Наполненные действующим веществом наночастицы на основе гидрофильных протеинов

Изобретение относится к области фармакологии и представляет собой наполненные действующим веществом наночастицы на основе гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов для переноса упомянутого действующего вещества через гематоэнцефалический барьер, отличающиеся тем, что гидрофильный протеин или, по меньшей мере, один из гидрофильных протеинов выбирают из группы, включающей сывороточные альбумины, желатин А, желатин В и казеин, а упомянутые наночастицы содержат, по меньшей мере, один функциональный тиолированный протеин, выбранный из тиолированных аполипопротеинов, который посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида связан с гидрофильным протеином или гидрофильными протеинами, при этом малеимидные группы эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида образуют тиоэфирные связи с упомянутым тиолированным аполипопротеином(-ами). Изобретение обеспечивает перенос лекарственных веществ через гематоэнцефалический барьер. 3 н. и 19 з.п. ф-лы, 1 ил.

 

Настоящее изобретение относится к наполненным действующим веществом наночастицам на основе гидрофильного протеина или сочетаниям гидрофильных протеинов, у которых функциональные протеины или пептидные фрагменты связаны с наночастицами посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида. Более точно, изобретение относится к наполненным действующим веществом наночастицам на основе по меньшей мере одного гидрофильного протеина, у которых функциональные протеины или пептидные фрагменты, предпочтительно аполипопротеин, связаны с наночастицами посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида для переноса обладающего лекарственным или биологическим действием вещества через гематоэнцефалический барьер.

Подразумевается что термин "наночастицы" означает имеющие размер от 10 нм до 1000 нм частицы искусственных или природных макромолекулярных веществ, с которыми ковалентной, ионной или адсорбционной связью могут быть связаны лекарственные или другие биологически активные вещества или в которые эти вещества могут быть включены.

С помощью некоторых наночастиц можно осуществлять перенос через упомянутый барьер гидрофильных лекарств, которые сами по себе не способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, в результате чего может активизироваться терапевтическое действие этих гидрофильных лекарств в центральной нервной системе (ЦНС).

Например, с помощью наночастиц полибутилцианоакрилата, покрытых полисорбатом 80 (Tween® 80) или другими поверхностно-активными веществами и обладающих значительным фармакологическим действием на центральную нервную систему, стало возможным осуществлять перенос ряда лекарств через гематоэнцефалический барьер. Примеры лекарств, вводимых с помощью таких наночастиц полибутилцианоакрилата, включают даларгин, гексапептид эндорфина, лоперамид и тубокурарин, два антагониста рецепторов N-метил-D-аспарагиновой кислоты (NMDA) MRZ 2/576 и MRZ 2/596 соответственно производства компании Merz (Франкфурт), а также противоопухолевое действующее вещество доксорубицин.

В основе механизма переноса этих наночастиц через гематоэнцефалический барьер, возможно, лежит адсорбция аполипопротеина Е (АроЕ) наночастицами через покрытие из полисорбата 80. Предположительно, эти частицы тем самым имитируют липопротеиновые частицы, которые распознаются и связываются рецепторами эндотелиальных клеток мозга, что обеспечивает поступление липидов в мозг.

Хотя, как известно, наночастицы полибутилцианоакрилата преодолевают гематоэнцефалический барьер, их недостатком является то, что полисорбат 80 не имеет физиологического происхождения, а перенос наночастиц через гематоэнцефалический барьер возможно объясняется токсическим действием полисорбата 80. Кроме того, недостатком известных наночастиц полибутилцианоакрилата также является то, что связывание АроЕ происходит лишь путем адсорбции. В результате, связанный наночастицами АроЕ присутствует в равновесии со свободным АРоЕ, и после инъекции в тело может происходить быстрая десорбция АроЕ из частиц. Кроме того, поскольку многие лекарства не связываются с наночастицами полибутилцианоакрилата в достаточной степени, они не могут быть перенесены через гематоэнцефалический барьер вместе с системой-носителем.

Для преодоления этих недостатков в WO 02/089776 А1 предложены наночастицы человеческого сывороточного альбумина (наночастицы HSA), с которыми посредством авидин-биотиновой системы или производного авидина связан биотинилированный аполипопротеин Е. После внутривенной инъекции эти наночастицы HSA способны переносить через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) лекарства, связанные адсорбционной или ковалентной связью, а также лекарства, включенные в матрицу частиц. За счет этого действующие вещества, которые в противном случае не способны преодолевать барьер по биохимическим, химическим или физико-химическим причинам, могут быть использованы в фармакологических и лечебных целях в ЦНС.

