Искусственная роговица и способ ее получения
Группа изобретения относится к медицине, а именно к офтальмологии. Предложена искусственная роговица для имплантации в организм человека, полученная способом, предусматривающим получение субстрата путем отбора роговицы животного с последующим кросслинкингом и фиксацией субстрата, а также минимизацию активности антигенов субстрата и присоединение к нему активного слоя из группы: полипептид, глизокаминогликан. При этом кросслинкинг и фиксацию выполняют с использованием растворимого в воде эпоксидного соединения, имеющего углеводородный скелет, не содержащий простых и сложных эфирных связей. Эпоксидное соединение выбирают из группы, включающей эпоксид, диамид, диизоцианит и карбодиамид. Минимизация активности антигенов субстрата осуществляется с использованием активного реагента из группы: ангидриды кислот, ацилхлориды, амиды, эпоксиды для блокирования активных групп молекул белков субстрата, а также реагента с высокой способностью к образованию водородных связей, например соединения гуанидина, для изменения конфигурации водородных связей в спиральных участках белковых молекул субстрата. Получаемая искусственная роговица обладает высокой биологической совместимостью и стабильностью. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 2 ил.
Область техники, к которой относится изобретение
Предлагаемое изобретение относится к протезам для имплантации человеку, в частности к устройствам для восстановления поврежденной роговицы.
Уровень техники
Потеря зрения, связанная с повреждениями роговицы или ее патологическими изменениями, является одним из наиболее распространенных офтальмологических заболеваний, и современный метод его лечения заключается в трансплантации роговицы от трупа-донора. Однако трансплантация роговицы связана не только с такими проблемами, как наличие подходящего донора. К тому же иммунное отторжение часто приводит к неудачному исходу операции по трансплантации. В связи с этим ученые предпринимают попытки использования роговицы, взятой у животных, для лечения болезней роговицы у людей, включая исследования по прямой трансплантации роговицы, взятой у животных. Однако такие попытки прямой трансплантации роговицы, взятой у животных, оказались неудачными в связи с иммунным отторжением. Дополнительные исследования по изготовлению искусственной роговицы из роговицы, взятой у животных, путем низкотемпературного замораживания и обычной стерилизации, также не привели к успеху, поскольку элиминация антигенов оказалась неполной, и организм пациента не мог воспринимать трансплантат в связи с плохой совместимостью тканей.
Таким образом, потребность в эффективной искусственной роговице, которая может быть получена из роговицы животного, остается актуальной.
Раскрытие изобретения
Целью предлагаемого изобретения является получение безопасной и надежной искусственной роговицы с использованием биологических тканей, обладающей высокой биологической совместимостью и стабильностью, которая может деградировать и абсорбироваться и которая способна приводить к регенерации роговицы.
Другой целью настоящего изобретения является создание способа получения такой искусственной роговицы.
Для достижения целей предлагаемого изобретения предлагается искусственная роговица для имплантации в организм человека, которую изготавливают способом, включающим стадии: получения субстрата путем отбора роговицы животного; кросслинкинга и фиксации субстрата; минимизации активности антигенов субстрата и присоединения активного слоя к субстрату.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - аксонометрический вид искусственной роговицы согласно одному варианту осуществления предлагаемого изобретения.
Фиг.2 - поперечный разрез искусственной роговицы, показанной на Фиг.1.
Осуществление изобретения
Следующее подробное описание является описанием предположительно одного из лучших в настоящее время вариантов осуществления изобретения. Это описание не следует воспринимать как ограничивающее, и оно приводится только лишь с целью проиллюстрировать общие принципы осуществления предлагаемого изобретения. Объем предлагаемого изобретения наилучшим образом определен в прилагаемой формуле изобретения.
Согласно изобретению предлагается искусственная роговица, изготовленная с использованием биологических тканей, полученных из роговицы животного, подвергается кросслинкингу, фиксируется реагентом-фиксатором, обрабатывается с целью сведения к минимуму активности антигенов и затем покрывается поверхностным слоем, содержащим активный слой.
