Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью



Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью
Получение полифункциональных сульфатированных производных на основе порошковой целлюлозы, обладающих антикоагулянтной активностью

 


Владельцы патента RU 2430729:

Учреждение Российской академии наук Институт химии Коми научного центра Уральского отделения РАН (RU)
Государственное учреждение Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук (RU)

Изобретение относится к сульфатированным производным целлюлозы, обладающим антикоагулянтной активностью. Сульфатированное производное получают путем сульфатирования целлюлозного материала. Сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида. В качестве целлюлозного материала используют порошковые формы целлюлозы со степенью полимеризации от 250 и ниже, выделенные из растительного сырья. Для получения сульфата карбоксиметилцеллюлозы перед реакцией сульфатирования натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают моногидратом n-толуолсульфокислоты в безводном N,N-диметилформамиде в эквимолярном соотношении карбоксиметильная группа - n-толуолсульфокислота. Обработку осуществляют в безводном N,N-диметилформамиде. Для получения сульфата амидоэтилцеллюлозы перед реакцией сульфатирования проводят активацию цианоэтилцеллюлозы в растворе N,N-диметилформамида. Реакционная смесь для получения сульфата фосфатцеллюлозы включает от 2 до 8 моль воды на моль целлюлозы. Степень замещения по сульфатным группам в полученных сульфатированных производных целлюлозы составляет не менее 1,0. На основе этих сульфатированных производных целлюлозы получают эффективные средства профилактики и лечения тромботических состояний. 4 н.п. ф-лы, 5 табл.

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для создания эффективных средств профилактики и лечения тромботических состояний (инфаркты, инсульты различной локализации).

Применяемый в нашей стране антикоагулянт прямого типа действия нефракционированный гепарин (НФГ) является полисахаридом с молекулярной массой 2-40 кДа, в среднем 15 кДа, и обладает рядом нежелательных побочных эффектов (остеопорозы, тромбоцитопении, повышение функциональной активности тромбоцитов, геморрагические осложнения). С целью разработки новых антикоагулянтных средств, лишенных побочных эффектов гепаринов, получают сульфатированные полисахариды (СП) растительного происхождения (выделенные из водорослей, лишайников, грибов, высших растений), а также выделенные из тканей морских беспозвоночных, членистоногих или млекопитающих [Mayer A.M.S., Rodriguez A.D., Berlinck R.G.S., et al. Marine pharmacology in 2003-4: marine compounds with anthelminthic, antibacterial, anticoagulant, antifungal, antiinflammatory, antimalarial, antiplatelet, antiprotozoal, antituberculosis, and antiviral activities; affecting the cardiovascular, immune and nervous systems, and other miscellaneous mechanisms of action. // Comp Biochem Physiol С Toxicol Pharmacol. - 2007, N.4. Vol.145. - P.553-581; Yoona S.J., Yub M.A., Pyunb Y.R., et al. The nontoxic mushroom Auricularia auricula contains a polysaccharide with anticoagulant activity mediated by antithrombin // Thrombosis Research. - 2003. Vol.112. P.151-158; Shen W.Z., Zhou R.F., Wang X.F., Ding Q.L., Wang H.L. Antithrombotic mechanisms of holothurian glycosaminoglycan extracted from sea cucumber Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. // 2006. - N.9. - Vol.27. P.579-83; Jayakumar R., Nwe N., Tokura S., Tamura H. Sulfated chitin and chitosan as novel biomaterials // International Journal of Biological Macromolecules. - 2007. - N.40. P.175-181]. Для придания молекулам полисахаридов необходимых свойств их деполимеризуют [Noti С., Seeberger P. Chemical approaches to define the structure-activity relationship of heparin-like glycosaminoglycans. // Chemistry & Biology. - 2005. - V.12. N 7. P.731-756], в них встраивают функциональные группы [Yang J., Du Y., Huang R., et al. The structure - anticoagulant activity relationships of sulfated lacquer polysaccharide. Effect of carboxyl group and position of sulfation // International Journal of Biological Macromolecules. - 2005. N.36. - P.9-15], объединяют (конъюгируют) с молекулами других полисахаридов [Du J., Zhang S., Sun R., Zhang L. Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles for drug delivery. I. Physicochemical characterization of the carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles. // Biopolymers. - 2005. - V.78, N 1. P.1-8]. Структура макромолекулы полисахарида играет важную роль при проявлении антикоагулянтной активности (АА). Так, под действием модифицированного аргинином хитозана (конъюгат хитозан - аргинин) происходят конформационные изменения молекулы тромбина [Liu W.G., Zhang J.R., Cao Z.O., Xu F.Y., Yao К.D. A chitosan-arginine conjugate as a novel anticoagulation biomaterial. // J. Mater Sci Mater Med. - 2004. N11. Vol.15. - P.1199-203]. Введение функциональных групп для получения химически модифицированного N-propanoyl-, N-hexanoyl-сульфата хитозана, и сульфата хитозана, содержащего кватернизованные атомы азота, приводит к увеличению АА [Huang R., Du Y., Yang J., Fan L. Influence of functional groups on the in vitro anticoagulant activity of chitosan sulfate. // Carbohydr Res. - 2003. N.6. - Vol.14, - P.483-489]. При изменении положительного заряда поверхности полимерного биоматериала на основе хитозана с боковыми цепями из полиэтиленгликоля и гексанала на нейтральный или отрицательный при введении SO3- групп, снижается адгезия тромбоцитов и возрастает биосовместимость с кровью, которая положительно коррелирует с содержанием полиэтиленгликоля внутри полимера [de Vasconcelos С.L., Bezerril P.M., dos Santos D.E.S., Dantas T.N.С. Effect of molecular weight and ionic strength on the formation of polyelectrolyte complexes based on poly(methacrylic acid) and chitosan. // Biomacromolecules. - 2006. N.7. - P.1245-1252].