Тем не менее, авидин-биотиновая система все же имеет различные недостатки. Например, ее сложно применять в том, что касается получения наночастиц, и, кроме того, она может вызывать иммунологические или иные побочные эффекты. Кроме того, системы частиц, включающие авидин-биотиновую систему, имеют тенденцию слипаться при хранении в течение длительного времени, что приводит к увеличению среднего размера частиц и отрицательно сказывается на эффективности частиц.

Таким образом, в основу настоящего изобретения положена задача получения наночастиц, с помощью которых лекарства, которые по биохимическим, химическим или физико-химическим причинам не способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, могут доставляться в ЦНС, при этом эти наночастицы не имеют недостатков известных из уровня техники наночастиц полибутилцианоакрилата и наночастиц HSA, включающих авидин-биотиновую систему.

Данная задача решена с помощью наночастиц на основе гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов, которые содержат по меньшей мере одно фармакологически приемлемое и/или биологически активное вещество и с которыми посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида связан аполипопротеин, служащий функциональным протеином.

Гидрофильный протеин или по меньшей мере один из гидрофильных протеинов, на котором основаны наночастицы согласно изобретению, предпочтительно относится к группе протеинов, включающей сывороточные альбумины, желатин А, желатин В и казеин. Более предпочтительными являются гидрофильные протеины человеческого происхождения. Наиболее предпочтительными являются наночастицы на основе человеческого сывороточного альбумина.

Бифункциональные эфиры полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида содержат малеимидную группу и N-гидроксисукцинимидный эфир, между которыми расположена полиэтиленгликолевая цепочка заданной длины. Предпочтительно функциональный протеин или пептидный фрагмент связан с гидрофильным протеином посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида, которые включают полиэтиленгликолевую цепочку со средней молекулярной массой 3400 дальтон или 5000 дальтон.

Аполипопротеин, связанный с гидрофильным протеином посредством эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида, предпочтительно выбирают из группы, включающей аполипопротеин Е, аполипопротеин В (АроВ) и аполипопротеин A1 (АроА1).

В других предпочтительных вариантах осуществления наночастиц согласно изобретению вместо использования аполипопротеина функциональный протеин выбирают из группы, включающей антитела, ферменты и пептидные гормоны. Тем не менее, посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида можно связать с наночастицами практически любой желаемый пептидный фрагмент, предпочтительно пептидный фрагмент, выбранный из группы функционально активных фрагментов упомянутых функциональных протеинов.

Таким образом, предметом настоящего изобретения являются наполненные действующим веществом наночастицы на основе гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов, отличающиеся тем, что они содержат по меньшей мере один функциональный протеин или пептидный фрагмент, связанный с гидрофильным протеином или гидрофильными протеинами посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида.

Наполнение наночастиц действующим веществом для переноса может быть осуществлено путем адсорбции действующего вещества наночастицами, включения действующего вещества в наночастицы или путем ковалентного связывания или комплексообразования посредством реакционно-способных групп.

В принципе, наночастицы согласно изобретению могут быть наполнены практически любым желаемым действующим веществом/лекарством. Предпочтительно наночастицы наполняют действующими веществами, которые сами по себе не способны преодолеть гематоэнцефалический барьер. Более предпочтительно действующие вещества относятся к группам цитостатиков, антибиотиков, антивирусных веществ и лекарств, обладающих действием против неврологических заболеваний, например, из группы, включающей болеутоляющие вещества, ноотропы, антиэпилептические вещества, седативные средства, психотропные лекарства, гормоны гипофиза, гормоны гипоталамуса, другие регуляторные пептиды и их ингибиторы, при этом данный перечень отнюдь не является исчерпывающим. Наиболее предпочтительно действующее вещество выбирают из группы, включающей даларгин, лоперамид, тубокурарин и доксорубицин.

Преимуществом наночастиц согласно изобретению является отсутствие необходимости использовать авидин-биотиновую систему, которая, возможно, вызывает побочные эффекты, для связывания функциональных протеинов или их пептидных фрагментов с гидрофильным протеином частиц.

