Усиление действия противораковых агентов

Изобретение относится к фармакологии и медицине и представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль, где указанный конъюгат включает: полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичную последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97); и, по меньшей мере, одну молекулу таксола, конъюгированную с указанным полипептидом; и Solutol® HS-15. Изобретение обеспечивает усиления действия противораковых лекарственных средств. 3 н. и 20 з.п. ф-лы, 7 табл., 34 ил.

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к конъюгатам носителей и фармацевтическим композициям и их применению для усиления действия лекарственных средств и для изменения фармакокинетики соединений. Более конкретно настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим носитель, описанный в настоящей заявке, и их применению при лечении и диагностике рака.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Клинический прогресс в лечении первичных опухолей весьма замедлен, и одной из проблем, связанных с такими опухолями, является их слабый ответ на противораковые лекарственные средства. Эффективность химиотерапии и иммунотерапии нарушена из-за наследственного или приобретенного фенотипа множественной лекарственной резистентности (MDR) раковых клеток. Один из механизмов, вовлеченных в MDR-фенотип, вызван экспрессией Р-гликопротеина (P-gp), мембранного транспортера, который выкачивает из экспрессирующих MDR1 клеток различные противораковые лекарственные соединения. P-gp также экспрессируется в большом числе нормальных секреторных тканей, таких как почки, печень и кишечник. Этот выводящий насос сильно экспрессирован в клетках капилляров мозга, где его экспрессия в основном локализована в просветной мембране выстилающих их эндотелиальных клеток. У человека P-gp кодируется двумя MDR генами; MDR1 и MDR3. P-gр, кодируемый геном MDR1 человека, придает резистентный фенотип, в то время как P-gp, кодируемый геном MDR3 человека, не делает этого. Поэтому P-gp может рассматриваться как страж, который ограничивает вхождение лекарственных средств путем вытеснения их наружу из мозга или из раковых клеток, предотвращая накопление в них цитотоксических концентраций лекарственных средств.

Раковые клетки, образующие метастазы в мозге, в основном происходят из рака легкого или молочной железы, карциномы прямой и ободочной кишки, меланомы и рака органов мочевыделительной системы. Эти метастазы, которые образуются после хирургического вмешательства, первичной химио- или радиотерапии, устойчивы к химиотерапии. Химиотерапия против метастазов в мозге может быть эффективна, только если она эффективна против исходных опухолей, из которых происходят метастазы. Например, было показано, что метастазы в мозге, происходящие из мелкоклеточных карцином легких и стволовых клеток, отвечают на лечение в той же степени, что и метастазы другой локализации.

Резистентность к лекарственным средствам может быть собственным свойством опухолевых клеток или свойством, приобретенным после проведенного лечения. Было обнаружено, что в большинстве случаев первичного рака мозга присутствует выкачивающий насос P-gp, кодируемый MDR1 (также именуемый в этом описании Р-гликопротеином, MDR1 P-gp или MDR1), где большинство глиом, а более конкретно эндотелиальные клетки вновь образованных капилляров, положительно окрашивались на MDR1 P-gp. Поэтому многочисленные исследования поддерживают идею о том, что фенотип множественной лекарственной резистентности может быть вызван не только экспрессией P-gp в раковых клетках, но также и экспрессией во вновь образованных эндотелиальных клетках в опухолях. Уровень экспрессии MDR1 был также найден значительно более низким в метастазах в мозге из меланом и аденокарцином легких. В дополнение было показано, что лечение до хирургического вмешательства не оказывает большого влияния на уровень MDR1 в метастазах в мозге из меланом, поскольку они были одинаковы у пациентов, получивших радиотерапию, химиотерапию или оба типа лечения. В легочных метастазах MDR1 обнаруживали только у пациентов, получивших химиотерапию, что указывает на то, что предыдущее лечение могло вызвать его экспрессию, приводя к приобретенному MDR-фенотипу. Отсутствие экспрессии MDR1 в первичных опухолях легких и в соответствующих им метастазам мозга также указывает на то, что эти метастазы не приобретают тех же уровней экспрессии P-gp в ходе их развития, что и уровни экспрессии в нормальной ткани мозга. Эти результаты также указывают на то, что уровень MDR1 в эндотелиальных клетках из капилляров в метастазе мозга отличаются от уровня в первичных опухолях мозга. Отсутствие экспрессии MDR1 в некоторых случаях метастазов в мозг может частично объяснить, почему некоторые из них являются более чувствительными к химиотерапии, чем первичные опухоли мозга.

Способы транспортировки соединения через гематоэнцефалический барьер были описаны в международной заявке РСТ/СА2004/000011, опубликованной 22 июля 2004 года, под номером публикации WO20040/60403, содержание которой полностью включено в данное описание посредством ссылки. Кратко, в этом документе апротинин, фрагменты апротинина и аналоги были представлены как система доставки лекарственных средств для центральной нервной системы (ЦНС) и для лечения болезней, связанных с ЦНС.

Остается необходимость в усилении действия противораковых лекарственных средств.

Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих и других потребностей.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в одном своем аспекте относится к носителю, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов. Последовательность апротинина, также как и некоторых примеров вариантов биологически активных аналогов, может быть найдена, например, в международной патентной заявке № РСТ/СА2004/000011.

Настоящее изобретение относится также к носителю, содержащему аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов.

Примеры вариантов носителей, охватываемых настоящим изобретением, включают в себя те, которые могут быть выбраны, например, из группы, состоящей из

- апротинина (SEQ ID NO.:98),

- аналога апротинина,

- фрагмента апротинина, который может содержать (или может состоять в основном из) аминокислотную последовательность, определяемую SEQ ID NO.:1,

- биологически активного аналога SEQ ID NO.:1,

- биологически активного фрагмента SEQ ID NO.:1 и

- биологически активного фрагмента аналога SEQ ID NO.:1.

Более конкретно носитель может быть выбран, например, из группы

- фрагмента апротинина, который может содержать аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:1,

- биологически активного аналога SEQ ID NO.:1,

- биологически активного фрагмента SEQ ID NO.:1 и

- биологически активного фрагмента аналога SEQ ID NO.:1.

Согласно изобретению фрагмент апротинина может состоять из последовательности, определяемой SEQ ID NO.:1. Далее, согласно изобретению фрагмент апротинина может содержать SEQ ID NO.:1 и может иметь длину, начиная примерно от 19 аминокислот примерно до 54 аминокислот, например, от 10 до 50 аминокислот в длину, от 10 до 30 аминокислот в длину и т.д.

Согласно изобретению биологически активный аналог SEQ ID NO.:1 может иметь длину примерно от 19 аминокислот примерно до 54 аминокислот (например, включающую от 21 до 23, от 25 до 34, от 36 до 50 и от 52 до 54 аминокислот) или примерно от 19 аминокислот примерно до 50 аминокислот, или примерно от 19 аминокислот примерно до 34 аминокислот (например, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34), или примерно от 19 аминокислот примерно до 23 аминокислот, или примерно 19, 20, 21, 22, 23, 24, 35, 51 аминокислот.

Полипептиды согласно изобретению могут быть амидированы, т.е. могут иметь амидированную аминокислотную последовательность.

Биологически активный фрагмент полипептида (например, из 19 аминокислот), описанный в настоящей заявке, может включать в себя, например, полипептид, примерно из 7, 8, 9 или 10 до 18 аминокислот. Таким образом, согласно изобретению биологически активные фрагменты SEQ ID NO.:1 или аналога SEQ ID NO.:1 могут иметь длину примерно от 7 примерно до 18 аминокислот или примерно от 10 примерно до 18 аминокислот.

В патенте США № 5807980 описан полипептид, который указан в данном документе как SEQ ID NO.:102.

В патенте США № 5780265 описан полипептид, который указан в данном документе как SEQ ID NO.:103.

Аминокислотная последовательность апротинина (SEQ ID NO.:98), аминокислотная последовательность Ангиопепа-1 (SEQ ID NO.:67), а также некоторые последовательности биологически активных аналогов могут быть найдены, например, в международной заявке № РСТ/СА2004/000011, опубликованной 22 июля 2004 года в международной публикации под № WO2004/060403. Дополнительно в международной публикации № WO2004/060403 описан полипептид, который указан в данном документе как SEQ ID NO.:104.

В патенте США № 5118668 описаны полипептиды, которые имеют последовательность, показанную в SEQ ID NO.:105.

Еще более конкретно носитель может быть выбран, например, из группы

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 35% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1,

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 40% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1,

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 50% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1,

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 60% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1,

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 70% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1,

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 80% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1,

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 90% сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1 и

- аналога SEQ ID NO.:1, который может быть, по меньшей мере, на 95% (т.е. 96%, 97%, 98%, 99% и 100%) сходен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO.:1.

Например, биологически активный аналог SEQ ID NO.:1 может содержать аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотной последовательности, определяемой в любой из последовательностей от SEQ ID NO.:2 до SEQ ID NO.:62, от SEQ ID NO.:68 до SEQ ID NO.:93 и SEQ ID NO.:97, а также 99, 100 и 101.

Далее, согласно изобретению биологически активный аналог SEQ ID NO.:1 может содержать аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:67. Более конкретно, эта последовательность может быть амидирована.

Например, и без ограничений конъюгаты, содержащие пептиды SEQ ID NO.: 102, 103, 104 и 105, также являются охваченными настоящим изобретением.

Далее, согласно изобретению биологически активный фрагмент SEQ ID NO.:1 или биологически активный фрагмент аналога SEQ ID NO.:1 могут содержать, по меньшей мере, 9 или, по меньшей мере, 10 (последовательных или непрерывных) аминокислот из SEQ ID NO.:1 или аналога SEQ ID NO.:1.

Полипептиды согласно изобретению могут иметь аминокислотную последовательность, которая может содержать от 1 до 12 аминокислотных замен (конкретно SEQ ID NO.:91). Например, аминокислотная замена может составлять от 1 до 10 аминокислотных замен или от 1 до 5 аминокислотных замен. Согласно изобретению аминокислотная замена может быть неконсервативной аминокислотной заменой или консервативной аминокислотной заменой.

Например, когда полипептид согласно изобретению содержит аминокислоты, которые идентичны аминокислотам из SEQ ID NO.:1, и другие аминокислоты, которые не идентичны (неидентичные аминокислоты), неидентичные аминокислоты могут являться консервативными аминокислотными заменами. Сравнение идентичных и неидентичных аминокислот можно осуществить путем сверки аминокислот в соответствующем положении.

Примеры аналога SEQ ID NO.:1, которые могут иметь, по меньшей мере, 35% сходства, включают в себя, например, полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:91 (примерно 36,8% идентичности, т.е. 7 аминокислот из 19 аминокислот SEQ ID NO.:91 являются идентичными SEQ ID NO.:1), полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:98 (примерно 68,4% идентичности, т.е. 13 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:67 (примерно 73,7% идентичности, т.е. 14 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:76 (примерно 73,7% идентичности, т.е. 14 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), и полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:5 (примерно 79% идентичности, т.е. 15 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1).

Примеры аналога SEQ ID NO.:1, которые могут иметь, по меньшей мере, 60% идентичности, включают в себя, например, полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:98 (примерно 68,4% идентичности, т.е. 13 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:67 (примерно 73,7% идентичности, т.е. 14 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:76 (примерно 73,7% идентичности, т.е. 14 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), и полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:5 (примерно 79% идентичности, т.е. 15 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1).

Примеры аналога SEQ ID NO.:1, которые могут иметь, по меньшей мере, 70% идентичности, включают в себя, например, полипептид, содержащий (состоящий из) аминокислотную последовательность, определяемую последовательностью SEQ ID NO.:67 (примерно 73,7% идентичности, т.е. 14 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), в SEQ ID NO.:76 (примерно 73,7% идентичности, т.е. 14 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1), в SEQ ID NO.:5 (примерно 79% идентичности, т.е. 15 аминокислот из 19 аминокислот являются идентичными SEQ ID NO.:1).

Согласно изобретению, носитель более конкретно может быть выбран из группы, состоящей из пептидов №№ 5, 67, 76, 91 и пептида 97 (т.е. SEQ ID NO.: 5, 67, 76, 91 и 97 (Ангиопеп-2)).

Настоящее изобретение относится, в частности, к применению носителя в фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, для модификации и/или улучшения (in vivo) фармакокинетики соединения.

Согласно изобретению соединение может быть выбрано, например, из группы, состоящей из метки, белка, пептида и низкомолекулярного лекарственного соединения и их комбинаций.

Также согласно изобретению низкомолекулярное лекарственное соединение может являться, например, противораковым лекарственным средством.

Согласно изобретению противораковое лекарственное средство может быть конъюгировано с носителем, образуя при этом конъюгат. В примере осуществления изобретения конъюгат может содержать, например, по меньшей мере, одну молекулу противоракового лекарственного средства на каждую молекулу носителя. В другом примере осуществления изобретения конъюгат может содержать, по меньшей мере, две молекулы противоракового лекарственного средства на каждую молекулу носителя. В еще одном примере осуществления изобретения конъюгат может содержать, например, по меньшей мере, три молекулы противоракового лекарственного средства на каждую молекулу носителя.

Согласно изобретению носитель может усиливать накопление лекарственного средства в ткани, такой, например, как почка (ткань почки), печень (ткань печени), глаз (глазная ткань) и легкие (легочная ткань) индивидуума.

Также согласно изобретению носитель может модифицировать или улучшать биодоступность соединения.

Далее, согласно изобретению носитель также может изменять (обычное) распределение соединения в тканях.

Согласно изобретению носитель может также способствовать накоплению лекарственного средства в мозге (ткани мозга) индивидуума.

Согласно изобретению мозг может быть пораженным опухолью.

Далее, согласно изобретению мозг может содержать клетку рака легких.

Также согласно изобретению носитель может усиливать накопление лекарственного средства в раковой клетке (например, внутриклеточное накопление лекарственного средства в раковой клетке).