Препятствиями для широкого внедрения антикоагулянтов на основе полисахаридов микробного и животного происхождения или их модификаций являются либо их малодоступность, дороговизна, сложности, связанные с последующей химической модификацией и очисткой целевого соединения, либо недостаточная биологическая совместимость.

Большей части указанных недостатков лишены полисахариды растительного происхождения и, прежде всего, целлюлоза - доступные и биосовместимые, они представляют собой прекрасную основу для создания новых антикоагулянтных средств. Поскольку сульфаты целлюлозы являются полусинтетическими аналогами распространенных в природе сульфатированных полисахаридов, а синтез сульфатированных производных целлюлозы экономически оправдан, активно разрабатываются методы их получения, исследуются их свойства.

Известны работы, посвященные исследованию производных целлюлозы в качестве антикоагулянтов крови [Dedgumjorn А.С., Toyoda H., Woo E. Effect of (1→3)-and (1→4)-linkages of fully sulfated polysaccharides on the ir anticoagulant activity // Carbohydrate Research V.337. - 2002. P.925-933]. Отмечено, что наиболее перспективны в этом отношении производные, содержащие сильные электроотрицательные группы - сульфатные, сульфонатные, фосфатные, что предполагает механизм действия, связанный с кооперативным электростатическим комплексообразованием между белковыми телами крови и производным целлюлозы.

Для введения в структуру целлюлозы сульфатных групп используют различные методы: этерификацию целлюлозы серной кислотой и ее смесями с алифатическими спиртами [Петропавловский Г.А., Крунчак М.М. Сернокислые эфиры целлюлозы (сульфатцеллюлоза) // ЖПХ. - 1967. -Т.38. - №10. - С.2209-2220], сульфатирование серным ангидридом в присутствии пиридина, N,N-диметилформамида (ДМФА) и других органических оснований; реакции переэтерификации ацетатов и формиатов целлюлозы триоксидом серы или хлорсульфоновой кислотой в гомогенной среде органического растворителя [Fhilipp В., Wagenknecht W., Nehls I. Untersuhungen zur sulfatirung von celluloseformiat im vergleich zu cellulose acetat unter homogen reaktionbedingungen // Cellulose chem. and tech. -1990. - 24. - P.667-678]. Описан метод гомогенного сульфатирования целлюлозы в среде N,N-диметилформамида, который состоит в обработке набухшей в этом растворителе целлюлозы газообразным оксидом азота (V) и в последующей обработке полученного гомогенного раствора газообразным оксидом серы (IV). После выделения и очистки получают сульфаты целлюлозы с высокой степенью замещения [Schuldt U., Wagenknecht W., Richter A. Electrosorption of sodium cellulose sulfates with different substitution patterns // Cellulose. - 2002. - №9. - P.271-282].

Для использования в качестве антикоагулянтов крови значительный интерес представляют также смешанные эфиры целлюлозы, содержащие помимо сульфатной группы дополнительные функциональные группы (ацетатную, карбоксильную, аминную и другие). Способы получения таких производных, как правило, включают несколько стадий [Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cryogel removal // J. Artif. Organs - 2002. - V.5. P.132-135; Baumann H. Exclusive and complete introduction of aminogroups and thier N-sulfo and N-carboxymethyl groups into the 6-position cellulose with out the use of protecting groups // Carbohydrate Research. - 2002. N.337. - P.1297-1307].

Исходным материалом для синтеза сульфатов целлюлозы тем или иным способом с дополнительными заместителями или без служат различные структурные модификации целлюлозы - хлопковая волокнистая целлюлоза со степенью полимеризации от 800 и выше [Richter A., Klemm D. Regioselective sulfation of trimethylsilyl cellulose using different SO3-complexes // Cellulose. - 2003. N.10. - P.133-138], а в последнее время также микрокристаллическая целлюлоза (МКЦ) [Ardisone S., Dioguardi F.S., Mussini Т., et al. Microcrystalline cellulose powders: structure, surface feature sand water sorption capability // Cellulose. - 1999. - N 6. - P.57-69] и прочие порошковые формы целлюлозы (ПЦ), получаемые из целлюлозы хлопка, древесины или другого сырья тем или иным способом.

Задачей настоящего изобретения является получение эффективных средств профилактики и лечения тромботических состояний на основе порошковых форм целлюлозы, выделенной из различного сырья растительного происхождения.

