшета вносят используемые в качестве CD50-специфических моноклональных антител моноклональные антитела ИКО-60, разведенные в соотношении 1:700 0,85% раствором NaCl, в объеме 100 мкл, выдерживают планшет во влажной камере при температуре 42°С в течение 2 часов, отмывают несвязавшиеся антитела 4-5 раз ФСР-Т (рН 7,2-7,6), 25-кратный концентрат которого состоит из 250 г NaCl, 25 г NaHPO₄·12H₂O, 100 г мочевины, 25 мл твин-80, растворенных в 1 л дистиллированной воды, вносят в первый ряд лунок планшета по 100 мкл положительной контрольной сыворотки, разведенной ФСР-Т в следующих соотношениях: цельная сыворотка, 1:1, 1:3, 1:7, 1:15, 1:31, 1:63, 1:127, в 3 лунки вносят ФСР-Т в объеме 100 мкл, в другую лунку вносят анализируемую сыворотку в объеме 100 мкл, выдерживают планшет во влажной камере при температуре 18-25°С в течение 18-24 часов, отмывают несвязавшиеся компоненты реакции ФСР-Т 4-5 раз, вносят моноклональные антитела ИКО-60, связанные с ферментом - пероксидазой хрена, разведенные ФСР-Т в соотношении 1:500 в объеме 100 мкл, выдерживают планшет в течение 1 часа при температуре 42°С, отмывают непрореагировавшие компоненты реакции ФСР-Т 5-6 раз, вносят субстратный раствор в объеме 100 мкл, состоящий из 10%-ного тетраметилбензидина, растворенного в 10 мл цитратного буферного раствора (рН 4,0), содержащего 0,05% перекиси водорода и состоящего из 5 г лимонной кислоты, 5 г лимоннокислого натрия трехзамещенного, растворенных в 1 л дистиллированной воды, выдерживают планшет в темном месте при температуре 18-25°С в течение 15-20 мин, вносят 10% раствор серной кислоты в объеме 50 мкл, измеряют оптическую плотность окрашенного продукта пероксидазной активности при длине волны 450 нм и переводят значения оптической плотности в условные единицы с помощью калибровочной кривой, построенной на основании раститровки положительной контрольной сыворотки.

Способ определения растворимой формы димера CD50 антигена в сыворотке крови человека осуществляют следующим образом.

Для синтеза конъюгата «Моноклональные антитела ИКО-60-пероксидаза хрена» перйодатным методом применяют CD50-специфические моноклональные антитела ИКО-60. К раствору, содержащему 5 мг пероксидазы хрена (R_Z=3,0) в 1 мл Н₂О, добавляют 0,2 мл свежеприготовленного 0,02 М раствора перйодата натрия NaJO₄ и перемешивают 20 минут при температуре 20°С в темной камере. Полученный раствор диализуют против 0,001 М Na-ацетатного буфера (рН 4,4) в течение 24 часов при температуре 4°С. К раствору добавляют 10 мг антител, растворенных в 2 мл 0,2 М Na-карбонатного буфера (рН 9,6). Раствор перемешивают в течение 2 часов при температуре 20°С в темной камере, добавляют 0,1 мл свежеприготовленного водного раствора NaHB₄ (4 мг/мл) и перемешивают два часа при температуре 4°С. Полученный конъюгат осаждают насыщенным раствором (NN₄)₂SO₄ и затем диализуют против физиологического раствора. Для стабилизации конъюгата добавляют равный объем глицерина и хранят при температуре -20°С.

Оптимальную концентрацию моноклональных антител ИКО-60 для внесения в планшет определяют, измеряя оптическую плотность при различных разведениях от 1:100 до 1:1500. Максимальная разница между опытным и фоновым значениями наблюдалась при разведении моноклональных антител ИКО-60 1:700. Наиболее эффективную концентрацию моноклональных антител ИКО-60, конъюгированных с пероксидазой хрена, также определяют, используя разведения конъюгата от 1:100 до 1:1500. Наиболее эффективным оказалось разведение конъюгата 1:500.