Используемый в данном документе термин «пораженный опухолью мозг» относится к мозгу, который содержит опухоль или первичную опухоль или метастазы, происходящие из других тканей, такие как без ограничений метастазы, происходящие из опухоли легкого, опухоли молочной железы, меланомы, опухоли прямой и ободочной кишки, опухоли органов мочевыделительной системы и др. Примеры клеток опухолей мозга, следовательно, включают в себя, например, глиобластомы и метастатическую клетку, происходящую, например, из легкого, молочной железы, толстой кишки, мочевыводящих путей или из меланомы.

Согласно изобретению носитель, следовательно, может быть использован, например, для снижения дозы лекарственного средства, необходимого для достижения такого же терапевтического эффекта (например, для достижения снижения роста опухолевых клеток и т.д.).

Настоящее изобретение далее относится к применению носителя, выбранного из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активных аналогов, производных или фрагментов и их комбинаций, для переноса соединения в желаемое место-мишень, желаемую ткань-мишень или желаемую клетку-мишень.

Примеры низкомолекулярных лекарственных средств, которые могут быть конъюгированы с носителем согласно изобретению и которые охватываются настоящей заявкой, включают в себя, например, и без ограничений Таксол, производное Таксола, винбластин, винкристин, этопозид, доксорубицин, циклофосфамид, Таксотер, мелфалан, хлорамбуцил, фармацевтически приемлемые соли и т.д. и их комбинации, а также лекарственное средство, которое может служить субстратом P-gp.

Другое низкомолекулярное лекарственное средство, охватываемое настоящим изобретением, может включать в себя, например, лекарственное средство, имеющее группу, позволяющую соединить его с носителем согласно изобретению.

Согласно изобретению примеры производных Таксола (или аналоги) включают в себя, например, производные, раскрытые и упоминаемые в патенте США № 6911549, выданном 28 июня 2005 года, полное содержание которого включено в данное описание посредством ссылки.

Примеры меток, которые могут быть конъюгированы с носителем согласно изобретению и которые охватываются данным описанием, включают в себя, например, и без ограничений изотоп, флуоресцентную метку (например, родамин), репортерную молекулу (например, биотин) и т.д.

Примеры белков, которые могут быть конъюгированы с носителем согласно изобретению и которые охватываются данным документом включают в себя без ограничения антитело, фрагмент антитела, лекарственное средство на основе пептида или белка (например, положительный фармакологический модулятор (агонист) или фармакологический ингибитор (антагонист) и т.д.

Настоящее изобретение связано также с применением носителя, выбранного из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активных аналогов, производных или фрагментов и их комбинаций, для усиления действия лекарственного средства. Более конкретно носитель может быть использован, например, для усиления действия лекарственного средства, которое может быть субстратом P-gp, или лекарственных средств, которые выталкиваются (т.е. удаляются, выбрасываются из клетки и т.д.) посредством P-gp или родственного P-gp белка (например, аллельного варианта P-gp человека или другого млекопитающего, например, изоформы mdr1a и/или mdr1b грызунов и т.д.).

Согласно изобретению носитель может, например, усиливать действия противоракового лекарственного средства, например, противоракового лекарственного средства, которое может являться субстратом P-gp.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение более конкретно относится к применению носителя, конъюгата или фармацевтической композиции, описанных в настоящей заявке, для усиления (оптимизации) эффекта противоракового лекарственного средства против роста опухолей.

Настоящее изобретение далее связано с применением носителя, выбранного из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активных аналогов, производных или фрагментов и их комбинаций, для переноса лекарственного средства или метки к или на желаемое место-мишень или для переноса лекарственного средства или метки внутрь клетки-мишени, и/или для усиления накопления лекарственного средства или метки внутри клетки, такой, например, как клетки, экспрессирующей P-gp на своей поверхности, или клетки, способной экспрессировать P-gp (на своей поверхности).

Носитель может быть использован, например, для усиления накопления внутри клетки лекарственного средства, которое характеризуется тем, что оно выталкивается из клетки (т.е. удалено, перенесено наружу клетки, выброшено) посредством P-gp или белка, родственного P-gp.

Согласно изобретению желательным местом локализации может являться, например, и без ограничений мозг или другие места вне мозга (например, вне черепа), такими, например, как почка, печень, поджелудочная железа, толстая кишка, глаза, легкие и их комбинация. Вследствие этого желательной мишенью может быть одна или более, выбранные из группы, состоящей из почки, печени, поджелудочной железы, толстой кишки, глаз, легких и их комбинации.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, клетка или ткань мозга.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, клетка или ткань печени.

В соответствии с дальнейшим конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, клетка или ткань почки.

В соответствии с еще одним дальнейшим конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, клетка или ткань поджелудочной железы.

В соответствии с другим конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, клетка или ткань толстой кишки.

В соответствии с еще одним конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, глаз или клетка глаза.

В соответствии с дальнейшим конкретным вариантом осуществления согласно изобретению желательной мишенью может быть, например, клетка или ткань легкого.

Далее согласно изобретению желательным место локализации может быть место, в котором находится клетка, экспрессирующая рецептор носителя или переносчик, например, клетка, экспрессирующая белок, родственный рецептору липопротеина низкой плотности (LRP). Клеткой может также быть клетка, которая совместно экспрессирует P-gp или родственный P-gp белок. Клеткой может быть, например, нормальная клетка, опухолевая клетка или метастатическая клетка. Носитель согласно изобретению может, следовательно, использоваться с тем, чтобы достичь клетки мозга, клетки печени, клетки почки, клетки поджелудочной железы, клетки толстой кишки, клетки глаза, клетки легкого и их комбинации (либо нормальной, либо опухолевой).

Настоящее изобретения также относится в своем более конкретном аспекте к применению носителя, описанного в настоящей заявке (например, такого, который может быть выбран из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов) или фармацевтической композиции, или конъюгата, описанных в настоящей заявке, для усиления внутриклеточного накопления соединения (т.е. усиления накопления соединения внутри клетки).

По одному из вариантов осуществления согласно изобретению соединение может быть выбрано, например, из группы, состоящей из метки, белка, пептида и низкомолекулярного лекарственного средства.

По дальнейшему варианту осуществления согласно изобретению клетка может являться клеткой, способной экспрессировать P-gp или которая экспрессирует P-gp. Более конкретно клетка может экспрессировать P-gp (MDR1) на клеточной поверхности.

Клетка может являться, например, опухолевой клеткой. Опухолевая клетка может происходить, например, и без ограничений из опухоли мозга, опухоли легкого, опухоли молочной железы, опухоли почки, опухоли глаза, опухоли печени, опухоли прямой и ободочной кишки, опухоли органов мочевыделительной системы и т.д.

Согласно изобретению клетка может находиться вне мозга индивидуума (млекопитающего, животного и т.д.). Например, клетка может являться опухолевой клеткой, которая может находиться вне мозга индивидуума (млекопитающего, животного и т.д.).

По дальнейшему варианту осуществления согласно изобретению клетка может находиться внутри мозга индивидуума. Клетка может являться, например, опухолевой клеткой, которая может находиться внутри мозга индивидуума (млекопитающего, животного и т.д.).

В примере осуществления согласно изобретению опухолевая клетка может являться клеткой опухоли мозга. Например, клетка опухоли мозга может происходить из глиобластомы или может являться глиобластомой.

В другом примере осуществления согласно изобретению опухолевая клетка может являться клеткой опухоли легкого.

Настоящее изобретение также относится в своем дополнительном аспекте к применению носителя, конъюгата или фармацевтической композиции, описанных в настоящей заявке, для уменьшения удаления лекарственного средства изнутри клетки, такой как, например, клетки, которая способна экспрессировать P-gp (MDR1) или которая экспрессирует P-gp. Согласно изобретению лекарственное средство может являться субстратом P-gp.

Также согласно изобретению клетка может являться раковой клеткой с множественной лекарственной резистентностью.

В своем еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к применению носителя, конъюгата или фармацевтической композиции, описанных в настоящей заявке, для уменьшения роста клетки. Для этой цели носитель может быть конъюгирован с лекарственным средством, которое может быть способно снижать рост клетки.

По неограничивающим примерам осуществления изобретения носитель, конъюгат, созданный таким образом, или фармацевтическая композиция могут быть использованы для уменьшения роста опухолевой клетки или эндотелиальной клетки.

В частном варианте осуществления изобретения опухолевая клетка может быть способна экспрессировать или экспрессирует P-gp (MDR1).

В примере осуществления изобретения опухолевая клетка может являться клеткой опухоли мозга. Более определенно клетка опухоли мозга может происходить из глиобластомы или может являться глиобластомой.

В другом примере осуществления изобретения опухолевая клетка может быть клеткой опухоли легкого.

В еще одном другом примере осуществления изобретения опухолевая клетка может являться клеткой опухоли молочной железы.

В дальнейшем примере осуществления изобретения опухолевая клетка может являться клеткой опухоли почки.

В еще одном дальнейшем примере осуществления изобретения опухолевая клетка может являться клеткой опухоли глаза.

В дополнительном примере осуществления изобретения опухолевая клетка может быть из рака прямой и ободочной кишки.

В еще одном дополнительном примере осуществления изобретения опухолевая клетка может быть из опухоли органов мочевыделительной системы.

В частном варианте осуществления изобретения противораковое лекарственное средство более определенно может являться Таксолом, Таксотером или производным Таксола или Таксотера.

По другому варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, винбластином.

По еще одному другому варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, винкристином.

По дальнейшему варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, этопозидом.

По дальнейшему варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, доксорубицином.

По дополнительному варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, циклофосфамидом.

По еще одному дополнительному варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, мелфаланом.

По еще одному другому варианту осуществления согласно изобретению противораковое лекарственное средство может являться, например, хлорамбуцилом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению носителя, описанного в настоящей заявке, в создании фармацевтической композиции или медикамента для модификации фармакокинетики низкомолекулярного лекарственного средства.

Более конкретно носитель может быть использован для уменьшения роста клетки.

Также более конкретно носитель может быть использован для усиления накопления низкомолекулярного лекарственного средства внутри клетки.

В дополнение носитель может быть использован для уменьшения удаления низкомолекулярного лекарственного средства из клетки.

Также носитель может быть использован для увеличения эффекта низкомолекулярного лекарственного средства против роста опухолей.

Кроме того, носитель может быть использован для улучшения биодоступности низкомолекулярного лекарственного средства.

В дополнение и согласно изобретению носитель может быть использован для изменения (обычного) распределения в тканях низкомолекулярного лекарственного средства.

В дополнение настоящее изобретение относится к применению носителя, выбранного из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активного аналога или комбинации, для лечения рака, метастазирующего рака и/или метастаза. Согласно изобретению примеры метастаза могут содержать без ограничений метастаз, который может происходить из опухоли молочной железы, опухоли легкого, меланомы и т.д.

Настоящее изобретение также относится к применению носителя, выбранного из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активных аналогов, производных или фрагментов и их комбинации, для обнаружения желаемой клетки-мишени.

Настоящее изобретение далее связано с применением носителя, выбранного из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активных аналогов, производных или фрагментов и их комбинации, для диагностики рака, метастазирующего рака и/или метастаза.

Настоящее изобретение дополнительно относится в дальнейшем аспекте к композиции (например, фармацевтической композиции), содержащей носитель (и/или его фармацевтически приемлемую соль) согласно изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение в дополнительном аспекте относится к конъюгату и/или к его фармацевтически приемлемой соли. Конъюгат может содержать, например, носитель, описанный в настоящей заявке, и лекарственное средство, метку или белок. Носитель может быть ковалентно присоединен к лекарству, метке, белку или пептиду.

Более конкретно конъюгат может содержать, например, носитель, выбранный из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2, их биологически активных аналогов, производных или фрагментов и их комбинации, и соединение, выбранное из группы, состоящей из лекарственного средства, метки, белка и их комбинации. Согласно изобретению конъюгат может содержать одну или более молекул лекарственного средства.

Также согласно изобретению соединение может или не может высвобождаться из носителя. Вследствие этого, соединение может быть высвобождаемым из конъюгата (или из носителя).

Согласно изобретению конъюгат может содержать формулу R-L-M, где R является классом молекул, относящихся к апротинину (например, апротинином, фрагментом апротинина, Ангиопепом-1, Ангиопепом-2, аналогами, производными или фрагментами), L может являться линкером или связью, а М может являться агентом или лекарственным средством, выбранным из группы, состоящей из лекарственного средства (например, низкомолекулярного лекарственного средства), метки, белка (например, антитела, фрагмента антитела) и полипептида. Из данного документа понятно, что формула R-L-M не должна быть ограничена определенным порядком или соотношением. Как показывают приведенные в данном документе примеры, могут быть несколько соотношений М и R.

Настоящее изобретение относится в своем дальнейшем аспекте к применению конъюгата, который может содержать а) носитель, который может быть выбран из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и b) по меньшей мере, одно низкомолекулярное лекарственное средство или метку, для модификации фармакокинетики (in vivo) лекарственного средства или метки, которые к нему присоединены.

Согласно одному варианту осуществления согласно изобретению конъюгат может быть более конкретно использован для уменьшения роста клеток.

Далее согласно изобретению конъюгат может быть использован для усиления накопления низкомолекулярного лекарственного средства или метки внутри клетки.

Также согласно изобретению конъюгат может также быть использован для уменьшения удаления низкомолекулярного лекарственного средства или метки из клетки.

Далее согласно изобретению конъюгат может быть использован для увеличения эффекта низкомолекулярного лекарственного средства против роста опухоли.

Также согласно изобретению конъюгат может улучшить биодоступность соединения.

Далее согласно изобретению конъюгат может также изменить распределение соединения в тканях.

В одном варианте осуществления изобретения низкомолекулярное лекарственное средство может быть способно уменьшать рост клеток.

Настоящее изобретение также связано в своем дальнейшем аспекте с применением конъюгата, который может содержать а) носитель, который может быть выбран из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и b) по меньшей мере, одно низкомолекулярное лекарственное средство или метку, в изготовлении (производстве) фармацевтической композиции или медикамента для модификации фармакокинетики низкомолекулярного лекарственного средства.