Технический результат состоит в том, что в структуру целлюлозной макромолекулы вводятся сульфатные группы, либо сульфатные группы совместно с карбоксиметильными, либо амидоэтильными, либо фосфатными группами в различном соотношении, но со степенью замещения по сульфатным группам (CЗS) не менее 1.0, в этом и состоит технический результат.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования целлюлозного материала, согласно изобретению в качестве такового используются порошковые формы целлюлозы со степенью полимеризации от 250 и ниже, выделенные из растительного сырья, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель Х=Н, -SO3-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат карбоксиметилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, согласно изобретению перед реакцией сульфатирования натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают моногидратом n-толуолсульфокислоты в эквимолярном соотношении карбоксиметильная группа - n-толуолсульфокислота в безводном N,N-диметилформамиде, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель X=Н, -SO3-, CH2COO-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат амидоэтилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, согласно изобретению перед реакцией сульфатирования проводят активацию цианоэтилцеллюлозы в растворе N,N-диметилформамида, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель Х=Н, -SO3, CH2CH2CONH2, при этом сульфатирование осуществляют в растворе N,N-диметилформамида.

Технический результат достигается тем, что сульфатированное производное целлюлозы - сульфат фосфата целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозного сырья, согласно изобретению реакционная смесь включает от 2 до 8 моль воды на моль целлюлозы, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

,

где заместитель X=Н, -SO3, PO(ONa)2 либо RO-PO(ONa)2, где R - целлюлоза, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

Ближайшим к заявляемому способу получения сульфатированных полисахаридов с указанной степенью замещения или выше является способ, предложенный для синтеза трисульфатов курдлана [Yoshida Т., Yasuda Y., Mimura T. Synthesis of curdlan sulfates having inhibityory effects in vitro against AIDS viruses HIV-1 and HIV-2 // Carb. Res. - 1995. V.276, - P.425-436]. По этому способу готовят сульфатирующую смесь прибавлением ClSO3H (33.2 моль) к сухому пиридину (80 см3). После чего вносят курдлан (3.1 моль). Реакционную смесь термостатируют при 100°С в течение часа. Затем охлаждают и прибавляли избыток 10%-ного NaOH. Полисахарид осаждают ацетоном, выделяют и очищают методом диализа.

В отличие от описанного способа, для получения сульфатов порошковой целлюлозы (СЦ) нами предлагаются следующие условия проведения реакции: порошковую целлюлозу диспергируют в сухом пиридине и термостатируют при 100°С в течение часа для активации полимера. Затем к реакционной смеси при охлаждении до 0-5°С прибавляют 1-6 моль ClSO3H в расчете на моль элементарного звена целлюлозы в зависимости от желаемой степени сульфатирования получаемой СЦ. Также нами предлагается использовать меньший избыток пиридина (40-60 см3 на 1.0 г целлюлозы, в зависимости от вида ПЦ). Наконец, предлагается использовать следующий температурный режим проведения реакции: 100°С в течение первого часа, затем 1 ч при 90°С и в течение последнего часа - 80°С.

Известно несколько методов получения сульфатов карбоксиметлцеллюлозы (СКМЦ) (СКМЦ). В работе [Miyamoto К., Shimizu P., Tokita M. Adhesion of 3-carboxymethyl-cellulose-6-sulfate to extra domain A-containing fibronectin: development of ligands for cryogel removal // J. Artif. Organs -2002.- V.5. P. 132-135] описан метод получения СКМЦ исходя из СЦ. По нему, карбоксиметилирование СЦ, синтезированного тем или иным способом, осуществляют монохлоруксусной кислотой в среде воды и изо-пропилового спирта в присутствии гидроксида натрия, при температуре 60°С. Недостатком этого метода является затруднения в карбоксиметилировании СЦ с большой степенью сульфатированияя, т.к. с увеличением СЗs в препаратах СЦ, при последующем карбоксиметилировании нарастают процессы взаимоотталкивания одноименно заряженных сульфатных и монохлорацетатных групп. Среди других недостатков метода следует отметить процессы отщепления сульфатных групп, возможные в условиях такого алкилирования СЦ.

Способ одновременного введения сульфатной и карбоксиметильной группы в структуру целлюлозы предложен авторами работы [Тимохин И.М., Прокофьева М.В. и др. Получение и свойства некоторых смешанных эфиров целлюлозы // Химия и технология производных целлюлозы. Владимир, 1971, с.223-227]. Для этого предлагается использовать обработку целлюлозы смесью монохлоруксусной и фторсульфоновой кислот в присутствии щелочи. Реакция осуществляется в водной среде. По этому способу получены препараты СКМЦ со степенью замещения по сульфатным группам до 0.7, по карбоксиметильным группам до 0.9. Однако недостатком метода является дороговизна и токсичность фторсульфоновой кислоты.