Роговица легко разрушается или разлагается микроорганизмами, в связи с чем необходимо проводить кросслинкинг и фиксацию (стабилизацию) при помощи фиксатора. Обычно в качестве фиксатора используется глутаровый альдегид, но он образует токсичные радикалы. Альдегиды вызывают кросслинкинг белков в результате реакции ацетализации, при разложении сшитых продуктов высвобождаются токсичные альдегиды, в связи с чем продукты фиксации альдегидами имеют долговременную остаточную токсичность. При использовании в качестве фиксаторов вместо альдегидов неальдегидных фиксаторов, таких как эпоксиды, диацилдиамиды, диизоцианаты, полиэтиленгликоль или карбодиимиды, эта токсичность может быть сведена к минимуму или даже полностью устранена. Например, при использовании эпоксидов вместо фиксатора альдегидного типа реакция раскрытия кольца/поперечного сшивания протекает быстро, поскольку эпоксиды нестойки, но продукт поперечного сшивания может быть получен в виде очень стойкого и трудно разлагающегося соединения за счет контроля условий проведения реакции. Указанное соединение медленно разлагается до полипептидов и аминокислот и абсорбируется только тогда, когда рост ткани и регенерация начинают поглощать его в результате секреции калликреина, фибринолизина и глюкокотикоидного гормона с целью способствования разложению в результате действия коллагеназы. Такое пассивное разложение и регенерация ткани протекают синхронно, что оказывает благоприятное действие на регенеративное восстановление ткани, в то же время не проявляется остаточная токсичность, связанная с альдегидами. Согласно современной иммунологической теории антигенность животных тканей вызвана, главным образом, наличием активных групп, расположенных в определенных участках и в конкретных конформациях, и эти активные группы включают -ОН, -NH2, -SH и т.д. Конкретные конформации возникают, в основном, вследствие образования определенных водородных связей в спиральных участках молекул белков. Эти определенные участки и конформации называются антигенными детерминантами. Один или более реагентов (например, ангидриды кислот, ацилхлориды, амиды, эпоксиды и т.д.), легко реагирующие с этими группами, используются для связывания с этими группами и их блокирования при обработке животных тканей с тем, чтобы активность антигенов была сведена к минимуму или элиминирована. Одновременно используются реагенты с сильными водородными связями (например, соединения гуанидина) для перемещения водородных связей, приводящих к существованию определенных конфигураций, для того, чтобы эти конфигурации изменились, и антигенность была эффективно устранена.
Способ
Способ получения искусственной роговицы согласно предлагаемому изобретению с использованием роговицы животных в качестве субстрата включает следующие стадии:
1. Отбор материала. Отбирают свежие образцы глазных яблок животных. Предпочтительно, чтобы роговица донорского материала была прозрачной.
2. Предварительная обработка. Роговицу животного иссекают и тщательно подравнивают края. Роговицу помещают в раствор консерванта, замораживают при -18°С и выдерживают при этой температуре в течение 24-28 ч, а затем извлекают, дают разморозиться и замачивают в растворе поверхностно-активного вещества на 16-20 часов, или замачивают в растворе протеолитического фермента, так называемого панкрина, на 2-4 часа, после чего промывают и при необходимости подвергают промывке с одновременным воздействием ультразвука в течение 10-20 минут.
3. Фиксация. Молекулы коллагена субстрата подвергают кросслинкингу и фиксируют при помощи неальдегидного фиксатора, как описано более подробно ниже.
4. Минимизация (подавление) активности антигенов. Используется активный реагент для блокирования определенных активных групп молекул белков субстрата, таких как -ОН, -NH2, -SH и т.д., и используется реагент с высокой способностью к образованию водородных связей с целью замены имеющихся в них водородных связей в спиральных участках белковых молекул субстрата и изменения свойственной им конфигурации.
5. Присоединение активного слоя. Активный поверхностный слой, содержащий особый полипептид или гликозаминогликан, способный присоединяться к факторам роста, вводят в поверхностный слой при помощи связующего вещества.
Поверхностно-активное вещество
В качестве поверхностно-активного вещества в стадии 2 описанного выше способа могут использоваться: тритон Х-100, холеат натрия, гидроксиметиламинометан (Трис), додецилсульфат натрия (ДСН) или детергент ЧАПС (CHAPS). В качестве панкрина может использоваться пепсин, трипсин или смесь этих двух ферментов.
Раствор консерванта
В качестве раствора консерванта в стадии 2 описанного выше способа может использоваться раствор препарата «искусственные слезы», физиологический раствор, глицерин или смесь глицерина и раствора препарата «искусственные слезы».
Фиксатор
Фиксатором, использующимся в стадии 3 описанного выше способа, может быть реагент, который легко образует поперечные связи с молекулами белков и является одним или двумя реагентами, выбранными из эпоксидов, диацилдиамидов, диизоцианатов, полиэтиленгликолей или карбодиимидов. Этот фиксатор может быть эпоксидным соединением, имеющим углеводородный скелет, растворимым в воде и не содержащим простых и сложных эфирных связей в своем скелете. Этот фиксатор описан в патенте США №6106555, полное описание изобретения к которому включено посредством настоящей ссылки, которое тем не менее изложено здесь в полном объеме. Примеры включают эпоксид, диамид, диизоцианат, полиэтиленгликоль или карбодиимид, причем эпоксид может быть моноциклическим эпоксидом или бициклическим эпоксидом, или он может быть низкомолекулярным полиэпоксидом (таким как низкомолекулярный полиэтиленоксид или глицидиловый эфир). Эпоксид может быть моноциклическим эпоксидом 
или бициклическим эпоксидом, 
, где R=CnH2n+1-, n=0-10, и может быть низшим полиэпоксидом, таким как полипропиленоксидом.