Настоящее изобретение относится также к применению носителя в производстве композиции или медикамента для лечения заболевания, такого как рак, метастазирующий рак и/или метастаз.

Настоящее изобретение также связано в своем дальнейшем аспекте с применением конъюгата, который может содержать а) носитель, который может быть выбран из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и b) по меньшей мере, одно низкомолекулярное лекарственное средство или метку для детектирования клетки, которая может быть выбрана, например, из группы, состоящей из клетки глаза, клетки мозга, клетки молочной железы, клетки печени, клетки почки, клетки органов мочевыделительной системы, клетки толстой кишки, клетки прямой кишки и клетки легкого.

В частном варианте осуществления согласно изобретению клетка, которая может быть детектирована, может быть, например, клеткой глаза.

В другом частном варианте осуществления согласно изобретению клетка, которая может быть детектирована, может быть, например, клеткой глаза.

В дополнительном частном варианте осуществления согласно изобретению клетка, которая может быть детектирована, может быть, например, клеткой печени.

В еще одном дополнительном варианте осуществления согласно изобретению клетка, которая может быть детектирована, может являться, например, клеткой молочной железы.

В другом частном варианте осуществления согласно изобретению клетка, которая может быть детектирована, может являться, например, клеткой почки.

В еще одном другом частном варианте осуществления согласно изобретению клетка, которая может быть детектирована, может являться, например, клеткой легкого.

Настоящее изобретение дополнительно относится к составу (например, фармацевтической композиции), содержащему конъюгат согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, может быть использована, например, в лечении или детектировании рака, метастазирующего рака и/или метастаза.

Настоящее изобретение связано в своем частном аспекте с фармацевтической композицией, которая может быть способна, например, уменьшать рост клеток или способна детектировать клетку, при этом фармацевтическая композиция может включать в себя

а) конъюгат, который может содержать носитель, выбранный из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и метку или низкомолекулярное лекарственное средство, способное уменьшать рост клеток, и

b) фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также связано в своем дальнейшем аспекте с фармацевтической композицией, которая может включать в себя

а) конъюгат, который может содержать носитель, выбранный из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и низкомолекулярное лекарственное средство или метку,

b) фармацевтически приемлемый носитель и

c) солюбилизатор.

Согласно настоящему изобретению солюбилизатор может быть, например, полиоксиэтиленовым эфиром жирной кислоты. Солюбилизаторы, охватываемые настоящим изобретением, включают в себя, например, Solutol® HS-15.

Как пример осуществления согласно изобретению подходящий солюбилизатор может включать в себя без ограничений полиоксиэтиленовый эфир жирной кислоты, такой, например, как Solutol® HS-15.

В качестве примера осуществления согласно изобретению фармацевтическая композиция может быть более конкретно использована для модификации фармакокинетики соединения, для уменьшения роста опухолевых клеток или для детектирования опухолевой клетки и т.д.

Настоящее изобретение далее относится к применению, по меньшей мере, одного конъюгата согласно изобретению для лечения рака, метастазирующего рака и/или метастаза. Согласно изобретению примером метастаза, который можно лечить с использованием конъюгата согласно изобретению, является метастаз, который может происходить, например и без ограничения, из опухоли молочной железы, опухоли легкого, меланомы и т.д.

Настоящее изобретение также связано в другом своем аспекте со способом лечения рака (такого, например, как первичная опухоль или метастазирующий рак и/или метастаз) или для детектирования раковой клетки, где указанный способ включает в себя введение индивидууму фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, или конъюгата, который может содержать а) носитель, выбранный из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и b) противораковое лекарственное средство или метку.

Согласно настоящему изобретению индивидуум может иметь, например, экстракраниальную опухоль, первичную опухоль мозга или опухоль мозга метастатического происхождения.

Способ может также включать в себя стадию оценки того, содержит ли опухоль индивидуума клетку, обладающую множественной лекарственной резистентностью, или, например, клетку, экспрессирующую P-gp (MDR1), или стадию определения того, может ли опухоль иметь или имеет ли она фенотип множественной лекарственной резистентности.

Индивидуум может быть лицом, имеющим опухоль. Индивидуум может также являться лицом, которое получало или которое будет получать химиотерапию или радиотерапию или их вместе. Индивидуум может также являться лицом, которое подвергалось хирургическому вмешательству. Кроме того, индивидуум может являться лицом, имеющим опухоль мозга, или лицом, имеющим опухоль, находящуюся не в мозге (свободным от опухоли мозга). Нуждающимся в лечении индивидуумом может также быть, например, индивидуум, который имеет резистентность или находится под угрозой приобретения резистентности (фенотип множественной лекарственной резистентности (MDR)), по меньшей мере, к одному лекарству.

Более конкретно и согласно изобретению индивидуум может иметь, например, экстракраниальную опухоль.

Согласно изобретению экстракраниальная опухоль может быть, например, опухолью легкого.

Также согласно изобретению экстракраниальная опухоль может быть, например, экстракраниальным метастазом опухоли мозга. В более определенном варианте осуществления согласно изобретению экстракраниальная опухоль может быть, например, глиобластомой (экстракраниальным метастазом глиобластомы).

В другом частном варианте осуществления согласно изобретению индивидуум может иметь опухоль мозга метастатическую природу. Опухоль мозга метастатической природы может происходить, например, из рака легкого. Опухоль мозга метастатической природы может также происходить, например, из рака молочной железы. Дополнительно опухоль мозга метастатической природы может также происходить, например, из меланомы. Кроме того, и как описано в настоящей заявке, опухоль мозга метастатической природы может также происходить, например, из рака прямой и ободочной кишки. В дополнение опухоль мозга метастатической природы может также происходить, например, из опухоли органов мочевыделительной системы.

Согласно изобретению опухоль может содержать опухолевую клетку, которая может быть способна экспрессировать P-gp или которая экспрессирует P-gр.

Согласно изобретению опухоль может содержать опухолевую клетку, которая может быть способна экспрессировать LRP или которая экспрессирует LRP.

Согласно изобретению опухоль может содержать опухолевую клетку, которая может быть способна совместно экспрессировать P-gp и LRP или которая совместно экспрессирует P-gр и LRP. P-gр и LRP могут находиться, например, на поверхности клетки.

Более конкретно, настоящее изобретение в своем аспекте относится к способу усиления накопления лекарственного средства в мозге индивидуума, имеющего метастаз. Способ может включать в себя введение носителя или конъюгата, как описано в данной заявке, индивидууму, имеющему метастаз в мозге. Согласно изобретению метастаз может происходить из рака легкого и т.д.

Настоящее изобретение связано в своем дополнительном аспекте со способом усиления внутриклеточного накопления соединения, выбранного из группы, состоящей из метки, белка, пептида и низкомолекулярного лекарственного средства.

Способ может включать в себя стадию контактирования клетки с конъюгатом или стадию представления клетке конъюгата, который может содержать а) носитель, который может быть выбран из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов, и b) желаемого соединения.

Согласно изобретению клетка может быть, например, клеткой, экспрессирующей P-gp.

Далее, согласно изобретению клетка может быть, например, клеткой мозга, клеткой легкого, клеткой молочной железы, клеткой почки, клеткой глаза или клеткой печени.

Также согласно изобретению клетка может быть, например, опухолевой клеткой, которая находится вне мозга индивидуума (млекопитающего, животного и т.д.).

Настоящее изобретение также связано еще в одном дополнительном аспекте со способом уменьшения удаления лекарственного средства из клетки, которая способна экспрессировать или экспрессирует P-gp (MDR1).

Способ может включать в себя конъюгацию лекарственного средства с носителем, описанным в настоящей заявке, посредством чего образуется конъюгат и представление клетке конъюгата.

В примере осуществления изобретения клетка может быть раковой клеткой с множественной лекарственной резистентностью.

В дальнейшем примере осуществления изобретения клетка может содержаться внутри экстракраниальной опухоли индивидуума.

В дополнительном примере осуществления изобретения клетка может содержаться внутри мозга индивидуума. Клетка может быть клеткой опухоли, такой например, как клетка опухоли мозга (первичной) или клетка метастазирующей опухоли мозга.

Средством для представления клетке конъюгата является, например, представление конъюгата индивидууму, который имеет клетку со множественной лекарственной резистентностью или клетку опухоли со множественной лекарственной резистентностью (например, клетку, которая экспрессирует MDR1).

Согласно изобретению способ может быть использован для уменьшения удаления лекарственного средства, которое является субстратом P-gp или которое может быть субстратом P-gp.

В другом аспекте настоящее изобретение связано со способом уменьшения роста клеток. Способ может включать в себя приведение клетки в контакт с конъюгатом, который может содержать а) носитель, который может быть выбран из группы, состоящей из апротинина, биологически активного фрагмента апротинина, Ангиопепа-1, Ангиопепа-2 и их биологически активных аналогов, производных или фрагментов; и b) лекарственное средство, способное уменьшать рост клеток, или с фармацевтической композицией, описанной в настоящей заявке.

Согласно изобретению носитель может быть использован для усиления действия (действенности, эффективности) низкомолекулярного лекарственного средства.

Также согласно изобретению конъюгирование низкомолекулярного лекарственного средства с носителем может быть достигнуто посредством нескольких способов, которые могут включать в себя применение линкера (например, линкера, способного образовывать сложноэфирную связь), который может связываться с лекарственным средством через подходящий атом, например, через атом кислорода.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение связано со способом модификации фармакокинетики соединения, которое может быть выбрано, например, из группы, состоящей из метки, белка, пептида и низкомолекулярного лекарственного средства, при этом способ может включать в себя стадию конъюгирования соединения с носителем, описанным в настоящей заявке, с образованием, таким образом, конъюгата и доставкой конъюгата нуждающемуся в этом индивидууму.

Согласно изобретению соотношение из одной молекулы соединения на каждую молекулу носителя может быть использовано на стадии конъюгирования.

Далее, согласно изобретению соотношение из двух молекул соединения на каждую молекулу носителя может быть использовано на стадии конъюгирования.

Также согласно изобретению соотношение из, по меньшей мере, из трех молекул соединения на каждую молекулу носителя может быть использовано на стадии конъюгирования.

В конкретном варианте осуществления изобретения соединение может быть, например, низкомолекулярным лекарственным средством.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения соединение может быть, например, меткой.

Согласно изобретению индивидуум может более конкретно быть индивидуумом, имеющим опухоль. Например, индивидуум может иметь опухоль мозга. Согласно изобретению опухоль мозга может быть, например, первичной опухолью мозга. Также согласно изобретению опухоль мозга может происходить, например, из ткани, отличной от ткани мозга.

В примере осуществления согласно изобретению опухоль мозга индивидуума может быть, например, экстракраниальной опухолью мозга.

Согласно изобретению опухоль может содержать опухолевую клетку, которая экспрессирует или которая способна экспрессировать P-gp (MDR1).

Опухоль мозга может происходить, например, из опухоли легкого. Опухоль мозга может также происходить, например, из опухоли молочной железы. Также, например, опухоль мозга может происходить из меланомы.

Согласно конкретному варианту осуществления изобретения заявленным способом может увеличивать (оптимизировать), например, эффект противоракового лекарственного средства против роста опухоли (по сравнению с неконъюгированным лекарственным средством).

По другому конкретному варианту осуществления согласно изобретению способ может усиливать, например, накопление соединения в клетке (т.е. внутри клетки).

По еще одному другому конкретному варианту осуществления согласно изобретению способ может позволить снизить удаления низкомолекулярного лекарственного средства из клетки (например, клетки, экспрессирующей P-gp).

По дополнительному варианту осуществления согласно изобретению способ может позволить уменьшить рост клеток (например, уменьшить рост опухолевых клеток).

Кроме того, способ может позволить улучшить биодоступность низкомолекулярного лекарственного средства.

В дополнение и согласно изобретению способ может быть использован для изменения (обычного) распределения в тканях низкомолекулярного лекарственного средства.

В еще одном дальнейшем аспекте настоящее изобретение связано с применением носителя, конъюгата или фармацевтической композиции, описанных в настоящей заявке, для уменьшения LRP-зависимого накопления RAP и для уменьшения опосредуемого RAP клеточного (например, внутриклеточного) события или эффекта.

Для целей согласно изобретению ниже определены следующие термины.

Термин «Ангиопеп», используемый в этом описании, относится к Ангиопепу-1 и Ангиопепу-2.

Термины «Таксол-Ангиопеп» и «TxlAn» используются взаимозаменяемо и относятся к Таксолу-Ангиопепу-1 и Таксолу-Ангиопепу-2, содержащим 1, 2 или 3 молекулы Таксола.

Термины «Таксол-Ангиопеп-1» и «TxlAn1» используются взаимозаменяемо и относятся к Таксолу-Ангиопепу-1, содержащему 1, 2 или 3 молекулы Таксола.

Термины «Таксол-Ангиопеп-2» и «TxlAn2» используются взаимозаменяемо и относятся к Таксолу-Ангиопепу-2, содержащему 1, 2 или 3 молекулы Таксола.

Термин «TxlAn1 (2:1)» относится к соотношению молекул Таксола и Ангиопепа-1 в данном конъюгате. Например, термин «TxlAn1 (2:1)» относится к конъюгату, имеющему 2 молекулы Таксола, связанные с одной молекулой Ангиопепа-1. В дополнение термин «TxlAn1 (3:1)» относится к конъюгату, имеющему 3 молекулы Таксола, связанные с одной молекулой Ангиопепа-1.

Таким же образом, термин «TxlAn2 (2:1)» относится к соотношению молекул Таксола и Ангиопепа-2 в данном конъюгате. Например, термин «TxlAn1 (2:1)» относится к конъюгату, имеющему 2 молекулы Таксола, связанные с одной молекулой Ангиопепа-2. В дополнение термин «TxlAn1 (3:1)» относится к конъюгату, имеющему 3 молекулы Таксола, связанные с одной молекулой Ангиопепа-2.