Ближайший к заявляемому способ получения СКМЦ предложен авторами работы [Vogt S., Heinze T. Preparation of carboxymethylcellulose sulfate of high degree of substitution // Carbohydrate Research. 1995. V.266. P.315-320]. По нему сульфатированию КМЦ предшествует стадия активации, которая состоит в обработке КМЦ-Na безводной n-толуолсульфоновой кислотой в N,N-диметилацетамиде в течение 30 минут при 60°С. В результате чего реакционная смесь гомогенизируется. Далее вносят сульфатирующий агент - SO3, или ClSO3H. Реакцию ведут в гомогенном растворе при комнатной температуре в течение часа.

Недостатками этого способа являются использование дорогой и неудобной в обращении безводной n-толуолсульфоновой кислоты, а также процессы деструкции целлюлозных макроцепей в присутствии сульфатирующих агентов и образующихся продуктов реакции.

В отличие от описанного способа, нами предлагается использовать вместо безводной n-толуолсульфоновой кислоты ее более доступный, дешевый и удобный в обращении моногидрат.Отличительной особенностью предлагаемого способа также является замена N,N-диметилацетамида на N,N-диметилформамид, что позволяет осуществить гомогенную этерификацию в более мягких условиях, значительно снижая тем самым процессы деструкции, т.к. сульфатирующим агентом в этом случае служит комплекс N,N-диметилформамид - ClSO3H, образующимся in situ. Существенно и то, что N,N-диметилформамид является доступным, недорогим растворителем.

Сульфаты целлюлозы, содержащие в структуре макромолекулы дополнительно амидные группы - сульфат амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ) были впервые получены нами сульфатированием цианэтилцеллюлозы и последующим мягким омылением CN-групп. Для сульфатирования использовали препараты цианэтилцеллюлозы, полученные обычными методами. Высокое сродство препаратов цианэтилцеллюлозы к органическим растворителям позволяет осуществлять сульфатирование в ДМФА при гомогенном составе реакционной среды. Раствор препарата цианэтилцеллюлозы со CЗCN=0.36 в ДМФА может быть получен после перемешивания и кратковременного нагревания. Сульфатирование осуществляли хлорсульфоновой кислотой при комнатной температуре. Через час обработки был получен сульфат цианэтилцелюлозы со CЗs=0.79. Увеличение продолжительности реакции до 2-3 ч приводит к препаратам со степенью замещения около 1.30. Непосредственно после окончания реакции выделяли полупродукт - сульфат цианэтилцеллюлозы, омылением CN-групп которой получали САЭЦ. Омыление цианэтиловых групп осуществляли в щелочной среде (рН=10) в присутствии пероксида водорода. При такой обработке цианэтильные группы количественно омылялись до амидных и, частично, до карбоксиэтильных. По данным потенциометрического титрования, содержание карбоксиэтильных групп в препаратах САЭЦ не превышает 5-10% от количества цианэтильных групп.

Получение смешанного эфира целлюлозы, содержащего одновременно сульфатные и фосфатные группы, - сульфата фосфата целлюлозы (СФЦ) осуществляли по разработанному нами одностадийному методу. По структуре и свойствам СФЦ является аналогом известных водорастворимых ионогенных эфиров целлюлозы, содержащих сильные электроотрицательные группы (сульфатные, сульфонатные, фосфатные), например сульфатов или фосфатов целлюлозы.

Ближайшим соединением аналогичного с СФЦ функционального состава является сульфатированный фосформаннан, получение которого описано в работе [Yu G., Gunay N.S., Linhardt R.J. et al. Preparation and anticoagulant activity of the phosphosulfomannan PI-88 // European Journal of Medicinal Chemistry - 2002. V.37. P.783-791]. Авторами произведено сульфатирование экзополисахарида микробиологического происхождения PI-88, содержащего фосфатные группы. Полученные препараты фосфорсульфоманнана содержат одновременно сульфатные и фосфатные группы и обладают высокой антикоагулянтной активностью.

Ближайшими способом этерификации целлюлозы с целью получения сульфатированных эфиров целлюлозы, содержащих дополнительные (ацетатные) группы, является метод, предложенный в патенте [Пат. Евраз. РСТ/ЕР2006/060626]. По данному методу целлюлозу этерифицируют смесью, включающей хлорсульфоновую кислоту и ангидрид (или хлорангидрид) уксусной кислоты в безводном N,N-диметилформамиде (ДМФА). Исходная гетерогенная реакционная смесь гомогенизируется в процессе реакции. После выделения и очистки получают препараты со степенью замещения по сульфатным группам до 1.0.

Ближайший метод-аналог фосфорилирования целлюлозы описан авторами [Петропавловский Г.А., Котельникова Н.Е. Дегидратация и фосфорилирование целлюлозы оксидом фосфора (5) в среде диметилформамида // Cellulose chemistry and technology 1985. - N.19. P.591-600]. По этому методу хлопковую микрокристаллическую целлюлозу обрабатывают раствором оксида фосфора (V) в безводном ДМФА при 70°С. Получают не растворимый в воде фосфат целлюлозы с содержанием фосфора до 7% в виде преимущественно дву- и трехзамещенных фосфатных групп.