Предпочтительно наночастицы согласно изобретению получают путем первоначального преобразования водного раствора гидрофильного протеина или гидрофильных протеинов в наночастицы методом десольватации и последующей стабилизации упомянутых наночастиц сшиванием.

Десольватацию из водного раствора предпочтительно осуществляют путем добавления этанола. В принципе, десольватация может быть также осуществлена путем добавления других смешиваемых с водой осадителей гидрофильных протеинов, таких как ацетон, изопропанол или метанол. Так, десольватацию желатина в качестве исходного протеина успешно осуществляют путем добавления ацетона. Десольватация протеинов в водной фазе также возможна путем добавления структурирующих солей, таких как сульфат магния или сульфат аммония. Этот процесс называют высаливанием.

Применимыми сшивающими агентами для стабилизации наночастиц являются двухфункциональные альдегиды, предпочтительно глутаральдегид, а также формальдегид. Кроме того, матрица наночастиц может быть сшита термическими методами. Стабильные системы наночастиц получают при температуре 60°C в течение более 25 часов или при температуре 70°C в течение более 2 часов.

Функциональные группы, расположенные на поверхности стабилизированных наночастиц (аминогрупп, карбоксильных групп, гидроксильных групп), могут использоваться для прямого ковалентного сопряжения аполипопротеинов. Посредством гетеробифункциональных "спейсеров", вступающих в реакцию как с аминогруппами, так и свободными тиоловыми группами, эти функциональные группы могут быть связаны с аполипопротеином, в который были предварительно включены свободные тиоловые группы.

Для получения наночастиц согласно изобретению аминогруппы на поверхности частиц преобразуют с помощью гетеробифункционального сшивающего агента на основе полиэтиленгликоля, которым является эфир полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида. При этом сукцинимидильные группы эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида вступают в реакцию с аминогруппами на поверхности частиц, высвобождая N-гидроскисукцинимид. Посредством этой реакции можно вводить на поверхность частиц группы полиэтиленгликоля, которые в свою очередь содержат малеимидные группы на другом конце цепочки, способные вступать в реакцию с тиолированным веществом, образуя тем самым простой тиоэфир.

Полиэтиленгликолевая цепочкая эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида для получения наночастиц согласно изобретению предпочтительно имеет среднюю молекулярную массу 3400 дальтон (NHS-PEG3400-Mal). Тем не менее, в принципе также возможно использовать эфиры полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида, содержащие полиэтиленгликолевые цепочки меньшей или большей длины, например, полиэтиленгликолевую цепочку со средней молекулярной массой 5000 дальтон.

Для получения наночастиц согласно изобретению аполипопротеин, функциональный протеин или пептидный фрагмент, который должен быть связан, тиолируют путем преобразования 2-иминотиолана. С этой целью используют свободные аминогруппы протеинов или пептидных фрагментов.

После каждой стадии реакции системы частиц очищают путем повторного центрифугирования и диспергирования в водном растворе. После преобразования соответствующий растворенный протеин обычно отделяют от низкомолекулярных продуктов реакции методом эксклюзионной хроматографии.

Предпочтительный способ получения наполненных действующим веществом наночастиц, основанных на гидрофильном протеине или сочетании гидрофильных протеинов и модифицированных функциональными протеинами или пептидными фрагментами, отличается тем, что включает следующие стадии, на которых:

десольватируют водный раствор гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов,

методом сшивания стабилизируют наночастицы, полученные путем десольватации,

преобразуют аминогруппы на поверхности стабилизованных наночастиц с помощью эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида,

тиолируют функциональные протеины или пептидные фрагменты, и

ковалентно связывают тиолированные протеины или пептидные фрагменты с наночастицами, преобразованными с помощью эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида.

Для опосредования фармакологического действия в частицы могут быть включены фармацевтические или биологические действующие вещества (действующие вещества). В этом случае связывание действующего вещества может осуществляться путем образования ковалентных связей, комплексообразования, а также образования адсорбционных связей.

После ковалентного связывания тиолированного аполипопротеина или тиолированного функционального протеина или пептидного фрагмента модифицированные полиэтиленгликолем наночастицы предпочтительно методом адсорбции наполняют действующим веществом.