Термин «носитель» или «вектор» означает соединение или молекулу, способные переносить молекулу к желаемым месту-мишени или клетке-мишени. Носитель может быть прикреплен (ковалентно или нековалентно) или конъюгирован с другим соединением или агентом и таким образом, может быть способен переносить другое соединение или агент в желаемое место-мишень. Носитель может являться, но не ограничен этим, белком, пептидом или пептидомиметиком, и может являться природным или полученным посредством химического синтеза или методов рекомбинантных ДНК (генной инженерии).

Выражение «низкомолекулярное лекарственное средство» означает лекарственное средство, имеющее молекулярный вес 1000 г/моль или меньше, или между 300 и 700 г/моль.

Термины «лечение», «лечащий» и т.п. означают получение желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта, например, ингибирования роста раковой клетки, смерть раковой клетки или облегчение неврологической болезни или заболевания. Эффект может быть профилактическим, в виде полного или частичного предотвращения болезни или ее симптома и/или может быть терапевтическим в виде частичного или полного излечения болезни и/или негативного эффекта, присущего болезни. «Лечение», используемое в этом описании, охватывает любое лечение болезни у млекопитающего, особенно у человека, и включает в себя (а) предотвращение появления болезни (например, предотвращение рака) или заболевания у индивидуума, который может быть предрасположен к болезни, но до сих пор не был диагностирован как имеющий ее; (b) ингибирование болезни (например, останавливая ее развитие); или (c) облегчение течения болезни (например, уменьшение симптомов, связанных с болезнью). «Лечение», используемое в настоящем описании, охватывает любое введение фармацевтического агента или соединения индивидууму для лечения, излечения, облегчения, улучшения, уменьшения или ингибирования заболевания у индивидуума, включая без ограничений введение лекарственного средства, содержащего носитель, описанный в настоящей заявке, или конъюгата нуждающемуся в них индивидууму.

Термин «рак» означает любое клеточное злокачественное новообразование, чьим уникальным признаком является потеря нормального контроля, что приводит к нерегулируемому росту, отсутствию дифференцировки и способности проникать в местные ткани и образовывать метастазы. Рак может развиться в любой ткани любого органа. Более определенно, рак подразумевает включение без ограничений рака мозга.

Термины «вводящийся» или «введение» означают тип доставки, включая без ограничений внутриартериальный, интраназальный, внутрибрюшинный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, чрескожный или пероральный. Суточная доза может быть разделена на одну, две или более доз в подходящей форме для введения один, два или более раз за определенный период.

Термины «терапевтически эффективный» или «эффективное количество» означают количество соединения, достаточное для значительного улучшения некоторого симптома, связанного с болезнью или болезненным состоянием. Например, при лечении рака агент или соединение, которые уменьшают, предотвращают, откладывают, подавляют или останавливают любой симптом болезни или заболевания, являлись бы терапевтически эффективными. Терапевтически эффективное количество агента или соединения требуется не для излечения болезни или состояния, а для обеспечения лечения болезни или состояния, таким образом, чтобы болезнь или заболевание удавалось отложить, замедлить или предотвратить, или облегчить симптомы болезни или состояния, или изменить продолжительность болезни или состояния, или, например, сделать их течение менее тяжелым, или восстановление индивидуума ускоренным.

Носитель и конъюгат согласно изобретению могут быть использованы в комбинации с любыми общими способами лечения и/или терапии или могут быть использованы отдельно от общих способов лечения и/или терапии.

Когда конъюгаты согласно изобретению вводят в комбинационной терапии с другими агентами, их можно вводить индивидууму последовательно или одновременно. В качестве альтернативы фармацевтические композиции согласно изобретению могут состоять из комбинации конъюгата носитель-агент согласно изобретению совместно с фармацевтически приемлемым носителем или фармацевтически приемлемым наполнителем, как описано в настоящей заявке, и другим терапевтическим или профилактическим агентом, известным в данной области.

Фармацевтически приемлемые соли (присоединения) кислот могут быть получены посредством способов, известных и используемых в данной области.

Используемый в данном описании термин «фармацевтическая композиция» означает терапевтически эффективные количества агента вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. «Терапевтически эффективное количество», используемое в настоящем описании, относится к количеству, которое обеспечивает терапевтический эффект для данных заболевания и схемы введения. Такие композиции являются жидкостями или лиофилизованными или как-либо иначе высушенными рецептурами и включают в себя разбавители с различными буферными составами (например, Tris-HCl, ацетат, фосфат), различными значениями рН и ионной силы, добавки, такие как альбумин или желатин для предотвращения абсорбции на поверхностях, детергенты (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчных кислот). Солюбилизирующие агенты (например, глицерин, полиэтиленглицерин), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консерванты (например, тимерозал, бензиловый спирт, парабены), наполнители или модификаторы тоничности (например, лактоза, маннит), ковалентное присоединение полимеров, таких как полиэтиленгликоля, к белку, образование комплексов с ионами металлов или включение материала в или на препараты частиц полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т.д., или в липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные и многослойные везикулы, тени эритроцитов или сферопласты. Такие композиции будут влиять на агрегатное состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость вывода вещества из организма in vivo. Композиции с контролируемым или замедленным высвобождением включает в себя рецептуры в составе липофильных депо (например, жирных кислот, восков, масел). Также охваченными изобретением являются композиции в виде частиц, покрытых полимерами (например, полоксамерами или полоксаминами). Другие варианты осуществления композиций согласно изобретению включают в себя защитные оболочки препарата, находящегося в виде частиц, ингибиторы протеаз или усилители проникновения для различных путей введения, включая парентеральный, легочный, назальный, пероральный, вагинальный, ректальный пути. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтическую композицию вводят парентерально, вне раковой опухоли, через слизистую, через кожу, внутримышечно, внутривенно, внутрикожно, подкожно, внутрибрюшинно, интравентрикулярно, интракраниально и внутрь опухоли.

Далее, используемые здесь термины «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтический носитель» известны в данной области и включают в себя, но не ограничены этим, 0,01-0,1 М или 0,05 М фосфатный буфер или 0,8% солевой раствор. Дополнительно такие фармацевтически приемлемые носители могут быть буфером, водными или неводными растворами, суспензиями и эмульсиями. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и подходящие для инъекций органические эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают в себя воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая солевые и забуференные среды. Носители для парентерального введения включают в себя раствор хлорида натрия, раствор декстрозы в растворе Рингера, раствор декстрозы и хлорида натрия, раствор Рингера или нелетучие масла. Внутривенные носители включают в себя жидкостные компенсаторы и компенсаторы питательных веществ, компенсаторы электролитов, такие как основанные на растворе декстрозы в растворе Рингера и т.п. Могут присутствовать также консерванты и другие добавки, такие, например, как противомикробные средства, антиоксиданты, объединяющие агенты, инертные газы и т.п.

«Фрагмент» следует понимать в данном документе как полипептид, происходящий из (охватывающий) части исходной или родительской последовательности. Фрагменты охватывают полипептиды, которые укорочены на одну или более аминокислот, в которых эти аминокислоты могут быть удалены с аминоконца (N-конца), карбоксильного конца (С-конца) или из середины белка. Фрагмент может содержать ту же последовательность, что и соответствующая часть исходной последовательности. Биологически активные фрагменты носителя, описанные в данной заявке, входят в объем настоящего изобретения.

«Производное» в отношении белков или пептидов следует понимать в этом описании как полипептид, происходящий из исходной последовательности или части исходной последовательности и который может содержать одну или более модификаций; например, одну или более модификаций в аминокислотной последовательности (например, добавление, делецию, вставку, замену и т.д. аминокислот) и одну или более модификаций в каркасной или боковой цепи одной или более аминокислот, или добавление группы или другой молекулы к одной или более аминокислотам (боковой цепи или каркаса). Биологически активные производные носителя, описанные в настоящей заявке, являются охваченными настоящим изобретением.

«Аналог» в отношении белков или пептидов следует понимать в данном документе как молекулу, имеющую биологическую активность и химическую структуру, сходные с полипептидом, описанным в настоящей заявке. Аналог содержит полипептид, который может иметь, например, одну или более аминокислотных вставок или на одном или обоих концах полипептида, и/или внутри аминокислотной последовательности полипептида.

«Аналог» может иметь сходство по последовательности с исходной последовательностью или частью исходной последовательности и может также иметь модификацию своей структуры, обсуждаемую в данном документе. Например, «аналог» может иметь, по меньшей мере, 90% гомологии с исходной последовательностью или частью исходной последовательности. «Аналог» также может иметь, по меньшей мере, 70% или даже 50% гомологии с исходной последовательностью или частью исходной последовательности. «Аналог» может иметь, например, 50, 70, 80 или 90% гомологии с исходной последовательностью вместе с комбинацией из одной или более модификаций в каркасе или боковой цепи аминокислот или добавлением группы или другой молекулы и т.д. Аминокислоты, считающиеся похожими друг на друга (консервативные аминокислоты), известны в данной области и включают в себя, например, те, что перечислены в таблице 1.

В дополнение «аналог» может иметь, по меньшей мере, 50, 70, 80 или 90% гомологии с исходной последовательностью или частью исходной последовательности. Также «аналог» может иметь, например, 50, 70, 80 или 90% гомологии с исходной последовательностью вместе с комбинацией из одной или более модификаций в каркасе или боковой цепи аминокислоты или добавлением группы или другой молекулы и т.д.

Сходство или идентичность могут быть получены путем сравнения, например, участка протяженностью в 2, 3, 4, 5, 10, 19, 20 аминокислот или более (и любого числа в этих пределах). Идентичность может включать в себя в данном документе аминокислоты, которые являются идентичными исходному пептиду и которые могут занимать то же самое или сходное положение при сравнении с исходным полипептидом. Аналог, который имеет, например, 50% идентичности с исходным полипептидом, может включать в себя, например, аналог, содержащий 50% аминокислот исходного полипептида, и то же самое верно и для других процентных соотношений. Следует понимать в данном документе, что разрывы могут быть найдены между аминокислотами аналогов, которые являются идентичными или похожими на аминокислоты исходного пептида. Разрывы могут не включать в себя аминокислоты или включать в себя одну или более аминокислот, которые не являются идентичными или похожими на исходный пептид. Биологически активные аналоги носителя согласно изобретению являются охваченным настоящим описанием.

Поэтому биологически активные полипептиды в виде исходных полипептидов, фрагментов (модифицированных или нет), аналогов (модифицированных или нет), производных (модифицированных или нет), гомологов (модифицированных или нет) носителя, описанные в настоящей заявке, являются охваченными настоящим изобретением.

Вследствие этого любой полипептид, имеющий модификацию по сравнению с исходным полипептидом, которая существенно не разрушает желаемую биологическую активность, входит в объем данного изобретения. В данной области хорошо известно, что для полипептидов согласно изобретению может быть проведен ряд модификаций без разрушительного воздействия на их биологическую активность. Эти модификации могут, с другой стороны, сохранять или увеличивать биологическую активность исходного полипептида или могут оптимизировать одну или более характеристик (например, стабильность, биодоступность и т.д.) полипептидов согласно изобретению, которые в ряде случаев могут быть нужны или желательны. Полипептиды согласно изобретению содержат, например, аминокислотные последовательности, модифицированные или посредством естественных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с помощью химических методов модификации, которые известны в данной области.

Модификации могут находиться в полипептиде где угодно, включая полипептидный каркас, боковые цепи аминокислот и амино- и карбокси-концы. Следует понимать, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одинаковой или различных степенях на нескольких участках в данном полипептиде. Также данный полипептид может содержать множество типов модификаций. Полипептиды могут быть разветвленными в результате убиквитинирования, и они могут быть циклическими, с разветвлением или без него. Циклические, разветвленные и циклические разветвленные полипептиды могут быть результатом природного посттрансляционного процессинга или могут быть созданы синтетическим способами. Модификации включают в себя, например, без ограничений модификацию с помощью ПЭГ, ацетилирование, ацилирование, добавление ацетомидометильной (Acm) группы, АДФ-рибозилирование, алкилирование, амидирование, биотинилирование, карбамоилирование, карбоксиэтилирование, этерификацию, ковалентное присоединение к флавину, ковалентное присоединение к гему, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение лекарственного средства, ковалентное присоединение маркера (например, флуоресцентного, радиоактивного и т.д.), ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, кросс-сшивку, циклизацию, образование дисульфидных связей, деметилирование, образование ковалентных кросс-сшивок, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование гликозилфосфатидилинозитного (GPI) якоря, гидроксилирование, йодирование, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитическое расщепление, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфирование, опосредованное т-РНК добавление аминокислот к белкам, такое как аргинилирование и убиквитинирование, и т.д. Из данного документа понятно, что более чем одна модификация полипептида, описанного в настоящей заявке, являются охваченными настоящим изобретением при условии, что биологическая активность сходна с активностью исходного (родительского) полипептида.

Как описано выше, полипептидная модификация может содержать, например, аминокислотную вставку (т.е. дополнение), делецию и замещение (т.е. замену), либо консервативную, либо неконсервативную (например, D-аминокислоты, дезаминированные кислоты) в полипептидной последовательности, где такие замены не влияют существенно на общую биологическую активность полипептида.

Примерами замещений могут являться консервативные (т.е. где основание замещено на другое того же типа или группы) или при желании неконсервативные (т.е. где основание замещено аминокислотой другого типа). В дополнение неприродные аминокислоты могут замещать природные аминокислоты (а именно неприродное консервативное аминокислотное замещение или неприродное неконсервативное аминокислотное замещение).

Как известно, природные аминокислоты могут быть разделены на подклассы как кислые, основные, нейтральные и полярные или нейтральные и неполярные аминокислоты. Кроме того, три из кодируемых аминокислот являются ароматическими. Возможно такое применение, что кодируемые полипептиды, отличающиеся от определенного полипептида согласно изобретению, содержат замещенные кодоны для аминокислот, которые принадлежат к тому же типу или группе, что и замещаемая аминокислота. Следовательно, базовые аминокислоты Lys, Arg и His могут быть взаимозаменяемы; кислые аминокислоты Asp и Glu могут быть взаимозаменяемы; нейтральные полярные аминокислоты Ser, Thr, Cys, Gln и Asn могут быть взаимозаменяемы; неполярные алифатические аминокислоты Gly, Ala, Val, Ile и Leu могут быть взаимозаменяемы, но в силу своих размеров Gly и Ala более близки друг другу, а Val, Ile и Leu являются более близкими друг другу, и ароматические аминокислоты Phe, Trp и Tyr могут быть взаимозаменяемы.