Принципиальным отличием предлагаемого метода от сходных методов сульфатирования целлюлозы в гомогенных условиях в среде N,N-диметилформамида является получение в результате этерификации сульфата целлюлозы, содержащего дополнительные (фосфатные) группы, а также обязательная добавка воды в процессе приготовления этерифицирующей смеси. Отличием предлагаемого метода от метода фосфорилирования раствором Р2О5 в ДМФА, кроме прочего, является получение водорастворимого продукта с низким содержанием двух- и трехзамещенных фосфатных групп. К достоинствам метода относится также возможность получения полифункционального производного целлюлозы в одну стадию.

Нами предлагается способ одностадийного получения СФЦ, состоящий в следующем. Посредством одностадийной этерификации порошковой или волокнистой целлюлозы раствором оксида фосфора (V) и хлорсульфоновой кислоты (в различных мольных соотношениях) в N,N-диметилформамиде с содержанием воды 2 моль на 1 моль Р2О5 при температуре 30-70°С и продолжительности реакции 1-3 ч.

Получение СЦ

Пример 1. Сульфат целлюлозы (СЦ)

Образец порошковой целлюлозы (1.00 г; 6.17 ммоль), высушенный до постоянной массы при 103°С, суспендировали в пиридине при 0°С. Охлаждая и интенсивно перемешивая реакционную смесь, в нее по каплям вносили хлорсульфоновую кислоту (1-4 моль в пересчете на моль ангидроглюкозных единиц). После термостатирования в течение 1 ч при 100°С реакцию продолжали в течение 1 ч при 90°С и затем 1 ч при 80°С. Продукт отфильтровывали на стеклянном фильтре, промывали 20 см3 ацетона и растворяли в 50 см3 4%-ного NaOH. Образовавшуюся натриевую соль сульфата целлюлозы (СЦ-Na+) осаждали 100 см этанола, промывали водно-этанольной смесью от неорганических солей и сушили в вакууме [Du J., Zhang S., Sun R., Zhang L. Novel polyelectrolyte carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles for drug delivery. I. Physicochemical characterization of the carboxymethyl konjac glucomannan-chitosan nanoparticles. // Biopolymers. - 2005. - V.78, N 1. P.1-8].

ИК спектр: 1240 см-1 (полоса средней интенсивности, асимметричные колебания S=O); в области 810 см-1 (интенсивная полоса поглощения, валентные колебания -C-SO3-); широкая полоса в области 3400 см-1 (колебания связи -ОН). ЯМР 13С спектр: химические сдвиги 102.2, 73.71, 76.1, 79.6, 77.4 и 60.1 м.д. (C16). Сигнал 66.4 м.д. (C-6S), для высокозамещенных образцов СЦ все -ОН группы при С6 замещены. Химические сдвиги 81.5 и 77.1 м.д. указывают на сульфатирование по С2 и С3 атому соответственно.

Пример 2. Сульфат карбоксиметилцеллюлозы (СКМЦ)

Высушенный до постоянной массы образец КМЦ-Na (1.0 г) суспендировали в 10 см3 ДМФА. При интенсивном перемешивании и охлаждении до 5°С добавляли безводную n-толуолсульфоновую кислоту (1.0-2.0 моль в пересчете на моль карбоксильной группы полимера) и термостатировали 0.5 ч при 60°С. Затем колбу с сильно набухшим полимером охлаждали до 0°С, добавляли по каплям хлорсульфоновую кислоту (2.0 моль в пересчете на моль мономерного звена) и термостатировали от 3 до 5 ч. Для выделения полимера к охлажденной реакционной смеси прибавляли 20 см3 безводного ацетона. Осадок отфильтровывали, обрабатывали водным раствором гидроксида натрия. Из полученного раствора этанолом осаждали СКМЦ-Na+, полимер отделяли, промывали водно-этанольной смесью для очистки от неорганических солей и сушили в вакууме при 60°С.

ИК-спектр СКМЦ-Na+: 1626 см-1СОО-), 1240 см-1SO2), 814 см-1SO). ЯМР-13С спектр (в D2O): химические сдвиги 61.6 (С6), 75.3 (С5), 79.8 (С4), 76.1 (С3), 74.7 (С2), 102.8 (C1), 179.3 (-СН2-СООН), 71.8 (СН2 при С6), 72.8 и 68.1 (C-2S и C-6S).

Пример 3. Сульфат цианоэтилцэллюлозы (СЦЭЦ) и амидоэтилцеллюлозы (САЭЦ)

Для сульфатирования цианэтилцеллюлозы (CЗCN=0.36) 1.0 г образца растворяли в 10 см3 ДМФА и оставляли на 1 ч при комнатной температуре. Колбу с сильно набухшим и частично растворившимся полимером охлаждали до 0°С, по каплям прибавляли хлорсульфоновую кислоту (2.0 моль в пересчете моль мономерного звена) и термостатировали при 20°С. По окончании реакции, охлаждая и перемешивая, реакционную смесь нейтрализовали насыщенным раствором ацетата натрия в этаноле. Осажденный полупродукт отделяли на фильтре, растворяли в 20 см3 раствора 3%-ного Н2О2 при рН=10. Гидролиз нитрильных групп проводили в течение суток при комнатной температуре, после чего полимер осаждали этанолом (100 см3), отделяли на стеклянном фильтре и очищали диализом на целлофановых мембранах. Полученную Na+-соль САЭЦ осаждали этанолом (150 см3), отделяли, промывали водно-этанольной смесью, инклюдировали ацетоном и сушили в вакууме при 60°С.