В одном из особо предпочтительных вариантов осуществления гидрофильный протеин или по меньшей мере один из гидрофильных протеинов выбирают из группы протеинов, включающих сывороточные альбумины, желатин А, желатин В и казеин, а также аналогичные протеины или сочетание этих протеинов. Наиболее предпочтительно используют гидрофильные протеины человеческого происхождения.

Предложенные в изобретении наночастицы гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов, с которым связан аполипопротеин Е, применимы для переноса фармацевтических или биологических действующих веществ, которые иначе не преодолели бы гематоэнцефалический барьер, в частности для переноса действующих веществ через гематоэнцефалический барьер и стимулирования фармакологического действия. Предпочтительные действующие вещества относятся к группам цитостатиков, антибиотиков и лекарств, обладающих действием против неврологических заболеваний, например к группе, включающей болеутоляющие вещества, ноотропы, антиэпилептические вещества, седативные средства, психотропные лекарства, гормоны гипофиза, гормоны гипоталамуса, другие регуляторные пептиды и их ингибиторы. Примерами таких действующих веществ являются даларгин, лоперамид, тубокурарин, доксорубицин или подобные вещества.

На чертеже графически представлено обезболивающее действие (максимально возможное действие, МРЕ) после внутривенного введения наполненных лоперамидом наночастиц человеческого сывороточного альбумина (HSA), модифицированных полипопротеином посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида.

Таким образом, описанные в изобретении наночастицы, наполненные действующим веществом и модифицированные аполипопротеином, применимы для лечения большого числа болезней головного мозга. С этой целью в зависимости от соответствующей задачи лечения выбирают действующие вещества, связанные с системой-носителем. Система-носитель наиболее желательна для тех действующих веществ, которые не способны или в недостаточной степени способны преодолевать гематоэнцефалический барьер. Веществами, считающимися применимыми в качестве действующих веществ, являются цитостатики для лечения опухолей головного мозга, действующие вещества для лечения вирусных инфекций в области головного мозга, например ВИЧ-инфекций, но также и действующие вещества для лечения вызванных слабоумием поражений в качестве лишь нескольких областей применения.

Таким образом, другим предметом изобретения является применение наночастиц согласно изобретению для изготовления лекарственных средств, более точно применение наночастиц согласно изобретению, у которых функциональным протеином является аполипопротеин, для изготовления лекарственного средства для лечения болезней головного мозга и, соответственно, применение таких протеинов для лечения болезней головного мозга, поскольку эти наночастицы могут использоваться для переноса фармацевтических или биологических действующих веществ через гематоэнцефалический барьер.

Пример

Для получения наночастиц HSA путем десольватации 200 мг человеческого сывороточного альбумина растворили в 2,0 мл 10-ммольного раствора NaCl и довели pH раствора до 8,0. В раствор по каплям добавили 8,0 мл этанола со скоростью 1,0 мл/мин с одновременным помешиванием. В результате десольватации образовались наночастицы HSA со средним размером частиц 200 нм.

Наночастицы стабилизировали путем добавления 235 мкл 8-процентного раствора глутаральдегида. После инкубации в течение 12 часов наночастицы очистили путем трехкратного центрифугирования и диспергирования первоначально в очищенной воде, а затем в буфере из сополимера стирола и бутадиена (pH 8,0).

Для активирования наночастиц в 2,0 мл суспензии наночастиц (20 мг/мл в буфере из сополимера стирола и бутадиена) добавили 500 мкл раствора сшивающего агента NHS-PEG3400-Mal (60 мг/мл в буфере из сополимера стирола и бутадиена с pH 8,0) и в течение 1 часа выдерживали при комнатной температуре и одновременном взбалтывании. По истечении периода инкубации модифицированные полиэтиленгликолем наночастицы очистили очищенной водой, как это описано выше. В результате, получили полиэтиленгликолированные наночастицы HSA, которые посредством малеимидных групп производного полиэтиленгликоля, нанесенного на их поверхность, способны вступать в реакцию со свободными тиоловыми группами.

С целью ковалентного связывания аполипопротеина в его структуру сначала включили свободные тиоловые группы. С этой целью 500 мкг аполипопротеин растворили в 1,0 мл триэтаноламинового буфера (pH 8,0) и добавили 2-иминотиолан (реагент Трота) в 50-кратной избыточной молярной концентрации. После протекания реакции в течение 12 часов при комнатной температуре тиолированный аполипопротеин очистили методом эксклюзионной хроматографии в обессоливающей колонне с декстраном (D-Salt^® Column), в процессе которой отделили низкомолекулярные продукты реакции.