Далее следует отметить, что если полипептиды получены синтетическим способом, можно также осуществить замены аминокислот, которые в природе не кодируются ДНК (не встречающиеся в природе или неприродные аминокислоты).

Неприродная аминокислота понимается здесь как аминокислота, которая не продуцируется в природе или не найдена у млекопитающих. Неприродная аминокислота содержит D-аминокислоту, аминокислоту, имеющую ацетиламинометильную группу, присоединенную к атому серы цистеина, аминокислоту, модифицированную ПЭГ, и т.д. Включение неприродных аминокислот в определяемую полипептидную последовательность будет, следовательно, генерировать производное исходного полипептида. Неприродные аминокислоты (остатки) включают в себя также омега-аминокислоты с формулой NH₂(CH₂)_nCOOH, где n равно от 2 до 6, нейтральные неполярные аминокислоты, такие как саркозин, т-бутилаланин, т-бутилглицин, N-метилизолейцин, норлейцин и т.д. Фенилглицин может замещать Trp, Tyr или Phe; цитруллин и метионина сульфоксид являются нейтральными неполярными, цистеиновая кислота является кислой, орнитин является основным. Пролин может быть замещен гидроксипролином и сохранять свойства, придающие конформацию.

В данной области известно, что аналоги могут создаваться с помощью замещающего мутагенеза и сохранять биологическую активность полипептидов согласно изобретению. Эти аналоги имеют, по меньшей мере, один удаленный аминокислотный остаток в белковой молекуле и вставленный на его место отличный от него остаток. Примеры замен, определяемых как «консервативные замены», приведены в таблице 1. Если такие замены приводят к нежелательным изменениям, тогда другой тип замен, обозначенный как «примеры замен» в таблице 1 или далее описанный в настоящей заявке в ссылке на классы аминокислот, встраивается, и продукты экспрессии подвергаются скринингу.

В некоторых случаях может представлять интерес модификация биологической активности полипептида посредством замещения, встраивания или удаления аминокислот. Например, модификация полипептида может приводить к увеличению биологической активности пептида, может модулировать его токсичность, может приводить к изменениям в биодоступности или стабильности или может модулировать его иммунологическую активность или иммунологическую идентичность. Значительные модификации функции или иммунологической идентичности выполняются посредством выбора замен, которые существенно отличаются своим действием на поддержание (а) структуры полипептидного каркаса в месте замещения, например, в виде складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в участке-мишени или (c) габаритов боковой цепи. Природные остатки разделяют на группы на основе общих свойств боковых цепей

(1) гидрофобные: норлейцин, метионин (Met), аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile)

(2) нейтральные гидрофильные: цистеин (Cys), серин (Ser), треонин (Thr)

(3) кислые: аспарагиновая кислота (Asp), глутаминовая кислота (Glu)

(4) оснόвные: аспарагин (Asn), глутамин (Gln), гистидин (His), лизин (Lys), аргинин (Arg)

(5) основания, влияющие на ориентацию цепи: глицин (Gly), пролин (Pro); и ароматические: триптофан (Trp), тирозин (Tyr), фенилаланин (Phe)

Неконсервативные замены будут связаны с заменами члена одного из этих классов на другой.

Таблица 1

Аминокислотные замены

Биологически активный аналог может быть, например, аналогом, имеющим, по меньшей мере, одну консервативную аминокислотную замену в исходной последовательности. Биологически активный аналог может также быть, например, аналогом, имеющим встроенную аминокислоту.

Например, аналог Ангиопепа-1 может иметь формулу I: Х₁-Ангиопеп-1-Х₂.

Например, аналог Ангиопепа-2 может иметь формулу II: Х₁-Ангиопеп-2-Х₂.

Х₁ и Х₂ могут являться независимо аминокислотной последовательностью, размером от 0 примерно до 100 (например, между 0 и примерно 60) аминокислот. Х₁ и Х₂ могут быть получены из последовательных аминокислот апротинина или аналогов апротинина (гомологичная аминокислотная последовательность) или могут быть любой другой аминокислотной последовательностью (гетерологичная аминокислотная последовательность). Соединение любой из формул I или II может также содержать аминокислотную замену, делецию или вставку внутри аминокислотной последовательности Ангиопепа-1 или Ангиопепа-2. Аналог, однако, предпочтительно будет биологически активным, что определяется одним из методов анализа, описанных в настоящей заявке или путем похожих или равноценных методов анализа.

Примеры аналогов апротинина могут быть найдены в результате поиска гомологов (с использованием, например, алгоритма BLAST (основное средство поиска локального соответствия) для сравнения синтетической последовательности апротинина (или ее части), раскрытой в международной заявке № РСТ/СА2004/000011, информация о последовательности которого хранится в доступных многочисленных базах данных, например, в Интернете. Национальный Центр по Биотехнологической Информации (NCBI) предлагает программное обеспечение, включающее алгоритм BLAST. Примеры аналогов апротинина могут быть найдены, например, под номерами доступа №№ CAA37967 (GI:58005), 1405218C (GI:3604747) и т.д.

Биологически активный фрагмент полипептида (например, из 19 аминокислот), описанный в настоящей заявке, может включать в себя, например, полипептид длиной примерно от 7, 8, 9 или 10 до 18 аминокислот.

Биологически активный полипептид (например, носитель) может быть идентифицирован посредством одного из методов анализа или способов, описанных в данной заявке. Например, носитель-кандидат может быть получен посредством обычного пептидного синтеза, конъюгирован с Таксолом, как описано в настоящей заявке, и испытан на модели in vivo, как описано в примере 5. Можно идентифицировать биологически активный носитель, например, на основе его эффективности в уменьшении массы опухоли по сравнению с таковой у мышей, получавших плацебо. Низкомолекулярное лекарственное средство-кандидат, которое может быть использовано в конъюгате с носителем, описанным в настоящей заявке, можно идентифицировать, например, определяя то, выталкивается ли или нет лекарственное средство из клеток, сверхэкспрессирующих P-gp, как описано в настоящей заявке, и оценивая то, увеличивает ли конъюгирование лекарственного средства с носителем его накопление внутри желаемой клетки.

Примеры биологически активного носителя (т.е. биологически активного аналога Ангиопепа-1 и/или Ангиопепа-2) могут включать в себя, например, пептиды, полученные из домена Кунитца, таких как TFFYGGCRGKRNNFKTKEY, RFKYGGCLGNKNNYLRLKY и TFFYGGCRAKRNNFKRAKY.

Другие примеры биологически активных аналогов можно найти в таблице 2 и в списке последовательностей.

Таблица 2: структура 96 пептидов из домена, похожего на апротинин и Ангиопеп-1, с различными зарядами и аминокислотными вставками

96 пептидов, заказанных в компании SYNPEP (California, USA)

Из описания понятно, что если «границы» или «группа веществ» упоминаются в отношении конкретных характеристик (например, температуры, концентрации, времени и т.п.) согласно изобретению, то настоящее изобретение относится и прямо включает в себя в данный документ все до единого члены и комбинации субграниц или подгрупп в нем вообще. Следовательно, любой определенный предел или группа должны пониматься как короткий вариант упоминания всех до единого членов в границах или группе отдельно, а также всех до единого возможных субграниц или подгрупп, охваченных данным документом; и аналогично в отношении любых субграниц или подгрупп данного описания. Следовательно, например,

- в отношении длины протяженностью в 19 аминокислот или меньше ее следует понимать как определенно включающую в данный документ все до единого отдельные длины, например, длины в 18, 17, 15, 10, 5 и т.д.; таким образом, если не упомянуто особо, любой предел, упомянутый в данном документе, следует понимать как охватывающий. Например, выражение «протяженностью от 5 до 19 аминокислот» должно обозначать «включающее 5 и 19»;

- и так же в отношении др. параметров, таких как последовательности, длина, концентрации, элементы и т.п.

В частности, из данного документа понятно, что последовательности, области, части, определяемые в данном документе, включают в себя все до единой отдельные последовательности, области, части, описанные таким образом, а также все возможные субпоследовательности, субобласти, субчасти, если таковые субпоследовательности, субобласти, субчасти определены как положительно включающие конкретные возможности, как исключающие конкретные возможности или их сочетания; например, исключающее определение для области может читаться как следующее: «при условии, что указанный полипептид будет не короче чем 4, 5, 6, 7, 8 или 9 аминокислот». Еще один дополнительный пример негативного ограничения: «последовательность, содержащая SEQ ID NO.: X, за исключением полипептида из SEQ ID NO.: Y»; и т.д. Другими примерами иллюстративных отрицательных ограничений являются следующие «за исключением рака мозга», или «за исключением ткани мозга», или «за исключением клеток мозга».

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На чертежах, которые иллюстрируют примеры осуществления изобретения,

На фиг. 1 представлены аминокислотные последовательности пептидов, производных апротинина;

На фиг. 2 схематически представлен выкачивающий насос, Р-гликопротеин (P-gp или MDR1) на клеточной поверхности. Выкачивающий насос, P-gp или MDR1, связанный с множественной лекарственной резистентностью, интенсивно экспрессируется на поверхности раковых клеток и различных тканей, включая гематоэнцефалический барьер;

На фиг. 3 схематически представлен процесс конъюгирования лекарственного средства с пептидом-носителем согласно изобретению;

На фиг. 4 представлена хроматограмма, иллюстрирующая получение большого количества конъюгата TxlAn2 (3:1);

На фиг. 5 представлен ВЭЖХ-анализ пика, очищенного на гидрофобной колонке с использованием хроматографа АКТА-explorer;

На фиг. 6 представлена диаграмма, иллюстрирующая перфузию мозга In situ радиоактивно меченным Ангиопепом-2 и сосудистым маркером инулином;

На фиг. 7 представлена гистограмма, иллюстрирующая наблюдаемое распределение объема трансферрина, апротинина и Ангиопепов в целом мозге, капиллярах мозга и паренхиме мозга;

На фиг. 8 представлена диаграмма клеточной пролиферации в присутствии исходного лекарственного средства Таксола. Клетки глиобластомы (U-87) были экспонированы с различными концентрациями Таксола в течение 3 дней. Количество ³Н-тимидина, включенного в клетки, показано на графике как функция от концентрации Таксола;

На фиг. 9А представлена диаграмма накопления различных лекарственных средств в клетках MDCK, трансфицированных MDR1, в присутствии или отсутствии 10 мкМ CsA, ингибитора P-gp. Эксперимент был проведен в присутствии 1% ДМСО;

На фиг. 9В представлена диаграмма накопления конъюгата в клетках, сверхэкспрессирующих P-gp.

На фиг. 10А и 10В представлены диаграммы распределения в тканях Таксола и конъюгата TxlAn1,

На фиг. 11 представлена диаграмма распределения в легких Таксола и TxlAn1,

На фиг. 12 представлена диаграмма уровня конъюгата TxlAn1 в плазме и легких,

На фиг. 13 представлена диаграмма эффекта лечения с помощью TxlAn2 на рост подкожных опухолей глиобластом (U-87),

На фиг. 14 представлены фотографии, иллюстрирующие детекцию β-тубулина в NCI-H460 с помощью иммунофлуоресценции или видимого света в раковых клетках, обработанных Таксолом или конъюгатом TxlAn2, в качестве контроля клетки обрабатывали 1% ДМСО;

На фиг. 15 представлены диаграммы, иллюстрирующие эффект Таксола и конъюгата TxlAn2 на клеточный цикл NCI-H460, измеренный с помощью проточной цитофлуориметрии. Клетки обрабатывались в течение 24 часов носителем (ДМСО), Таксолом (100 нМ) или конъюгатом TxlAn2 (30 нМ является эквивалентом 100 нМ Таксола);

На фиг. 16А и 16В представлены снимки, представляющие иммунодетекцию LRP в пробах биопсии опухоли мозга человека;

На фиг. 17А представлена гистограмма, иллюстрирующая накопление [¹²⁵I]-RAP в фибробластах MEF-1 и РЕА-13 в присутствии различных концентраций апротинина.