ИК спектр САЭЦ-Na+ 1626 см-1CONH «амид 1»), 1240 см-1SO2), 814 см-1SO).

ЯМР 13С спектр (в D2O): сигнал для С6 отсутствует; 74.3 (С3), 73.5 (С2), 103.8-102.2 (С1); δ178.5 (-C2H4-CONH2); 36.9 и 37.5 (αСН2 и βСН2 при CONH2), 83.8 и 68.6 (C-2S и С-6S). В области 70-73 м.д. может также находится сигнал C-3S.

Пример 4. Сульфат фосфата целлюлозы (СФЦ-Na+)

1.00 г коммерческой микрокристаллической целлюлозы или ПЦ, полученной кислотно-катализируемым гидролизом волокнистой целлюлозы, выделенной из хлопка или древесины, суспендировали в 10 см3 сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см3 ДМФА с содержанием 1.2% мас. воды растворяли 0.88 г Р2О5 при охлаждении. К полученной смеси по каплям прибавляли 1.43 г ClSO3H, обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0-5°С. Раствор оставляли на 5-6 ч, после чего вносили к набухшей целлюлозе, реакционную массу перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50°С. По истечении этого строка, гомогенную реакционную смесь диспергировали в 250 см3 холодного ацетона. Осадок отфильтровывали, диспергировали в 100 см3 холодной воды и нейтрализовали 4%-ным NaOH по фенолфталеину. Полученный раствор диализовали на целлофановых мембранах против дистиллированной воды (до отрицательной реакции на сульфат-ионы); полимер осаждали этанолом и сушили в вакууме при 60°С.

Получали водорастворимый смешанный эфир целлюлозы с содержанием фосфора 6.0% и серы 9.0%, представляющий собой порошок белого цвета.

Пример 5.

К 1.00 г порошковой целлюлозы (полученной частичным кислотным гидролизом волокон беленой целлюлозы лиственных пород древесины) прибавляли 30 см3 сухого ДМФА и оставляли на ночь. Отдельно готовили этерифицирующую смесь, для чего в 20 см3 ДМФА с содержанием 1.2% мас. воды растворяли 0.88 г Р2О5 при охлаждении. К полученной смеси по каплям прибавляли 1.43 г ClSO3H, обеспечивая хорошее перемешивание и охлаждение до 0-5°С. Полученный раствор оставляли на 5-6 ч, после чего вносили к набухшей целлюлозе, реакционную массу перемешивали и термостатировали 1.5 ч при 50°С. Дальнейшую обработку вели, как в примере 1.

Получали водорастворимый смешанный эфир целлюлозы с содержанием фосфора 8,0% и серы 9.6%, представляющий собой порошок белого цвета.

ИК спектр СФЦ-Na+ 814 см-1SO), 1240 см-1SO2); в области 1250-1235 см-1 также возможно поглощение фосфатных групп (υP=O для групп, включенных и не включенных в водородную связь). Полоса в области 1640 см-1 может быть соотнесена с валентными колебаниями связи Р=О, -ОН, кроме того, в этой области поглощает сорбированная вода. ЯМР 13С спектр (в D2O): сигналы для С6 и С2 отсутствуют; 74.7 (С3), 103.6-101.7 (С1); 83.4 и 67.8 (C2S и C6S). В области 81-83 м.д. может также находиться сигнал С3P. Сигналы ядер углерода C1, C2, С3 дополнительно расщеплены на дуплеты в результате спин-спинового взаимодействия с фосфором (JPOC=4.0-6.0 Гц). ЯМР 31Р спектр СФЦ-Na+ (в D2O,):δ 2,4.

Влияние модифицированных образцов целлюлозы СЦ, СКМЦ, САЭЦ и СФЦ (Табл. 1-4) на изменение времени свертывания плазмы крови человека исследовали в коагулологических тестах активированного частичного тромбопластинового времени (аЧТВ, влияние на внутренний путь свертывания крови) и РеаКлот НПО "Ренам" (влияние на активность фактора Ха) [Колмен Р.У. Нарушения реакций образования тромбина. М., Медицина, 1988, с.175-208]. Лиофильно высушенную плазму человека приобретали в НПО «Ренам». Для расчета специфических антитромбиновой (анти-фактор IIa, aIIa) и антифактор Ха (аХа) активностей использовали калибровочную кривую 5-го Международного стандарта нефракционированного гепарина (NIBSC).

Возможность осуществления заявляемого изобретения показана следующими примерами.

Пример 6.