Активные реагенты
Активными реагентами в стадии 4 описанного выше способа могут быть ангидриды низкомолекулярных органических кислот, ацилхлориды, ациламиды, моноциклические оксиды или эпоксиды, а реагентами, имеющими высокую способность к образованию водородных связей, являются соединения гуанидина.
Активный слой
В качестве активного слоя в стадии 5 описанного выше способа может использоваться активный компонент, такой как полипептид или гликозаминогликан. Одним из примеров может служить полипептид, полученный при помощи конденсации 16 остатков лизина (К 16), глицина (G), аргинина (R), аспарагиновой кислоты (D), серина (S), пролина (Р) и цистеина (С). В качестве гликозаминогликана может использоваться гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарин, ацетилгепаринсульфат или кератансульфат. Эти полипептиды или гликозаминогликаны оказывают широкий спектр адгезионных и стимулирующих воздействий на факторы роста или активируют недифференцированные клетки для выполнения целенаправленной дифференциации таким образом, чтобы они смогли выполнять функцию стимуляции заживления органических тканей. Примеры факторов роста для кровеносных сосудов, которые могут прикрепляться и накапливаться, включают сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), фибробластный фактор роста (FGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF-bb) и фактор сосудистой проницаемости (VPF).
Связующее вещество для активного слоя
В качестве связующего вещества, использующегося для присоединения полипептида или гликозаминогликана в стадии 5 описанного выше способа, может использоваться диацилдиамид, ангидрид двухосновной кислоты, диэпоксид или другие бифункциональные реагенты, способные вступать в реакцию конденсации с группами NH2, -ОН и -СООН.
Предлагаемое изобретение обеспечивает получение следующих преимуществ. Состав и трехмерная структура искусственной роговицы очень сходны с таковыми для человеческой роговицы, в то же время не обладая иммуногенностью. Она может вызывать регенерацию роговицы и способствовать ей, деградируя по мере регенерации роговицы, и скорость деградации может регулироваться так, чтобы она совпадала со скоростью регенерации роговицы, за счет контроля условий реакции поперечной сшивки. Физические и механические свойства искусственной роговицы близки к таковым для человеческой роговицы: она имеет стабильные морфологические свойства и хорошую эластичность, при этом роговица может быть изготовлена с различной кривизной и не набухает в воде, тем самым делая ее идеальным субстратом или основой для восстановления роговицы.
Пример 1
Как показано на фигурах 1 и 2, искусственная роговица с использованием роговицы животных (субстрат 1), приготовленная путем кросслинкинга и фиксации неальдегидным фиксатором с обеспечением минимальной активности антигенов. Активный поверхностный слой 2 формируют при помощи присоединения внутренней (обращенной к глазному яблоку) поверхности обработанного субстрата 1 к активному компоненту, состоящему из полипептида или гликозаминогликана, способного присоединяться к факторам роста. В качестве одного из примеров полипептида может служить полипептид, полученный при помощи конденсации 16 лизинов (К 16), глицина (G), аргинина (R), аспарагиновой кислоты (D), серина (S), пролина (Р) и цистеина (С). В качестве упомянутого выше гликозаминогликана может использоваться гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, дерматансульфат, гепарин, ацетилгепаринсульфат или кератансульфат. Искусственная роговица с использованием биологических тканей может быть изготовлена по методике, включающей следующие стадии:
1. Отбор материалов. Отбор свежих глазных яблок проводят у здоровых свиней и замораживают их в специальных флаконах для консервации перед транспортировкой.
2. Предварительная обработка. Роговицы животных иссекают и тщательно подравнивают края. Затем роговицы помещают в раствор препарата «искусственные слезы» или раствор глицерина в качестве консерванта, замораживают при -18°С и выдерживают при этой температуре в течение 24 часов. После этого роговицы извлекают, дают разморозиться и замачивают в растворе поверхностно-активного вещества: тритона Х-100, холеата натрия, гидроксиметиламинометана (Трис), додецилсульфата натрия (ДСН или детергента ЧАПС (CHAPS) на 16-20 часов (или замачивают в пепсине, трипсине или смешанном ферментном растворе их обоих на 2-4 часа), после чего промывают и, при необходимости, подвергают промывке с одновременным воздействием ультразвука в течение 10-20 минут.