На фиг. 17В представлена диаграмма, отражающая результаты фиг. 17А, где зависимое от LRP накопление [¹²⁵I]-RAP вычисляли посредством вычитания результатов поглощенной радиоактивности, полученных с РЕА-13, из результатов с MEF-1, и выражали в виде функции от концентрации апротинина;

На фиг. 18 представлена гистограмма, иллюстрирующая эффект апротинина и Ангиопепа-2 на поглощение RAP. Накопление [¹²⁵I]-RAP в фибробластах MEF-1 и РЕА-13 измеряли в присутствии 25 мкМ апротинина и Ангиопепа. Зависимое от LRP накопление [¹²⁵I]-RAP вычисляли путем вычитания результатов поглощенной радиоактивности, полученных с РЕА-13, из результатов с MEF-1;

На фиг. 19А представлена диаграмма, иллюстрирующая кинетику в крови конъюгата TxlAn2 (3:1) в 80% ДМСО после инъекции болюса;

На фиг. 19В представлена диаграмма, иллюстрирующая кинетику в крови конъюгата TxlAn2 (3:1) в 20% Solutol®HS15 после инъекции болюса;

На фиг. 19С представлена диаграмма, иллюстрирующая кинетику в крови Таксола в 80% ДМСО после инъекции болюса;

На фиг. 20 представлены диаграммы, иллюстрирующие распределение в тканях конъюгата TxlAn2 (3:1), разведенного в ДМСО (80%) или Solutol®HS15 (20%);

На фиг. 21А представлена гистограмма, иллюстрирующая распределение в тканях Таксола, TxlAn2 (3:1) и TxlAn2 (2:1) после внутривенной (в/в) инъекции в нескольких тканях;

На фиг. 21В представлена гистограмма, иллюстрирующая распределение в тканях Таксола, TxlAn2 (3:1) и TxlAn2 (2:1) после внутривенной (в/в) инъекции в нормальном и опухолевом мозге;

На фиг. 22А представлен график, иллюстрирующий объем опухоли после в/в введения Таксола (10 мг/кг) или рецептурного состава (в Solutol®) конъюгата TxlAn2 (3:1) (20 мг/кг) мышам с клетками NCI-H460, имплантированными в их правый бок;

На фиг. 22В представлен график, иллюстрирующий объем опухоли после в/в введения рецептур (в Solutol®) конъюгатов TxlAn2 (2:1) и TxlAn2 (3:1) мышам с клетками NCI-H460, имплантированными в их правый бок;

На фиг. 23А представлен график, иллюстрирующий объем опухоли после введения либо носителя (контроль), Таксола (10 мг/кг) или комбинации TxlAn2 (3:1) (20 мг/кг) посредством внутрибрюшинных инъекций или инфузии с помощью насосов Alzet pumps (30 мг/кг/14 дней) мышам с клетками NCI-H460, имплантированными в их правый бок;

Обработки показаны стрелками и;

На фиг. 23В представлен график, иллюстрирующий объем опухоли после введения либо носителя (контроль), Таксола (10 мг/кг), либо рецептуры TxlAn2 (3:1) (20 мг/кг) посредством внутрибрюшинных инъекций или инфузии с помощью насосов Alzet pumps (30 мг/кг/14 дней) мышам с клетками U-87, имплантированными в их правый бок; Обработки указаны стрелками.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ангиопеп-1 и -2 представляют собой два неограничивающих примера вариантов пептидов, производных апротинина, которые были испытаны (фиг. 1). Таксол, который представляет собой неограничивающий пример варианта молекулы или соединения, конъюгированного с носителем согласно изобретению, был выбран в качестве противоракового лекарственного средства-кандидата, так как это природное соединение, выделенное из коры и хвои тиса, является высокоэффективным химиотерапевтическим средством. Более того, это соединение было одобрено Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными средствами (FDA) для лечения рака яичников, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легких и саркомы Капоши и является хорошо охарактеризованным противораковым агентом.

ПРИМЕРЫ

Анализ пролиферации клеток

Для анализа пролиферации клеток in vitro высевали от 2,5 до 5×10⁴ клеток U-87 и А549 в 24-луночные микропланшеты для культивирования клеток в конечном объеме 1 мл среды с 10% сывороткой и инкубировали в течение 24 часов при 37°С и в 5% СО₂. Затем среду заменяли средой без сыворотки и инкубировали в течение ночи. На следующий день готовили свежий раствор лекарственного средства в диметилсульфоксиде (ДМСО) и среду заменяли полной средой, содержащей лекарственное средство в различных концентрациях, в трех повторах. Конечная концентрация ДМСО составляла 0,1%. Используемым контролем являлись лунки микропланшетов с клетками, но без лекарственного средства. Клетки инкубировали от 48 до 72 часов при 37°С и в 5% СО₂. После инкубации среду заменяли на 1 мл полной среды, содержащей [³Н]-тимидин (1 мкКи/на лунку). Плашку затем инкубировали 4 часа при 37°С и в 5% СО₂. Среду удаляли и клетки промывали PBS, нагретым до при 37°С. Клетки фиксировали смесью этанол:уксусная кислота (3:1), затем промывали водой и осаждали 3 раза 10% ледяной ТХУ (трихлоруксусной кислотой). В конце в лунки добавляли 500 мкл ПХК (перхлорной кислоты) и микропланшеты нагревали в течение 30 мин при 65°С и 30 мин при 75°С. Содержимое каждой лунки затем помещали в сцинтилляционную пробирку с 10 мл сцинтилляционной жидкости и измеряли активность в СРМ (число распадов в минуту) на жидкостном сцинтилляционном счетчике Tri-Carb от компании Packard.

Йодирование пептидов

Пептиды йодировали по стандартным методикам, используя йодные шарики от Sigma. Оба пептида, Ангиопеп-1 и Ангиопеп-2, разводили в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,5 (РВ). Два йодных шарика использовали для каждого белка. Эти шарики промывали дважды 3 мл РВ на фильтре watman и ресуспендировали в 60 мкл РВ. Добавляли ¹²⁵I (1 мкКи) от Amersham-Pharmacia biotech к суспензии шариков на 5 мин при комнатной температуре. Каждую реакцию йодирования инициировали добавлением пептида (100 мкг). После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре удаляли свободный йод с помощью ВЭЖХ.

Подкожная имплантация

Для оценки эффективности конъюгатов Таксола и рецептур на рост опухоли авторы изобретения разработали подкожную модель глиобластомы. В этой модели 2,5×10⁶ клеток в 100 мкл содержащей 1% метилцеллюлозы клеточной среды без сыворотки вводили подкожно в бок мышам. Опухоль была ясно видна, и ее можно было измерить с использованием штангенциркуля с нониусом. Примерный размер опухоли затем откладывали на графике как функцию от времени.

Перфузия мозга мыши in situ

Поглощение [¹²⁵I]-пептидов просветной стороной капилляров мышиного мозга измеряли, используя метод перфузии мозга in situ, адаптированный в лаборатории авторов изобретения для исследования поглощения лекарственных средств в мозге мыши. Кратко, обнажали правую общую сонную артерию мышей, анестезированных кетамином/ксилазином (140/8/мг/кг внутрибрюшинно), и накладывали лигатуру на уровне бифуркации общей сонной артерии, рострально к затылочной артерии. Общую сонную артерию затем катетеризировали рострально полиэтиленовыми шлангами, заполненными гепарином (25 ед/мл) и соединенными с иглой 26 размера. Шприц, содержащий перфузионную жидкость ([¹²⁵I]-пептиды или [¹⁴С]-инулин в буфере Кребса/бикарбонатном буфере при рН 7,4, насыщенном 95% О₂ и 5% СО₂), помещали в инфузионный насос (Harvard pump PHD 2000; Harvard Apparatus) и соединяли с катетером. До перфузии удаляли контралатеральное участие кровяного потока посредством отделения желудочков сердца. Мозг перфузировали в течение указанного времени при скорости потока 1,15 мл/мин. После 14,5 мин перфузии мозг далее перфузировали в течение 60 сек буфером Кребса для отмывки избытка [¹²⁵I]-белков. Мышей обезглавливали для остановки перфузии, и правую полусферу отделяли на льду перед проведением капиллярного истощения. Аликвоты гомогенатов, супернатантов, осадков и перфузатов брали для измерения содержания в них [¹²⁵I]-конъюгатов посредством осаждения ТХУ и для количественной оценки наблюдаемого распределения.

ПРИМЕР 1

Получение конъюгатов

Поскольку резистентность к различным лекарственным средствам, таким как винкристин, этопозид и доксорубицин, опосредована сверхэкспрессией P-gp (MDR1) (фиг. 2), любые способы, позволяющие обойти этот выталкивающий насос, могут усилить действие этих лекарственных средств на различные виды рака. Обход P-gp может поэтому быть полезен для усиления действия лекарственных средств, которые связаны с резистентностью, опосредованной P-gp. Носители, описанные в настоящей заявке, были поэтому протестированы на их способность обходить P-gp.

Конъюгирование лекарственного средства с носителем, описанным в настоящей заявке, проиллюстрировано на фиг. 3. Кратко, для конъюгирования Таксола с носителями Ангиопепом-1 или Ангиопепом-2 сначала активировали Таксол, получая производное N-сукцинимида (2'-NHS-Txl). Затем амины, найденные, например, в остатке лизина или аминоконце Ангиопепа-1 или Ангиопепа-2, вступали в реакцию с активированным таким образом Таксолом, образуя пептидную связь (амидную связь). В Ангиопепе-1 или Ангиопепе-2 аминоконец (в положении 1) и лизины (в положении 10 и 15) способны вступать в реакцию с активированным Таксолом. Таким образом, было найдено, что получаются различные комбинации конъюгатов при добавлении 1, 2 или 3 молекул Таксола в зависимости от использованного молярного соотношения (фиг. 3). Всю реакцию конъюгирования анализировали с помощью ВЭЖХ и появление конъюгата подтверждали масс-спектрометрическим анализом (Maldi-Tof). Было обнаружено, что Таксол высвобождается из носителя посредством расщепления эфирной связи эстеразами. Таким образом, эффективно получали конъюгаты посредством соединения носителя с противораковым лекарственным средством.

В примере осуществления согласно изобретению получение конъюгата TxlAn2 (3:1) проводили путем прямого добавления 1 моль-эквивалента Ангиопепа-2 к раствору 2,5 моль-эквивалентов 2'-NHS-Таксола. Реакцию проводили в 68% ДМСО в растворе Рингера (рН 7,3) в течение 1 часа при 12°С и после удаления холодной бани в течение примерно 22 часов при комнатной температуре (фиг. 4). Ангиопеп-2, 2'-NHS-Таксол и конъюгат TxlAn2 (3:1) показаны на хроматограмме стрелками. Из аликвот реакции были приготовлены образцы и проанализированы с помощью ВЭЖХ после 25 мин, 2 ч 15 мин, 5 ч и 23 ч, как показано на фиг. 4. Пики Ангиопепа-2, 2'-NHS-Таксола и конъюгата TxlAn2 (3:1) показаны на хроматограмме стрелками. Результаты, приведенные на фиг. 4, иллюстрируют исчезновение Ангиопепа-2 и 2'-NHS-Таксола в ходе реакции в основном в пользу появления конъюгата TxlAn2 (3:1).

Эту смесь продуктов реакции разделяли путем гидрофобной хроматографии на колонке RPC 300 мм при скорости потока 4 мл/мин, используя хроматограф АКТА-explorer (фиг. 5). Для пика, соответствующего конъюгату TxlAn2 (3:1), собирали фракции, анализировали их с помощью ВЭЖХ и МС. На фиг. 5 верхняя хроматограмма соответствует идущей реакции во временной точке t=23 ч, в то время как нижняя соответствует конъюгату TxlAn2 (3:1), подтвержденному масс-спектрометрически (MW 5107) после ВЭЖХ-очистки на хроматографе АКТА.

ПРИМЕР 2

Перфузия мозга in situ конъюгатами Таксола и Ангиопепа-2

Чтобы оценить поглощение мозгом Ангиопепа in vivo измеряли начальную скорость переноса [¹²⁵I]-Ангиопепа в паренхиму мозга мыши с использованием перфузии мозга in situ, описанной в настоящей заявке. Мозг мышей перфузировали в течение указанных отрезков времени либо [¹²⁵I]-Ангиопепом-2, либо [¹⁴С]-инулином. После перфузии мозг далее перфузировали в течение 60 сек раствором Рингера для отмывки избытка радиоактивно меченных молекул и затем правое полушарие отделяли на льду перед проведением капиллярного истощения. Аликвоты гомогенатов, супернатантов, осадков и перфузатов брали для измерения содержания в них [¹²⁵I]-Ангиопепа-2 или [¹⁴С]-инулина. Результаты, полученные для накопления этих молекул в паренхиме мозга, проиллюстрированы на фиг. 6. Накопление [¹²⁵I]-Ангиопепа-2 увеличивалось как функция от времени и было выше, чем у сосудистого маркера, [¹⁴С]-инулина.

Авторы изобретения далее сравнили начальное поглощение мозгом после 5 мин перфузии, [¹²⁵I]-апротинина, [¹²⁵I]-трансферрина и [¹²⁵I]-Ангиопепов (фиг. 7) (1:1). Результаты показывают, что Ангиопеп и апротинин имеют наиболее высокую начальную скорость переноса по сравнению с трансферрином.

ПРИМЕР 3

Влияние конъюгатов на рост клеток

Здесь методом анализа in vitro было показано, что Таксол (неконъюгированный) блокирует пролиферацию клеток глиобластомы (U-87) со значением IC₅₀ примерно в 10 нМ (фиг. 8). Затем влияние Таксола, конъюгированного с носителем, описанным в настоящей заявке, на пролиферацию различных клеточных линий оценивали и сравнивали с эффектом неконъюгированного Таксола (упоминаемого как Таксол). Как показано в таблице 3, значения IC₅₀, полученные для конъюгата Таксола-Ангиопепа-2 (TxlAn2), были очень похожи на эффекты неконъюгированного Таксола во многих раковых клетках. Эндотелиальные клетки из мозга крысы (RBE4) были менее чувствительны, чем протестированные раковые клеточные линии. В общем эти результаты показали, что способность конъюгатов блокировать пролиферацию in vitro сходна с таковой неконъюгированного Таксола. Для сравнения полученные результаты представлены в единицах концентрации Таксола.

Таблица 3 Эффект конъюгата на пролиферацию клеток
Клеточные линии	IC50(нМ)
	Таксол	Таксол-Ангиопеп-2 (3:1)
Глиобластомы
U-87	9,5	9,7
U-118	7,2	8,1
Легочная карцинома
NCI-H460	9,3	12,5
А549	3,6	6,0
Calu-3	17,2	25,0
Эндотелиальные клетки
RBE4	137	139

Большинство из этих клеток (U-87, U-118, NCI-H460, A549) экспрессирует LRP. Однако эти данные отсутствуют для клеток RBE4.

ПРИМЕР 4

Обход P-gp с помощью конъюгатов

Чтобы определить, являются ли конъюгаты согласно изобретению, субстратами P-gp или нет, стабильно трансфицировали клетки MDCK MDR1 человека (MDCK-MDR1) и далее инкубировали с неконъюгированным противораковым лекарственным средством или с конъюгатами согласно изобретению. В первом эксперименте клетки MDCK-MDR1 инкубировали с ³Н-винбластином (³Н-VBL), родамином, ³Н-Таксолом, ¹²⁵I-Таксолом-Ангиопепом-1 (¹²⁵I-TxlAn1), ¹²⁵I-Таксолом-Ангиопепом-2 (¹²⁵I-TxlAn2) в течение 1 часа при 37°С в присутствии и в отсутствие 10 мкМ циклоспорина А (CsA), конкурентного ингибитора P-gp (фиг. 9А). После инкубации клетки промывали и оценивали количественно накопление радиоактивности внутри клеток или накопление внутриклеточной флуоресценции. Увеличенное накопление этих лекарственных средств выражено в разах увеличения по сравнению с соответствующим им контролем, измеренным в отсутствие CsA. Следовательно, контрольное значение для каждого лекарственного средства установлено как 1.

