Иммуностимулирующая комбинация для профилактики и лечения гепатита с

Изобретение относится к области медицины и касается иммуностимулирующей комбинации для профилактики и лечения гепатита С. Сущность изобретения состоит в создании иммностимулирующей комбинации, включающей полиинозиновую-полицитидиловую кислоту [поли (I:С)], действующую в качестве агониста Toll-подобного рецептора TLR3, агониста CD40, полипептида, который включает белок NS3 вируса гепатита С или фрагмент указанного белка, обладающего способностью к индукции CD8+ и CD4+ ответов, а агонист выбран из анти-СD40 антитела, CD40L (природного лиганда CD40) и их фрагменов, которые сохраняют свою способность к связыванию с CD40. Изобретение также включает применение указанной комбинации для приготовления лекарственного средства, фармацевтическую композицию, вакцину, набор для введения комбинации и способ получения иммунного ответа на вирус гепатита С. Преимущество изобретения заключается в повышении эффективности лечения и снижении токсичности. 7 н. и 17 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 ил.

 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к иммуностимулирующей комбинации для профилактики и лечения гепатита С, которая включает белок NS3 вируса гепатита С (ВГС) вместе с адъювантами, выбранными благодаря их способности индуцировать специфические сильные и устойчивые CD8+ и CD4+ ответы против вируса гепатита С.

Уровень техники

Инфекция, вызванная вирусом гепатита С (ВГС), является тяжелым бременем для здравоохранения, поскольку, согласно предположению, по всему миру этим вирусом инфицировано свыше 170 миллионов человек. И в будущем, по-видимому, распространенность этого заболевания будет оставаться неизменной.

Инфекция ВГС отличается тенденцией перехода в большинстве случаев в хроническую форму. Хроническая инфекция ВГС возникает у 70% инфицированных больных, при этом у 20% из них развивается цирроз печени и у 2,5% - рак печени.

В настоящее время рекомендованными способами лечения являются протоколы лечения, основанные на применении интерферона. Однако эти антивирусные терапии являются экономически дорогостоящими, относительно токсичными и эффективными только в случае 50-60% пациентов, получавших лечение. В связи с этим необходимо развитие новых стратегий терапии, которые являются более эффективными и лучше переносимыми пациентами.

Обновленный обзор по ВГС можно найти в Nature, 436, 2005, сс.929-978.

Хотя, к сожалению, все еще нет эффективной вакцины против вируса гепатита С, экспериментальные данные и факты указывают на возможность ее получения. Несмотря на то что в ответ на инфекцию синтезируются антивирусные антитела, хроническое состояние характеризуется отсутствием клеточных иммунных ответов со стороны цитотоксических Т-клеток (CD8+) и хелперных Т-клеток (CD4+). Поэтому предполагается, что у ВГС развиты механизмы, позволяющие ему специфически уклоняться от антивирусных иммунных ответов, где сила и качество ответов цитотоксических и хелперных Т-клеток определяют исход заболевания, произойдет ли выздоравливание пациентов (либо спонтанное, либо в ответ на лечение) или же у них разовьется хроническая инфекция.

Основное назначение какой-либо вакцины заключается в стимулировании антигенспецифического приобретенного иммунитета, посредниками которого являются В- и Т-лимфоциты. В этом контексте антигенпрезентирующие клетки (АПК) играют важную роль в инициации специфических иммунных ответов и, в частности, в активации Т-лимфоцитов. АПК, главным образом дендровидные клетки, захватывают антигены на периферических органах, и после получения стимула к активации они мигрируют к лимфатическим органам. Там дендровидные клетки презентируют на своей поверхности, соединенной с действующими молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), пептидными продуктами, полученными в результате деградации антигенов (эпитопов), и одновременно они продуцируют химокины и цитокины, для того чтобы привлечь и активировать Т-клетки. Процесс активации дендрических клеток, также называемый созреванием, отличается высокой экспрессией молекул ГКГС (сигнал 1), костимулирующих молекул (сигнал 2) и поляризующих цитокинов, например интерлейкина-12 (IL-12) (сигнал 3). Созревание индуцируется, например, патогенными компонентами или молекулами хозяина, которые часто встречаются при воспалительных процессах и процессах разрушения клеток. Эти факторы действуют на дендровидные клетки через специфические рецепторы для продуктов, получаемых из микроорганизмов, например рецепторы Toll-подобного типа (TLR), рецепторы для цитокинов (TNF-α, IL-1, IFN-α) или рецепторы для лигандов на поверхности клеток (например, CD40).