К смеси 0.06 см3 плазмы и 0.06 см3 аЧТВ-реагента (НПО "Ренам") добавляли растворы модифицированной целлюлозы в конечных концентрациях 0.01-2.50 мкг/см3. Через 3 мин инкубации добавляли 0.05 мл 0.025 М раствора CaCl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов. В таблице 5 показаны специфические антитромбиновые активности исследованных образцов модифицированной целлюлозы.

Пример 7.

К смеси 0.025 см3 плазмы и 0.05 см3 раствора смеси фактора Ха (НПО "Ренам") и фосфолипидов добавляли растворы модифицированной целлюлозы в конечных концентрациях 0.0022-2.6700 мкг/ см3. Через 2 мин инкубации при 37°С добавляли 0.05 см3 0.035 М раствора CaCl2 и фиксировали время (сек) появления фибринового сгустка. Отмечали достоверное удлинение времени свертывания плазмы с увеличением концентрации образцов. В таблице 5 показаны специфические анти-Ха активности исследованных образцов модифицированной целлюлозы.

Образцы модифицированной целлюлозы демонстрировали антитромбиновую активность от 2.8 до 118.5 ЕД/мг. Активность против фактора Ха составила 0.14-32.9 ЕД/мг. Особенно перспективными антикоагулянтами являются образцы СЦ 4, СЦ 5, СЦ 6, которые показывали антитромбиновую активность более 70 ЕД/мг. Образцы СФЦ отличаются тем, что демонстрируют отношение активностей aXa/aIIa более 2. У используемых в настоящее время в клинической практике прямых антикоагулянтов - низкомолекулярных гепаринов - отношение активностей aXa/aIIa составляет 1.5-3.5 [Kishimoto T.K., Viswanathan К., Ganguly T., Elankumaran S., et al. Contaminated heparin associated with adverse clinical events and activation of the contact system // N. Engl. J Med. - 2008. N.358. Vol.23. - P.2457-2467].

Контроль чистоты исходных веществ и анализ продуктов реакции осуществляли с использованием следующих методов: ИК спектры записывали на спектрометре "Prestige-21", в таблетках KBr. Спектры ЯМР 13С полученных веществ записывали на спектрометре "Bruker DRX-300" (300 МГц) в D2O. Элементный анализ образцов (определение серы) в сульфатированных производных целлюлозы осуществляли на приборе ЕА-1110 фирмы «СЕ instruments».

Таблица 1
Условия и результаты сульфатирования ПЦ
Образец Исходный препарат Сульфатирующий агент Растворитель Мольное соотношениеа Температура, °С Время реакции, ч S
СЦ1 МКЦ SO3/Pyr Пиридин 3 50 3 0.24
СЦ2 МКЦ SO3/Pyr Пиридин 3 б 3 0.74
СЦ3 МКЦ SO3/Pyr Пиридин 3 в 3 1.28
СЦ4 ПЦ SO3/Pyr Пиридин 2 в 3 1.30
СЦ5 ПЦ SO3/Pyr Пиридин 3 в 3 1.63
СЦ6 ПЦ SO3/Pyr Пиридин 4 в 3 2.95
а - ангидроглюкозная единица: сульфатирующий агент, моль/моль; б - 1 ч 90°С, 2 ч 80°С; в - 1 ч 100°С, 1 ч 90°С, 1 ч 80°С
Таблица 2
Условия и результаты сульфатирования КМЦ
Образец СЗСООН Экв. ClSO3H на мономерное звено КМЦ S
СКМЦ 1 0.97 2 0.48
СКМЦ 2 0.97 2 1.01
СКМЦ 3 0.97 3 1.50
СКМЦ 4 1.53 2 0.60
Таблица 3
Условия и результаты сульфатирования цианэтилцеллюллозыа
Образец CN Продолжительность реакции, мин S
САЭЦ-1 0.14 60 0.75
САЭЦ-2 0.14 120 0.83
САЭЦ-3 0.14 180 0.87
САЭЦ-4 0.36 60 0.79
САЭЦ-5 0.36 120 1.29
САЭЦ-5 0.36 180 1.37
а - 2 моль ClSO3H на ангидроглюкозную единицу
б - Определение методом ГПХ, средняя молекулярная масса основной фракции, элюент 0.15 M NaCl
Таблица 4
Результаты этерификации целлюлозы смесью Р2О5 - ClSO2OH - ДМФА-вода
Образец Исходный материал Соотношение ClSO3H:P2O5, моль/моль Содержание S, % Содержание Р, % Выход Na-соли (% к массе целлюлозы)
СФЦ 1 МКЦ 2 9.0 6.0 152
СФЦ 2 ПЦ 2 9.6 8.0 140
СФЦ 3 ПЦ 2 10.0 7.5 н/о
СФЦ 4 МКЦ 3 11.1 7.0 142
СФЦ 5 ПЦ 3 12.6 8.8 164
Таблица 5
Специфические антикоагулянтные активности образцов модифицированной целлюлозы
Шифр образца Анти-IIa, ЕД/мг Анти-Ха, ЕД/мг aXa/aIIa
СЦ 3 27.8±6.2 7.5±3.0 0.27
СЦ 4 118.5±6.9 23.3±2.1 0.20
СЦ 5 77.9±5.5 20.3±1.9 0.26
СЦ 6 86.5±5.2 32.9±3.7 0.38
СКМЦ 2 4.1±0.7 0.43±0.09 0.10
САЭЦ 4 6.0±1.8 0.14±0.07 0.02
САЭЦ 6 22.2±4.1 3.4±0.5 0.15
СФЦ 1 4.5±1.9 19.6±1.6 4.38
СФЦ 3 5.6±2.1 11.9±1.1 2.12
СФЦ 4 12.6±3.4 9.6±0.9 0.76
СФЦ 5 2.8±1.8 31±17 11.0