В другом эксперименте наблюдали способность конъюгатов накапливаться в клетках, сверхэкспрессирующих P-gp (Фиг. 9В). Клетки MDCK-MDR1 инкубировали с 50 нМ или ³Н-Таксолом, ¹²⁵I-Таксолом-Ангиопепом-1 (¹²⁵I-TxlAn1) или ¹²⁵I-Таксолом-Ангиопепом-2 (¹²⁵I-TxlAn2) в течение 2 часов при 37°С. После инкубации клетки промывали и измеряли количество радиоактивности, накопленной в клетке. Результаты были представлены как накопление лекарственного средства в пмоль/120 мин.

Как показано на фиг. 9А, накопление [³Н]-Таксола увеличивалось в 15 раз в присутствии конкурентного ингибитора P-gp, циклоспорина А (CsA). Накопление родамина и [³Н]-винбластина также увеличивалось в 7,5 раз и 10 раз, соответственно, в присутствии CsA. Эти результаты показывают, что Таксол, родамин и винбластин являются субстратами P-gp. Однако отсутствие эффекта CsA в отношении накопления конъюгатов как [¹²⁵I]-Таксола-Ангиопепа-1, так и [¹²⁵I]-Таксола-Ангиопепа-2 указывает, что они не являются субстратами P-gp. Накопление обоих конъюгатов в отсутствие CsA было, по меньшей мере, в 11 раз выше, чем [³Н]-Таксола (фиг. 9В). Эти последние результаты убедительно подтверждают, что оба конъюгата обходят действие P-gp, так как P-gp не способен выталкивать их из клеток. Эти результаты дополнительно показывают, что присутствие носителя, связанного с противораковым лекарственным средством, усиливает действие лекарственного средства. Поэтому носители, описанные в настоящей заявке, являются пригодными для переноса и/или накопления лекарственных средств внутри клетки и особенно полезны для лекарственных средств, которые обычно выталкиваются P-gp (т.е. лекарственных средств, являющихся субстратами P-gp).

ПРИМЕР 5

Распределение и фармакокинетика конъюгатов

Влияние присоединения лекарственного средства к носителю на распределение лекарственного средства оценивали с помощью введения мышам либо ³Н-Таксола (5 мг/кг), либо ¹²⁵I-Таксола-Ангиопепа-1 (¹²⁵I-TxlAn1) (10 мг/кг, эквивалентное 5 мг Таксола/кг). Неконъюгированное противораковое лекарственное средство и конъюгат вводили путем внутривенной инъекции (в/в) мышам в виде болюса. Забор тканей осуществляли в различных временных точках (0,25, 0,5, 1 и 4 часов) и гомогенизировали. Для количественной оценки количества ³Н-Таксола гомогенаты тканей расщепляли тканевым солюбилизатором (растворимым) и затем добавляли 10 мл сцинтилляционной жидкости к образцам. Количество меченного ¹²⁵I конъюгата в различных образцах измеряли после осаждения ТХУ. Затем количественно измеряли радиоактивность, связанную с тканями. Площадь под кривой (AUC_0-4) приблизительно оценивали с использованием программного обеспечения Prism и наносили на график для различных тканей (фиг. 10). Результаты фиг. 10 указывают на то, что значения AUC_0-4, полученные для конъюгата, выше значений, полученных для Таксола в различных тканях, включая мозг, почки, печень и глаз, что указывает на более высокий уровень накопления конъюгата в этих тканях по сравнению с неконъюгированным лекарственным средством. Более конкретно результаты, представленные на фиг. 10В, указывают на то, что накопление конъюгата в легких значительно выше накопления неконъюгированного лекарственного средства.

Результаты аналогичных экспериментов, проведенных с конъюгатом Таксола-ангиопепа-2, суммированы в таблице 4, приведенной ниже. Хотя существует разница с результатами, полученными для конъюгата TxlAn-1, конъюгат из таблицы 4 также накапливается в легких, мозге и печени более эффективно, чем неконъюгированный Таксол.

Таблица 4
AUC 9-4 (мкг/г ткани)
Ткань	TxlAn-2	Таксол	Соотношение (TxlAn-2/Таксол)
Плазма	170	2,2	77,3
Мозг	0,32	0,07	4,6
Легкое	3,4	1,1	3,0
Почка	11,2	8,0	1,4
Сердце	5,0	2,5	2,0
Печень	513	22	23
Глаз	0,99	0,57	1,7
Моча	35,7	88	0,4

Воздействие, эквивалентное 5 мг/кг Таксола

Кинетика накопления Таксола и Таксола-Ангиопепа-1 в легком также представлена на фиг. 11. Результаты ясно показывают, что количество конъюгата, измеренного в легких в разных временных точках, гораздо выше, чем количество неконъюгированного лекарственного средства. Более того, авторы изобретения также наблюдали, что накопления конъюгата в легком было также значительно выше, чем его же концентрация в сыворотке (плазме) в различных временных точках (фиг. 12). Результаты, представленные на фиг. 10, 11 и 12, четко указывают на то, что конъюгирование противоракового лекарственного средства (например, Таксола) с носителем согласно изобретению (например, Ангиопепом-1 или 2) модифицирует биологическое распределение противоракового лекарственного средства и его фармакокинетику.

ПРИМЕР 6

Ингибирование роста опухоли (U-87) in vivo

Способность конъюгата ингибировать рост опухоли затем оценивали на модели in vivo (фиг. 13). Для этого клетки U-87 имплантировали под кожу правого бока мышей и на третий день после имплантации мышам вводили носитель (ДМСО/раствор Рингера: 80/20; контроль), Таксол (5 мг/кг) или Таксол-Ангиопеп-2 (10 мг/кг; эквивалент 5 мг Таксола/кг (3 молекулы Таксола: на 1 молекулу Ангиопепа-2)). Авторы изобретения наблюдали, что ингибирование роста опухоли было более явно выражено у мышей, которым вводили конъюгат, чем у мышей, которым вводили неконъюгированное противораковое лекарственное средство.

В действительности на 17 день после имплантации рост опухоли ингибировался более чем на 75% конъюгатом, тогда как рост опухоли ингибировался только на 34% при использовании неконъюгированного лекарственного средства (таблица 5). Эти результаты показывают, что конъюгаты, описанные в настоящей заявке, более эффективны, чем неконъюгированный Таксол, в ингибировании роста опухоли in vivo. В общем измеренный в случае конъюгата уровень ингибирования роста опухоли был 2,2-раза выше, чем в случае неконъюгированного лекарственного средства.

Таблица 5 Ингибирование роста опухоли конъюгатами
Группы	Объем опухоли (мм 3 ) (среднее ± СОС)	Рост опухоли	Ингибирование (%)	О/К (%)
	Дни после инъекции	Δ (мм3)
	День 0*	День 14**
Контроль	79 ± 7	289 ± 50	203 ± 47		100
Таксол (5 мг/кг)	74 ± 5	219 ± 52	134 ± 55	34	66
TxlAn2 (3:1) (10 мг/кг)	88 ± 9	144 ± 27	56 ± 32	73	27
Воздействие эквивалентно 5 мг/кг Таксола *соответствует 3 дням после имплантации (первое введение) ** соответствует 17 дням после имплантации (после 4 введений)

ПРИМЕР 7

Механизм действия конъюгатов

На фиг. 14 клетки рака легкого (NCI-H460) инкубировали в течение 24 часов либо со свободным Таксолом (30 нМ), либо конъюгатом TxlAn2 (10 нМ; эквивалентно 30 нМ Таксола). Затем β-тубулин в клетках метили с помощью вторичных антител, связанных с FITC. Фотографии были сделаны в видимом и флуоресцентном свете. Эти результаты указывают, что и Таксол и конъюгат Таксола-Ангиопепа имеют сходные эффекты в отношении β-тубулина, приводящие к его полимеризации. Более того, как указано на фиг. 15, добавление Таксола или конъюгата Таксола-Ангиопепа индуцирует остановку клеток NCI-H460 в фазе G2/М. Результаты, полученные по полимеризации β-тубулина и клеточному циклу, позволяют предположить, что механизм действия конъюгата TxlAn на раковые клетки сходен с механизмом действия Таксола.

ПРИМЕР 8

Эффект на LRP-опосредованное накопление RAP

Ранее в международной патентной заявке № РСТ/СА2004/00011 было показано, что связанный с рецептором белок (RAP) ингибирует трансцитоз апротинина в модели in vitro гематоэнцефалического барьера. Согласно этим данным авторы настоящего изобретения предположили, что белок, родственный рецептору липопротеина низкой плотности (LRP), участвуют в проникновении апротинина в мозг. Было также получено аналогичное ингибирование транспорта Ангиопепа в модели in vitro гематоэнцефалического барьера (данные не показаны), что позволяет предположить, что в трансцитоз Ангиопепа через эндотелиальные клетки мозга также вовлечен LRP. LRP является гетеродимерным мембранным рецептором в 600 кД, состоящим из двух субъединиц: α-субъединицы (515 кД) и β-субъединицы (85 кД). Затем была проведена иммунодетекция LRP, чтобы оценить, экспрессируется ли рецептор в первичных опухолях мозга человека, таких как глиобластомы, и в метастазах в мозге человека из рака молочной железы, легкого и меланомы (фиг. 16). Кратко, равные количества белковых гомогенатов из первичных опухолей мозга человека (глиобластом) или метастазов в мозге человека разделяли методом гель-электрофореза. После электрофореза белки переносили на мембрану PVDF и проводили иммунодетекцию LRP с использованием моноклонального антитела против α-субъединицы, от Cedarlane Laboratories (Hornby, ON, Canada). LRP визуализировали посредством вторичного антитела против мышиных IgG, связанного с пероксидазой хрена, и хемилюминесцентных реагентов.

При использованных экспериментальных условиях α-субъединицу LRP обнаруживали путем иммунодетекции на уровне 515 кД в клетках глиобластомы U-87. LRP также детектировали во всех первичных опухолях мозга человека и метастазах в мозге человека (фиг. 16). В отличие от этого мегалин (LRP2) обнаружили только в легочных метастазах в мозг (не показано). Экспрессия LRP в пробах биопсии у различных пациентов может частично объяснить, почему авторы изобретения ранее наблюдали высокое накопление конъюгата Таксола-Апротинина в опухолях мозга. В общем, поскольку LRP может быть вовлечен в транспорт носителя, описанного в данной заявке, эти результаты указывают, что конъюгаты могут также проникать в клетки и опухоли, которые экспрессируют указанный рецептор.

Для того чтобы определить, может ли LRP участвовать в трансцитозе апротинина и Ангиопепа, было определено их влияние на поглощение связанного с рецептором белка (RAP), эндогенного лиганда для LRP (фиг. 17А). Поглощение RAP измеряли в фибробластах, экспрессирующих LRP (MEF-1), и в фибробластах, которые не экспрессируют LRP (РЕА-13) (фиг. 17А и 17В). Добавление апротинина ингибировало транспорт [¹²⁵I]-RAP в клетках, положительных по LRP, дозозависимым образом. В противоположность этому данные концентрации апротинина практически не имели никакого эффекта на поглощение RAP в клетках, где отсутствовал LRP. На фиг. 17В разница между поглощением [¹²⁵I]-RAP, измеренная для MEF-1 и РЕА-13, была вычислена и отражена на графике как функция от концентрации апротинина. Эти результаты показывают, что часть LRP-зависимого поглощения RAP может быть снижена с помощью апротинина, указывая на то, что апротинин может взаимодействовать с этим рецептором. В другом эксперименте (фиг. 18) поглощение [¹²⁵I]-RAP также измеряли в присутствии избытка апротинина и Ангиопепа. Результаты показывают, что как апротинин, так и Ангиопеп влияют на LRP-зависимое накопление [¹²⁵I]-RAP.

В общем данные, полученные для конъюгатов, описанных в настоящей заявке, указывают, что конъюгирование противораковых лекарственных средств с носителем позволяет противораковым лекарственным средствам избежать действия P-gp и, таким образом, усилить свое воздействие (когда они конъюгированы с носителем). Эти конъюгаты являются активными in vitro при ингибировании пролиферации раковых клеток. Более того, результаты, полученные по росту опухолей in vivo, указывают, что конъюгирование противоракового лекарственного средства с носителем может увеличивать их эффективность в результате того, что им удается обойти P-gp, в результате возможного взаимодействия с рецептором LRP или посредством модифицирования фармакокинетики или биодоступности неконъюгированного лекарственного средства.

Данные, описанные в настоящей заявке, в совокупности указывают, что конъюгаты могут быть использованы против первичных опухолей, включая рак молочной железы, легкого и кожи, а также метастазов, происходящих из первичных опухолей.

ПРИМЕР 9

Улучшенная композиция конъюгатов Таксол-Ангиопепа

Предварительные анализы по оценке растворимости различных конъюгатов TxlAn показали, что все конъюгаты имели низкую растворимость в водных растворах (например, в растворе Рингера/Hepes) из-за сильно гидрофобной природы Таксола. Однако все конъюгаты очень хорошо растворялись в диметилсульфоксиде (ДМСО)/растворе Рингера (80%/20%). Поэтому оценивались различные стратегии для увеличения их растворимости и для уменьшения количества ДМСО, необходимого для их солюбилизации. Интересно, что авторам изобретения удалось полностью удалить ДМСО из композиции с помощью солюбилизирующего агента Solutol® HS 15 (BASF). Например, TxlAn2 (3:1) в концентрации 5 мг/мл эффективно растворялся в 20% Solutol® HS 15 и в растворе Рингера/Hepes, рН 5,5. Поскольку этот агент был одобрен для применения с несколькими лекарственными средствами для внутривенного (в/в) и внутрибрюшинного (в/б) введения, его использование коммерчески выгодно для рецептур согласно изобретению.