Стимуляция и активация различных популяций Т-клеток посредством АПК ограничивается, с одной стороны, типом молекул ГКГС и, с другой стороны, особенностями эпитопов, которые образуют комплексы с этими молекулами ГКГС. Так, например, идентифицированы определенные фрагменты вирусных белков, которые специфически индуцируют активацию цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов (ЦТЛ), известных в качестве эпитопов лимфоцитов, или CD8+ Т-клеток, или CD8+эпитопов, или эпитопы, которые специфически индуцируют активацию CD4+хелперных Т-лимфоцитов (ХТЛ), CD4+ эпитопы. База данных «HCV Immunology Database» (http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html) представляет эпитопы для обоих типов Т-лимфоцитов, и CD8+ ЦТЛ, и CD4+ ХТЛ, идентифицированные на основе вирусных белков различных штаммов и изолятов вируса гепатита С.

Для разработки протоколов иммунизации, основанных на применении эпитопов в форме пептидов, соответственно требуется предварительный отбор пептидов, пригодных для каждого индивидуума, в зависимости от молекул ГКГС, которые они представляют. Это означает, что в зависимости от ГКГС каждого индивидуума необходимо подбирать особую комбинацию пептидов, которые были бы способны проявлять себя в качестве эпитопов в данном контексте. Применение крупных антигенов позволяет преодолеть эту проблему, поскольку они обычно являются полиэпитопными и в пределах своей последовательности представляют различные эпитопы и для CD8+ ЦТЛ, и для CD4+ ХТЛ, которые могут быть представлены молекулами ГКГС различных индивидуумов. Таким образом, можно использовать единственный антиген в качестве вакцины для индивидуумов с различным ГКГС.

Среди различных белков ВГС наиболее иммуногенными являются капсидный белок и белок NS3, а у тех индивидуумов, которые преодолевают инфекцию, против них выявляются сильные CD8+ ЦТЛ и CD4+ ХТЛ ответы. Тем не менее, существуют данные, которые показывают, что капсидный белок также может обладать опасным действием на клетки иммунной системы при контакте с ними, которое делает его непригодным в качестве антигена в стратегиях вакцинации. С другой стороны, NS3 является белком, который почти не проявляет этого типа действия и может быть перспективным в качестве антигена для индукции CD8+ ЦТЛ и CD4+ ХТЛ ответов.

В этом направлении исследований WO 2002/014362 А2 описывает применение белка NS3 ВГС в качестве антигена при получении вакцин для профилактики и лечения инфекции ВГС. Белку NS3 может сопутствовать адъювант рибавирин, который может находиться в той же самой фармацевтической композиции или в другой композиции. Кроме того, адъювант можно вводить одновременно с введением антигена или в разное время. Этот документ, однако, не показывает, что рибавирин усиливает CD8+ иммунный ответ против NS3.

CD4+ ХТЛ участвуют в приобретенном иммунитете наряду с другими механизмами посредством активации АПК, активации ЦТЛ и индукции памяти. В частности, описано, что CD4+ клетки, специфические для ВГС, необходимы для поддержания антивирусных ЦТЛ (A.Grakoui и др., Science, 302, 2003, сс.659-662). Следовательно, эффективная вакцина против вируса гепатита С должна обеспечить максимальную возможность в индукции не только CD8+ ЦТЛ ответов, но также CD4+ ХТЛ ответов. Такая вакцина поэтому требует отбора специфических антигенов, которые смогут обеспечить такие ответы.