Пример 1. В лунки планшета вносят очищенные моноклональные антитела ИКО-60, разведенные в соотношении 1:700 0,85%-раствором NaCl, в объеме 100 мкл.

Планшет выдерживают во влажной камере при температуре 42°С в течение 2 часов. Несвязавшиеся антитела 4 раза отмывают ФСР-Т.

В первый ряд лунок планшета вносят по 100 мкл положительной контрольной сыворотки, разведенной ФСР-Т в следующих соотношениях: цельная сыворотка, 1:1, 1:3, 1:7, 1:15, 1:31, 1:63; 1:127.

В 3 лунки вносят по 100 мкл ФСР-Т для контроля фоновых реакций.

В другую лунку вносят 100 мкл анализируемой сыворотки, разведенной ФСР-Т в соотношении 1:1.

Планшет выдерживают во влажной камере при температуре 18°С в течение 18 часов и отмывают 4 раза ФСР-Т.

Затем вносят по 100 мкл раствора конъюгата «Моноклональные антитела ИКО-60-пероксидаза хрена», разведенного ФСР-Т в соотношении 1:500.

Планшет выдерживают при температуре 42°С в течение 1 часа и отмывают 5 раз ФСР-Т.

Вносят по 100 мкл субстратного раствора, в качестве которого используют раствор тетраметилбензидина.

Планшет выдерживают 15 мин при температуре 18°С в темном месте.

Добавляют по 100 мкл 10% раствора серной кислоты и немедленно определяют оптическую плотность окрашенного продукта при длине волны 450 нм с использованием фотометра Мультискан EX. Переводят единицы оптической плотности в условные единицы (U/ml) с помощью калибровочной кривой, построенной на основании раститровки положительной контрольной сыворотки. За 1000 U/ml принимают значение оптической плотности, соответствующее рабочему разведению анализируемого образца сыворотки. Содержание растворимой формы димера CD50 антигена в анализируемой сыворотке составило 153 U/ml.

Пример 2. В лунки планшета, подвергнутого ультрафиолетовому облучению, вносят очищенные моноклональные антитела ИКО-60, разведенные в соотношении 1:700 0,85% раствором NaCl, в объеме 100 мкл.

Планшет выдерживают во влажной камере при температуре 42°С в течение 2 часов. Несвязавшиеся антитела 5 раз отмывают ФСР-Т.

В первый ряд лунок планшета вносят по 100 мкл положительной контрольной сыворотки, разведенной ФСР-Т в следующих соотношениях: цельная сыворотка, 1:1, 1:3, 1:7, 1:15, 1:31, 1:63; 1:127.

В 3 лунки вносят по 100 мкл ФСР-Т для контроля фоновых реакций.

В другую лунку вносят 100 мкл анализируемой сыворотки, разведенной ФСР-Т в соотношении 1:1.

Планшет выдерживают во влажной камере при температуре 22°С в течение 21 часа и отмывают 5 раз ФСР-Т.

Затем вносят по 100 мкл раствора конъюгата «Моноклональные антитела ИКО-60-пероксидаза хрена», разведенного ФСР-Т в соотношении 1:500.

Планшет выдерживают при температуре 42°С в течение 1 часа и отмывают 6 раз ФСР-Т.

Вносят по 100 мкл субстратного раствора, в качестве которого используют раствор тетраметилбензидина в 10 мл цитратного буферного раствора (рН 4,0), содержащего 0,05% перекиси водорода.

Планшет выдерживают 15 мин при температуре 18°С в темном месте.

Добавляют по 100 мкл 10% раствора серной кислоты и немедленно определяют оптическую плотность окрашенного продукта при длине волны 450 нм с использованием фотометра Мультискан EX. Переводят единицы оптической плотности в условные единицы (U/ml) с помощью калибровочной кривой, построенной на основании раститровки положительной контрольной сыворотки. За 1000 U/ml принимают значение оптической плотности, соответствующее рабочему разведению анализируемого образца сыворотки. Содержание растворимой формы димера CD50 антигена в анализируемой сыворотке составило 53 U/ml.