1. Сульфатированное производное целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования целлюлозного материала, отличающееся тем, что в качестве такового используются порошковые формы целлюлозы со степенью полимеризации от 250 и ниже, выделенные из растительного сырья, преобладающая молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

где заместитель Х - Н, -SO3-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

2. Сульфатированное производное целлюлозы - сульфат карбоксиметилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, отличающееся тем, что перед реакцией сульфатирования натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы обрабатывают моногидратом n-толуолсульфокислоты в безводном N,N-диметилформамиде в эквимолярном соотношении карбоксиметильная группа - n-толуолсульфокислота в безводном N-диметилформамиде, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

где заместитель Х - Н, -SO3-, СН2СОО-, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

3. Сульфатированное производное целлюлозы - сульфат амидоэтилцеллюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозсодержащего сырья, отличающееся тем, что перед реакцией сульфатирования проводят активацию цианоэтилцеллюлозы в растворе N,N-диметилформамида, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

где заместитель Х - Н, -SO3, CH2CH2CONH2, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.

4. Сульфатированное производное целлюлозы - сульфат фосфата целлюлозы, обладающее антикоагулянтной активностью, полученное путем сульфатирования исходного целлюлозного сырья, отличающееся тем, что реакционная смесь включает от 2 до 8 моль воды на моль целлюлозы, молекулярная форма статистического димерного звена имеет структуру

где заместитель Х - Н, -SO3, PO(ONa)2 либо RO-PO(ONa)2, где R - целлюлоза, при этом сульфатирование осуществляют в среде N,N-диметилформамида.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к получению водорастворимого сульфата целлюлозы. .
Изобретение относится к химической переработке древесины, в частности к способу сульфатирования микрокристаллической целлюлозы. .

Изобретение относится к способу получения смешанного эфира целлюлозы, содержащего одновременно сульфатные и фосфатные группы. .

Изобретение относится к технологии сложных эфиров целлюлозы, в частности к синтезу водорастворимого сульфата целлюлозы, который может быть использован в нефтедобывающей, горнообогатительной и фармацевтической промышленности.

Изобретение относится к технологии сложных эфиров целлюлозы и может быть использовано при изготовлении стабилизаторов эмульсий и загустителей . .

Изобретение относится к получению водорастворимых сульфатов целлюлозы, применяемых в различных отраслях народного хозяйства в качестве загустителей и различных вспомогательных средств.

Изобретение относится к химической технологии, в частности к способам получения сернокислых эфиров целлюлозы, и может найти применение в производстве клеющих, суспендирующих и эмульгирующих веществ, Изобретение позволяет сократить длительность процесса сульфатирования целлюлозы до 3-10 ч вместо 12-48 ч за счет того, что целлюлозу обрабатьшают натриевой, калиевой, аммониевой или магниевой солью кислоты , где п 1,2, в среде диметил(Ьормамида в присутствии уксусного ангидрида в количестве 0,48-2,83 г на J г целлюлозы.
Изобретение относится к получению водорастворимого сульфата целлюлозы. .
Изобретение относится к химической переработке древесины, в частности к способу сульфатирования микрокристаллической целлюлозы. .
Изобретение относится к химической переработке древесины, в частности к способу сульфатирования микрокристаллической целлюлозы. .

Изобретение относится к способу получения смешанного эфира целлюлозы, содержащего одновременно сульфатные и фосфатные группы. .

Изобретение относится к способу получения смешанного эфира целлюлозы, содержащего одновременно сульфатные и фосфатные группы. .

Изобретение относится к области производства нитратов целлюлозы (НЦ). .
Изобретение относится к технологии получения нитратов целлюлозы, которые могут быть использованы для изготовления детекторов ионизирующих излучений, тест-диагностикумов различных заболеваний, биологических индикаторов, твердого ракетного топлива и других современных видов продукции.

Изобретение относится к технологии изготовления нитратов целлюлозы и может быть использовано при их получении по непрерывной и комбинированной технологиям. .

Изобретение относится к области технологии нитроцеллюлозы (НЦ), конкретно представляет собой технологическую линию производства высококачественной нитроцеллюлозы (НЦ) промышленных марок (например, лаковых коллоксилинов, коллоксилина Н, пироксилина №1 и №2) из целлюлозосодержащего материала, в том числе из хлопкового линта, получаемого при линтеровании семян хлопчатника и льняного волокна.

Изобретение относится к способам стабилизации нитроцеллюлозы. .

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, и может быть использовано для лечения карбункулов кожи. .
Наверх