Тем не менее, не очевидно, что комбинация антигенов сама по себе может быть способна предоставить эффективную вакцину против ВГС. Исходя из того что созревание дендровидных клеток является необходимым условием для эффективной инициации и активации Т-лимфоцитов, для улучшения такой вакцины было бы полезно включить в иммуностимулирующую комбинацию некоторые адъюванты, которые могли бы стимулировать созревание дендровидных клеток. В качестве адъювантов возможно применение лигандов рецепторов TLR, рецепторов цитокинов, или рецепторов для межклеточных лигандов, которые указывались выше, или, что еще лучше, синергетической комбинации таких адъювантов.

Так, например, Rouas и др. в International immunology, 16, 2004, сс.767-773, описывают применение in vitro CD40L, IFN-γ и полиинозиновой-полицитидиловой кислоты [поли(I:С)], синтетического лиганда TLR3 в фармацевтической композиции, вызывающей созревание дендровидных клеток. Показано, что дендровидные клетки, созревающие с применением поли(I:С), являются единственными, которые секретируют IL-12p70 после стимуляции с применением CD40L, что не происходит после созревания с применением IFN-γ. Также описано созревание дендровидных клеток, когда их инкубируют и CD40L, и с IFN-γ. Зрелые дендровидные клетки очень важны в иммунном ответе, поскольку IL-12, который они секретируют, активирует и Th1-лимфоциты, и цитотоксические Т-лимфоциты.

Более того, в US2004/0141950 описываются иммуностимулирующие комбинации, включающие антагонист TLR и антагонист молекул суперсемейств фактора некроза опухоли (TNF) IL или его рецепторов (TNFP), которые также могут включать антиген. Среди многочисленных возможных комбинаций представляется комбинация лиганда CD40 (анти-CD40 антитело) и поли(I:С), комбинация, для которой показан синергетический эффект в отношении увеличения количества CD8+ Т-лимфоцитов. Кроме того, Ahonen и др. в J. Ехр. Med., 199, 2004, сс.775-784, представляют данные по синергетической способности агонистов TLR/CD40 индуцировать увеличение и дифференциацию антиген-специфических CD8+ ЦТЛ способом, который не зависит от CD4+ Т-лимфоцитов. Хотя эти работы описывают способность TLR/CD40 активировать CD8+ Т-лимфоциты антиген-специфической памяти, указанные работы не позволяют установить, может ли комбинация агонистов TLR/CD40 также усиливать CD4+ ХТЛ ответы.

При инфицировании ВГС установлены явные различия в CD4+ ХТЛ ответах при сравнении инфицированных пациентов с пациентами, которые были способны элиминировать инфекцию. Тем не менее, хотя и с меньшей интенсивностью, чем в случае излеченных пациентов, у инфицированных пациентов все же обнаруживаются CD8+ ЦТЛ ответы. Поэтому хотя ЦТЛ являются важной популяцией эффекторов при устранении инфекции ВГС, CD4+ клетки также играют важную роль в контролировании заболевания. Более того, описано, что индукция CD4+ Т-лимфоцитов важна для поддержания антивирусных ЦТЛ ответов (Grakoui А. и др., Science, 302, 2003, сс.659-662). Эти данные означают, что для вакцинации и терапии вирусных заболеваний, вызванных ВГС, важна индукция сильных и устойчивых и

CD8+, и CD4+ противовирусных ответов.

Поэтому объектом настоящего изобретения является выбор иммуностимулирующих комбинаций антигенов и адъювантов, пригодных для профилактики и лечения гепатита С, которые обеспечат стимуляцию более сильных полных и устойчивых и CD8+, и CD4+ ответов.

Подробное описание настоящего изобретения

Первый объект настоящего изобретения относится к иммуностимулирующей комбинации для профилактики и лечения гепатита С, которая в настоящем изобретении является объектом изобретения и называется «иммуностимулирующей комбинацией настоящего изобретения», которая включает агонист TLR3, агонист CD40 или последовательность ДНК, которая его кодирует, и полипептид, который включает белок NS3 вируса гепатита С или фрагмент указанного белка NS3, обладающий способностью к индукции CD8+ и CD4+ ответов.