С целью ковалентного связывания тиолированного аполипопротеина с наночастицами HSA в 25 мг модифицированных полиэтиленгликолем наночастиц HSA добавили 500 мкг тиолированного аполипопротеина и в течение 12 часов выдерживали эту смесь при комнатной температуре. По завершении этой реакции не прореагировавший аполипопротеин удалили центрифугированием и повторным диспергированием наночастиц. На стадии окончательной очистки модифицированные аполипопротеином наночастицы HSA пропитали этанолом в количестве 2,6 об.%.

В отдельных пробах тиолировали аполипопротеин Е, аполипопротеин В и аполипопротеин А1 и связывали с наночастицами HSA.

Для наполнения наночастиц эталонным лекарством к 20 мг модифицированных АроЕ наночастиц добавили 6,6 мг лоперамида в 2,6 об.% этанола и выдерживали в течение 2 часов. По истечении этого времени не связанное лекарство отделили центрифугированием и повторным диспергированием; полученные наполненные лоперамидом модифицированные аполипопротеином наночастицы HSA пропитали водой для инъекций и довели содержание частиц до 10 мг/мл путем разбавления водой. Наночастицы использовали в опытах на животных, чтобы изучить их применимость для переноса действующих веществ через гематоэнцефалический барьер.

Являющийся опиатом лоперамид, который в растворенном виде не способен преодолевать гематоэнцефалический барьер (ВВВ), является эталонным лекарством, особо применимым в соответствующей системе-носителе для преодоления ВВВ. Обезболивающее действие, возникающее после применения содержащего лоперамид препарата, служит прямым доказательством накапливания вещества в центральной нервной системе и, следовательно, преодоления ВВВ.

Типичный препарат наночастиц, использованный в опытах на животных, содержал 10,0 мг/мл наночастиц, 0,7 мг/мл лоперамида и 190 мкг/мл АроЕ.

Готовые к употреблению препараты наночастиц (общий объем 2,0 мл) для опытов на животных имели следующий состав:

1) 10,0 мг/мл модифицированных аполипопротеином наночастиц HSA,

2) 190,0 мкг/мл ковалентно связанного аполипопротеина,

3) 0,7 мг/мл лоперамида (адсорбционно связанного с наночастицами),

4) вода для инъекций.

Мышам внутривенно вводили препараты из расчета 7,0 мг лоперамида на кг массы. Исходя из средней массы тела мышей в 20 г, животные получили 200 мкл упомянутого препарата.

С помощью этой системы было достигнуто показанное на чертеже обезболивающее действие после внутривенной инъекции с использованием описанного действующего вещества, которым являлся лоперамид. Обезболивание (ноцицептивную реакцию) выявляли путем теста на отдергивание хвоста, когда на хвост мыши направляли горячий пучок света и измеряли время, которое проходило, пока мышь не отдергивала хвост. Через 10 секунд (=100% МРЕ) опыт прерывали, чтобы не нанести травму мышам. Отрицательные значениям МРЕ получали в тех случаях, когда после введения препарата мышь отдергивала хвост раньше, чем до лечения.

Для сравнения использовали 0,7 мг/мл раствора лоперамида в 2,6 об.% этанола. Лоперамид в виде свободного вещества, как таковой, не оказывал обезболивающего действия из-за отсутствия переноса через гематоэнцефалический барьер.

1. Наполненные действующим веществом наночастицы на основе гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов для переноса упомянутого действующего вещества через гематоэнцефалический барьер, отличающиеся тем, что гидрофильный протеин или, по меньшей мере, один из гидрофильных протеинов выбирают из группы, включающей сывороточные альбумины, желатин А, желатин В и казеин, а упомянутые наночастицы содержат, по меньшей мере, один функциональный тиолированный протеин, выбранный из тиолированных аполипопротеинов, который посредством эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида связан с гидрофильным протеином или гидрофильными протеинами, при этом малеимидные группы эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроскисукцинимида образуют тиоэфирные связи с упомянутым тиолированным аполипопротеином(-ами).

2. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что гидрофильный протеин или, по меньшей мере, один из гидрофильных протеинов имеет человеческое происхождение.

3. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что функциональный протеин выбирают из группы, включающей аполипопротеин А1, аполипопротеин В и аполипопротеин Е.

4. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что эфир полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида выбирают из группы эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида, содержащих полиэтиленгликолевую цепочку со средней молекулярной массой 3400 Да или 5000 Да.

5. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что наночастицы наполняют действующим веществом путем адсорбции, включения или образования ковалентных связей или комлексообразования посредством реакционноспособных групп.

6. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что действующее вещество выбирают из группы, включающей цитостатики, антибиотики, антивирусные вещества, болеутоляющие вещества, ноотропы, антиэпилептические вещества, седативные средства, психотропные лекарства, гормоны гипофиза, гормоны гипоталамуса, другие регуляторные пептиды и их ингибиторы.

7. Наночастицы по п.1, отличающиеся тем, что действующее вещество выбирают из группы, включающей даларгин, лоперамид, тубокурарин и доксорубицин.

8. Способ получения наполненных действующим веществом наночастиц по п.1, включающий стадии, на которых:
десольватируют водный раствор гидрофильного протеина или сочетания гидрофильных протеинов, при этом упомянутый протеин(-ы) выбирают из группы, включающей сывороточные альбумины, желатин А, желатин В и казеин, и методом сшивания стабилизируют наночастицы, полученные путем десольватации, преобразуют аминогруппы на поверхности стабилизованных наночастиц с помощью эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида, тиолируют функциональные протеины, выбранные из аполипопротеинов, и ковалентно связывают тиолированный аполипопротеин(-ы) с наночастицами, преобразованными с помощью эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида, путем образования тиоэфирных связей между тиольными группами тиолированного аполипопротеина(-ов) и мелеимидными группами эфира полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что после связывания тиолированного протеина или пептидного фрагмента наночастицы путем адсорбции наполняют действующим веществом.

10. Способ по п.8, отличающийся тем, что десольватацию осуществляют путем помешивания и добавления смешиваемого с водой осадителя гидрофильных протеинов или путем высаливания.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что смешиваемый с водой осадитель гидрофильных протеинов выбирают из группы, включающей этанол, метанол, изопропанол и ацетон.

12. Способ по п.8, отличающийся тем, что для стабилизации наночастиц используют термические процессы, или двухфункциональные альдегиды, или формальдегид.

13. Способ по п.12, отличающийся тем, что в качестве двухфункционального альдегида используют глутаральдегид.

14. Способ по п.8, отличающийся тем, что эфир полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида выбирают из группы эфиров полиэтиленгликоль-α-малеимид-ω-N-гидроксисукцинимида, содержащих полиэтиленгликолевую цепочку со средней молекулярной массой 3400 Да или 5000 Да.

15. Способ по п.8, отличающийся тем, что в качестве средства, модифицирующего тиоловые группы, используют 2-иминотиолан.

16. Способ по п.8, отличающийся тем, что действующие вещества выбирают из группы, включающей цитостатики, антибиотики, антивирусные вещества, болеутоляющие вещества, ноотропы, антиэпилептические вещества, седативные средства, психотропные лекарства, гормоны гипофиза, гормоны гипоталамуса, другие регуляторные пептиды и их ингибиторы.

17. Способ по любому из пп.8-16, отличающийся тем, что действующие вещества выбирают из группы, включающей даларгин, лоперамид, тубокурарин и доксорубицин.

18. Применение наполненных действующим веществом наночастиц по любому из пп.1-7 для переноса фармацевтических или биологических действующих веществ через гематоэнцефалический барьер.

19. Применение по п.18, отличающееся тем, что действующие вещества выбирают из группы, включающей цитостатики, антибиотики, антивирусные вещества, болеутоляющие вещества, ноотропы, антиэпилептические вещества, седативные средства, психотропные лекарства, гормоны гипофиза, гормоны гипоталамуса, другие регуляторные пептиды и их ингибиторы.

20. Применение по п.18, отличающееся тем, что действующие вещества выбирают из группы, включающей даларгин, лоперамид, тубокурарин и доксорубицин.

21. Применение по п.18, отличающееся тем, что наночастицы используют для лечения поражений головного мозга.

22. Применение наночастиц по любому из пп.1-7, у которых функциональным протеином является аполипопротеин, для изготовления лекарственного средства для лечения поражений головного мозга.