Композиции согласно изобретению могут, следовательно, содержать, например, а) конъюгаты Таксола-Ангиопепа, b) Solutol® HS 15 и с) водный раствор или буфер (например, раствор Рингера/Hepes при рН от 5 до 7). Концентрация Solutol® HS15 в рецептуре может достигать, например, 30%. Концентрации выше 30% также можно использовать. Концентрации конъюгата могут быть определены на основе требуемой дозы для эффективного лечения пациента.

ПРИМЕР 10

Кинетика улучшенных композиций в крови

Для изучения распределения в тканях и кинетики в крови использовали йодированные [¹²⁵I]-конъюгаты (т.е. [¹²⁵I]-конъюгаты TxlAn) и [³Н]-Таксол. Кратко конъюгаты TxlAn2 (1 мг) метили радиоактивным йодом, используя йодные шарики, и затем очищали конъюгат Txl-[¹²⁵I]-An2, используя колонку, содержащую смолу resource RPC. Свободный йод удаляли, тщательно промывая колонку 20% ацетонитрилом. В ходе промывок колонки подсчитывали радиоактивность смывов для оценки снижения концентрации свободного йода. Затем снимали с колонки конъюгат Txl-[¹²⁵I]-An2 100% ацетонитрилом. Затем ацетонитрил выпаривали и йодированный конъюгат растворяли в 100% ДМСО (100 мкл). Аликвоту радиоактивно меченного конъюгата затем наносили на колонку ВЭЖХ и собирали фракции для подтверждения того, что радиоактивность связана с фракциями, соответствующими конъюгатам.

Кинетику лекарственного средства в крови оценивали после внутривенного ((в/в) хвостовая вена), внутрибрюшинного (в/б) и подкожного (к/к) введения, проведенного бодрствующим мышам (фиг. 19). Кратко, конъюгат TxlAn2 (3:1) разводили в ДМСО/раствор Рингера-Hepes (80/20) или в Solutol®/раствор Рингера-Hepes (80/20), Txl-[¹²⁵I]-An2. Затем инъецировали мышей CD-1 композициями из расчета 10 мг/кг. После инъекций брали пробы крови (50 мкл) из кончика хвоста и напрямую измеряли радиоактивность. Используя тот же самый протокол, также определяли кинетику Таксола с использованием [³Н]-Таксола. Таксол растворяли в ДМСО/раствор Рингера-Hepes (80/20) в концентрации, позволяющей инъекцию 5 мг/кг, и затем добавляли [³Н]-Таксол (2,5 мкКи на инъекцию). После инъекций брали пробы крови из кончика хвоста, добавляли сцинтилляционную жидкость и измеряли радиоактивность на приборе Packard counter. Результаты этого эксперимента показаны на фиг. 19А, 19В и 19С и суммированы в таблице 6, приведенной ниже.

В общем, результаты фиг. 19 и таблицы 6 показывают, что биодоступность TxlAn2 гораздо выше, чем биодоступность Таксола. Например, AUC_(0-24ч)TxlAn2/AUC_(0-24ч)Таксола равна 169 (т.е. 203,3/1,2).

В единицах Таксола значение AUC_(0-24ч)TxlAn2/AUC_(0-24ч)Таксола составляет 84,7 (т.е. 101,65/1,2). Поскольку на одну молекулу Ангиопепа приходится три молекулы Таксола, количество Таксола составляет примерно 0,5 от молекулярного веса Ангиопепа (т.е. 3×854/5301). Таким образом значение AUC конъюгата (например, 203) нужно умножить на 0,5, чтобы выразить его в единицах Таксола.

В дополнение биодоступность конъюгатов TxlAn2 является одинаковой после внутривенной и внутрибрюшинной инъекций, хотя это не так в случае Таксола. Наконец, результаты фиг. 19 и таблицы 6 указывают, что биодоступность TxlAn2 в крови выше при использовании Solutol® в качестве солюбилизатора, чем при использовании ДМСО.

Таблица 6 Площади под кривыми от 0 до 24 часов вычисляли с помощью программного обеспечения GraphPad
AUC (0-24ч) (мкг.ч на мл)	Внутривенная инъекция	Внутрибрюшинная инъекция	Подкожная инъекция
TxlAn2 (3:1) (ДМСО) (10 мг/кг)	98,1	34,7	15,5
TxlAn2 (3:1) (Solutol®) (10 мг/кг)	203,3	211,3	74,5
Таксол (3:1) (ДМСО) (10 мг/кг)	1,2	0,09	0,14

ПРИМЕР 11

Распределение в тканях

Распределение в тканях TxlAn2 оценивали у нормальных мышей CD-1 после внутривенной инъекции в хвост 10 мг/кг TxlAn2, солюбилизированного в Solutol®/растворе Рингера-Hepes (80%/20%) или в ДМСО/растворе Рингера-Hepes (80/20). Кратко мышам CD-1 вводили через хвостовую вену композицию TxlAn2, солюбилизированного в Solutol® или в ДМСО, и также содержащую Txl-[¹²⁵I]-An2. В определенных временных точках собирали образцы крови и перфузировали анестезированных мышей холодным PBS. Затем вырезали ткани и измеряли радиоактивность на гамма-счетчике.

Результаты фиг. 20 показывают, что использование Solutol® позволяет достичь более высокого распределения конъюгата TxlAn2 (3:1) в большинстве тканей.

ПРИМЕР 12

Распределение в опухолях мозга

При попытке оценить распределение конъюгата TxlAn2 (3:1) в модели опухоли мозга, голым мышам имплантировали в мозг клетки рака легких NCI-H460. Через десять дней после имплантации потеря веса мышей была значительной, указывая на то, что опухоли хорошо прижились в мозге. Распределение в ткани Таксола, TxlAn2 (3:1) и TxlAn2 (2:1) оценивали (фиг. 21), как было ранее описано.

Мыши получали внутривенную инъекцию или Таксола (5 мг/кг), солюбилизированного в ДМСО, или TxlAn2 (3:1) (10 мг/кг), или TxlAn2 (2:1) (12,5 мг/кг), каждый из которых был солюбилизирован в Solutol®. После 10 минут мышей перфузировали на льду, используя ледяной PBS, собирали органы и измеряли радиоактивность. Для оценки разницы накопления между нормальным мозгом и опухолью мозга мозг разрезали пополам таким образом, что правое полушарие (место инъекции опухолевых клеток) соответствовало опухолевому мозгу, и левое полушарие соответствовало нормальному мозгу.

Результаты фиг. 21А и 21В показывают более высокое распределение конъюгатов TxlAn2 (3:1) в опухоли мозга по сравнению с нормальным мозгом (2-кратное увеличение), в то время как никакой разницы в распределении Таксола между нормальным и опухолевым мозгом не наблюдалось. Распределение конъюгата TxlAn2 (3:1) было гораздо более высоким, чем распределение Таксола в опухоли мозга (10-кратное увеличение) и также было выше, чем распределение TxlAn2 (2:1) (4,5-кратная разница).

ПРИМЕР 13

Эффект улучшенных композиций конъюгатов Таксола-Ангиопепа на рост подкожных опухолей

Были проведены исследования in vivo для определения того, может ли улучшенная композиция, содержащая конъюгат Таксол-Ангиопепа, ингибировать рост клеток рака легких (NCI-H460) или клеток глиобластомы (U87) в модели in vivo на мышах, которым были имплантированы под кожу эти раковые клетки.

Кратко, мышам подкожно инъецировали 2,5×10⁶ клеток глиомы человека U87 или клеток NCI-H460. При наличии роста опухоли мыши получали лечение свободным Таксолом, конъюгатами Таксол-Ангиопепа или носителем посредством внутривенных или внутрибрюшинных инъекций. Инъекции производили дважды в неделю вплоть до забоя мышей. Мышей осматривали ежедневно на предмет клинических симптомов и потери веса. Объем опухоли примерно оценивали с помощью штангенциркуля и следующего уравнения (объем опухоли=π/2 × (длина (мм) × ширина² (мм)).

При первом исследовании роста опухолей клетки NCI-H460 имплантировали в правый бок мышей (Фиг. 22А). Мыши получали носитель, Таксол или композицию конъюгата Таксол-Ангиопепа-2 (3:1) с помощью внутривенных инъекций в хвостовую вену или внутрибрюшинных инъекций. Конъюгаты вводили в эквиваленте 10 мг/кг Таксола. Результаты, представленные на фиг. 22, показывают, что улучшенная композиция конъюгата TxlAn2 (3:1), содержащая 20% Solutol® HS15 в растворе Рингера-Hepes (рН 5,5), вызывала гораздо более сильное ингибирование роста опухоли NCI-H460, чем Таксол.

Эти результаты также суммированы в таблице 7, приведенной ниже.

Таблица 7
Молекулы	Объем опухоли (мм 3 )	Рост опухоли	О/К (%)
	Дни после инъекции	Δ (мм3)
	День 0	День 11
Solutol	118 ± 11	714 ± 71	596 ± 62	100
Таксол внутривенно	112 ± 12	483 ± 63	371 ± 58	62
TxlAn2 (3:1) внутривенно	112 ± 18	236 ± 32	124 ± 14	21
TxlAn2 (3:1) внутрибрюшинно	105 ± 14	221 ± 50	116 ± 37	19
TxlAn2 (2:1) внутрибрюшинно	111 ± 18	215 ± 70	104 ± 53	17

Эти результаты показывают, что конъюгаты TxlAn2 являются более сильнодействующими, чем Таксол, в ингибировании роста опухоли в экспериментах in vivo. В дополнение похожие результаты были получены и для внутривенного, и для внутрибрюшинного введения конъюгата. Наконец, похожие результаты были получены также для конъюгатов TxlAn2, содержащих 2 или 3 молекулы Таксола.

ПРИМЕР 14

Эффект улучшенных композиций конъюгатов Таксол-Ангиопепа на рост подкожных опухолей

В дальнейшем исследовании оценивали эффект улучшенных композиций конъюгата TxlAn2 (3:1) на рост подкожных опухолей NCI-Н460 или U87. Мыши получали внутрибрюшинные инъекции улучшенной композиции в концентрации 20 мг/кг/день в течение 5 последовательных дней или же композицию вводили путем инфузии при помощи имплантированного насоса Alzet mini-osmotic pump в дозировке 2 мг/кг/день в течение 14 дней. Как показано на фиг. 23А и 23В, ответ мышей на композицию конъюгата TxlAn2 (3:1) был выше, когда мыши получали улучшенную композицию путем инфузии.

Эти эксперименты in vivo ясно показывают эффективность улучшенной композиции против роста опухолей глиобластомы или клеток рака легких. Аналогичные эксперименты также указывают на эффективность этих улучшенных композиций в увеличении срока выживания животных (данные не приведены).

Содержание каждой публикации, патента и патентной заявки, упоминаемых в настоящей заявке, включено в нее посредством ссылки.

Хотя настоящее изобретение было подробно описано в настоящей заявке и проиллюстрировано в сопроводительных чертежах, понятно, что изобретение не ограничено вариантами осуществления, описанными в настоящей заявке, и что различные изменения и модификации могут быть осуществлены в рамках объема или концепции настоящего изобретения.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая
а) конъюгат или его фармацевтически приемлемую соль, где указанный конъюгат включает:
(i) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичную аминокислотной последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97); и
(ii) по меньшей мере, одну молекулу таксола, ковалентно конъюгированную с указанным полипептидом; и
(b) Solutol® HS-15.

2. Композиция по п.1, где указанный полипептид содержит последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97).

3. Композиция по п.1, где указанный полипептид содержит последовательность Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97).

4. Композиция по п.3, где указанный полипептид состоит из последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97).

5. Композиция по п.1, дополнительно содержащая маннит или буфер.

6. Композиция по п.1, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность длиной менее 50 аминокислот.

7. Композиция по п.1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель.

8. Применение композиции по любому из пп.1-7 для лечения рака.

9. Применение по п.8, где указанный рак представляет собой первичную опухоль мозга или опухоль мозга метастатического происхождения.

10. Применение по п.9, где указанный рак представляет собой метастаз в мозг, глиобластому или глиому.

11. Применение по п.8, где указанный рак находится вне мозга.

12. Применение по п.11, где указанный рак представляет собой опухоль легкого, опухоль молочной железы, опухоль почки, опухоль глаза, опухоль печени, опухоль прямой и ободочной кишки, опухоль органов мочевыделительной системы или метастазирующий рак из опухоли молочной железы, опухоли легкого, меланомы или опухоли мозга.

13. Применение конъюгата для лечения рака, находящегося вне мозга, где указанный конъюгат включает:
(a) полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 80% идентичную аминокислотной последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97); и
(b) белок или противораковое средство, конъюгированные с указанным полипептидом.

14. Применение по п.13, где указанный полипептид имеет аминокислотную последовательность, по меньшей мере, на 90% идентичную аминокислотной последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97).

15. Применение по п.13, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97).

16. Применение по п.14, где указанный полипептид состоит из последовательности Ангиопеп-2 (SEQ ID NO.:97).

17. Применение по п.13, где указанный полипептид имеет длину от примерно 19 до примерно 50 аминокислот.

18. Применение по п.13, где указанным противораковым средством является таксол, производное таксола, винбластин, винкристин, этопозид, доксорубицин, циклофосфамид, таксотер, мелфалан или хлорамбуцил или их фармацевтически приемлемая соль.

19. Применение по п.18, где указанным противораковым средством является таксол, доксорубицин или этопозид или их фармацевтически приемлемая соль.

20. Применение по п.13, где указанный белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.

21. Применение по п.13, где указанный рак представляет собой опухоль легкого, опухоль молочной железы, опухоль почки, опухоль глаза, опухоль печени, опухоль прямой и ободочной кишки, опухоль органов мочевыделительной системы или метастазирующий рак из опухоли молочной железы, опухоли легкого, меланомы или опухоли мозга.

22. Применение по п.13, где указанный рак включает в себя клетку, экспрессирующую Р-гликопротеин.

23. Применение по п.13, где указанный рак обладает множественной лекарственной устойчивостью.