При определении растворимой формы димера CD50 антигена в сыворотке крови 85 здоровых доноров было показано, что ее содержание в норме составляет 65,8±1,6 U/ml. Образцы сыворотки были получены также от 94 больных раком легкого с различными морфологическими вариантами опухоли (плоскоклеточный неороговевающий рак легкого, плоскоклеточный ороговевающий рак легкого, железистый рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, смешанная форма рака легкого, злокачественный карциноид) на всех стадиях распространенности опухолевого процесса.

Содержание растворимой олигомерной фракции CD50 при мелкоклеточном варианте опухоли, составляющего 112,4±9,9 U/ml, показало достоверное в 1,7 раза (р=0,001) превышение уровня показателя данного антигена у группы здоровых доноров и всех форм раковых опухолей легкого: в 2,15 раза уровня плоскоклеточного неороговевающего рака, равное 52,2±2,6 U/ml, в 2,29 раза выше уровня плоскоклеточного ороговевающего рака легкого, равное 48,9±6,9 U/ml, в 2,68 раза выше уровня смешанного рака легкого, равное 41,9±4,9 U/ml. Показатели антигена при плоскоклеточных раках и смешанной форме опухоли достоверно ниже уровня здоровых доноров (p<0,05).

Таким образом, определение растворимой формы димера CD50 антигена правомерно использовать для дифференциальной диагностики мелкоклеточного рака легкого и других вариантов данной нозологии в качестве дополнительного вспомогательного теста.

Способ определения растворимой формы димера CD50 антигена в сыворотке крови человека, состоящий в том, что в лунки планшета вносят используемые в качестве CD50-специфических моноклональных антител моноклональные антитела ИКО-60, разведенные в соотношении 1:700 0,85%-ным раствором NaCl, в объеме 100 мкл, выдерживают планшет во влажной камере при температуре 42°С в течение 2 ч, отмывают несвязавшиеся антитела 4-5 раз фосфатно-солевым раствором (ФСР-Т), (рН 7,2-7,6), 25-кратный концентрат которого состоит из 250 г NaCl, 25 г NaHPO₄·12H₂O, 100 г мочевины, 8 мл тритона Х100 и 25 мл твин-80, растворенных в 1 л дистиллированной воды, вносят в первый ряд лунок планшета по 100 мкл положительной контрольной сыворотки, разведенной ФСР-Т в следующих соотношениях: цельная сыворотка, 1:1, 1:3,1:7, 1:15, 1:31, 1:63, 1:127, в 3 лунки вносят ФСР-Т в объеме 100 мкл, в другую лунку вносят анализируемую сыворотку в объеме 100 мкл, выдерживают планшет во влажной камере при температуре 18-25°С в течение 18-24 ч, отмывают несвязавшиеся компоненты реакции ФСР-Т 4-5 раз, вносят моноклональные антитела ИКО-60, связанные с ферментом - пероксидазой хрена, разведенные ФСР-Т в соотношении 1:500 в объеме 100 мкл, выдерживают планшет в течение 1 ч при температуре 42°С, отмывают непрореагировавшие компоненты реакции ФСР-Т 5-6 раз, вносят субстратный раствор в объеме 100 мкл, состоящий из 10%-ного тетраметилбензидина, растворенного в 10 мл цитратного буферного раствора (рН 4,0), содержащего 0,05% перекиси водорода и состоящего из 5 г лимонной кислоты, 5 г лимоннокислого натрия трехзамещенного, растворенных в 1 л дистиллированной воды, выдерживают планшет в темном месте при температуре 18-25°С в течение 15-20 мин, вносят 10%-ный раствор серной кислоты в объеме 50 мкл, измеряют оптическую плотность окрашенного продукта пероксидазной активности при длине волны 450 нм и переводят значения оптической плотности в условные единицы с помощью калибровочной кривой, построенной на основании раститровки положительной контрольной сыворотки.