3. Фиксация с кросслинкингом. Молекулы коллагена субстрата 1 подвергают кросслинкингу и фиксации при комнатной температуре в течение 8-48 часов в растворе эпоксидного фиксатора.
4. Минимизация активности антигенов. Определенная активная группа, а именно -ОН, -NH2, или -SH, в молекулах белков субстрата 1 блокируется активным реагентом, таким как ангидрид кислоты, или метилирующий реагент, или эпоксидное соединение, и определенная водородная связь в спиральных участках белков субстрата 1 замещается под действием реагента с сильной водородной связью (например, раствора гуанидина гидрохлорида), изменяя конфигурацию.
5. Модификация поверхности. Активный поверхностный слой 2 формируют при помощи присоединения к поверхности обработанного субстрата 1 полипептида, полученного в результате конденсации 16 лизинов (К16), глицина (G), аргинина (R), аспарагиновой кислоты (D), серина (S), пролина (Р) и цистеина (С), и гликозаминогликана, с использованием связующего вещества.
6. Упаковка. Продукт стерилизуют при помощи стерилизующего средства и герметично упаковывают в небольшом флаконе с раствором консерванта с соблюдением условий стерильности.
Хотя приведенное выше описание относится к конкретным вариантам осуществления предлагаемого изобретения, следует иметь в виду, что в пределах его сущности могут иметь место различные модификации. Прилагаемая формула изобретения позволяет охватить такие модификации как подпадающие под объем и сущность предлагаемого изобретения.
1. Способ получения искусственной роговицы с использованием биологических тканей для имплантации в организм человека, предусматривающий получение субстрата путем отбора роговицы животного с последующим кросслинкингом и фиксацией субстрата, а также минимизацию активности антигенов субстрата и присоединение к нему активного слоя из группы: полипептид, глизокаминогликан.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что кросслинкинг и фиксацию выполняют с использованием растворимого в воде эпоксидного соединения, имеющего углеводородный скелет, не содержащий простых и сложных эфирных связей.
3. Способ по п.3, отличающийся тем, что эпоксидное соединение выбирают из группы, включающей эпоксид, диамид, диизоцианит и карбодиамид.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия минимизация активности антигенов субстрата осуществляется с использованием активного реагента из группы: ангидриды кислот, ацилхлориды, амиды, эпоксиды, для блокирования активных групп молекул белков субстрата, а также реагента с высокой способностью к образованию водородных связей, например соединения гуанидина, для изменения конфигурации водородных связей в спиральных участках белковых молекул субстрата.
5. Искусственная роговица для имплантации в организм человека, содержащая роговицу животного, подвергнутую кросслинкингу, с минимизированной активностью антигенов и с присоединенным к ней активным слоев, содержащем полипептид и глизокаминогликан.
6. Роговица по п.5, отличающаяся тем, что субстрат фиксирован растворимым в воде эпоксидным соединением, имеющим углеводородный скелет, не содержащий простых и сложных эфирных связей.
7. Роговица по п.6, отличающаяся тем, что эпоксидное соединение выбрано из группы, включающей эпоксид, диамид, диизоцианит и карбодиамид.
8. Роговица по п.5, отличающаяся тем, что минимальная активность антигенов субстрата обеспечивается за счет использования активного реагента для блокирования активных групп молекул белков субстрата, а также реагента с высокой способностью к образованию водородных связей для изменения конфигурации водородных связей в спиральных участках белковых молекул субстрата.
9. Искусственная роговица для имплантации в организм человека, полученная способом, предусматривающим получение субстрата путем отбора роговицы животного с последующим кросслинкингом и фиксацией субстрата, а также минимизацию активности антигенов субстрата и присоединение к нему активного слоя из группы: полипептид, гликозаминогликан.
10. Роговица по п.9, отличающаяся тем, что субстрат фиксирован растворимым в воде эпоксидным соединением, имеющим углеводородный скелет, не содержащий простых и сложных эфирных связей.
11. Роговица по п.10, отличающаяся тем, что эпоксидное соединение выбрано из группы, включающей эпоксид, диамид, диизоцианит и карбодиамид.
12. Роговица по п.9, отличающаяся тем, что минимизация активности антигенов субстрата осуществляется с использованием активного реагента из группы: ангидриды кислот, ацилхлориды, амиды, эпоксиды, для блокирования активных групп молекул белков субстрата, а также реагента с высокой способностью к образованию водородных связей, например соединения гуанидина, для изменения конфигурации водородных связей в спиральных участках белковых молекул субстрата.