Понятие «агонист TLR3» относится к лиганду, который может соединяться или связываться с рецепторами TLR3 («Toll-подобный рецептор 3») и вызывать клеточный ответ. TLR3 является рецептором двухцепочечной РНК, которая передает сигналы, активирующие NF-kB и продукцию интерферонов (IFN) I типа (IFN-α и IFN-β), и которая стимулирует созревание дендровидных клеток. У мышей, у которых отсутствовала экспрессия TLR3, снижена ответная реакция на поли(I:С) - лиганд TLR3, подобный двухцепочечной РНК, образующейся в течение репликации вируса типа ВГС-, вместе с устойчивостью к летальному действию поли(I:С) при их сенсибилизации D-галактозамином и редукция образования воспалительных цитокинов (Alexopoulou и др., Nature, 413, 2001, сс.732-738). В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанный лиганд TLR3 может представлять вирусную двухцепочечную РНК или двойную цепь полиинозиновой-полицитидиловой кислоты, поли(I:С).

«Агонист CD40» относится к лиганду, который может соединяться или связываться с рецепторами CD40, также индуцируя клеточный ответ. CD40 является молекулой, экспрессированной в мембране различных типов клеток, например В-лимфоцитов или антиген-презентирующих клеток (макрофагов, дендровидных клеток и т.д.). Природный лиганд CD40 (CD40L или CD154) в основном экспрессируется в Т-лимфоцитах, которые активируются после распознавания антигена. Взаимодействие CD40L с CD40, присутствующим в антигенпрезентирующей клетке, индуцирует созревание этой клетки. Этот феномен, в определенной степени подобный стимулу, исходящему от патогена, увеличивает способность антигенпрезентирующей клетки к индукции иммунных ответов. Поэтому агонист CD40 иммуностимулирующей композиции настоящего изобретения относится, с одной стороны, к лиганду CD40L или фрагменту такого CD40L, который сохраняет способность к связыванию с CD40 и индукции клеточного или иммунного ответа. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения лиганд может быть специфическим антителом к CD40 (анти-CD40) или его фрагментом, который сохраняет способность к связыванию с CD40. Кроме того, лиганд CD40 или его фрагмент может присутствовать в иммуностимулирующей комбинации либо в форме белка, либо также в качестве рекомбинантной нуклеиновой кислоты (ДНК), которая кодирует этот лиганд, например, в вирусном векторе для трансферной или генной терапии.

Понятие «антиген» относится к какому-либо веществу, которое способно индуцировать иммунный ответ, и гуморальный, и клеточный, в организме индивидуума (человека или животного) или которое может индуцировать клеточный иммунный ответ (увеличение количества, активирование и/или созревание иммунных клеток, образование цитокинов или антител) при его контакте с иммунными клетками. В частности, антиген может являться вирусным белком, пептидом или фрагментом указанного вирусного белка, рекомбинантным белком таких вирусных белков и даже синтетическим пептидом, способным индуцировать сигнальные ответы.

Понятие «CD8+ индуцирующий эпитоп» относится к фрагменту или части полипептидной цепи антигена, способным к специфической индукции активации CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ). Понятие «CD4+ индуцирующий эпитоп» относится к фрагменту или части полипептидной цепи антигена, способным к специфической индукции активации CD4+ хелперных Т-лимфоцитов (ХТЛ).

«Белок NS3» относится к неструктурному белку NS3 вируса гепатита С с молекулярной массой 67 кДа, который включает 2 домена, серин-протеиназу, охватывающую 189 аминокислот с N-конца, и домен с геликазной-нуклеозидтрифосфатазной активностью, охватывающий 442 аминокислоты с С-конца. Последовательность белка NS3, включенная в полипептид иммуностимулирующей комбинации настоящего изобретения, может соответствовать какому-либо штамму или изоляту вируса гепатита С, в частности какому-либо штамму или изоляту вируса гепатита С человека. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения полипептид, включающий белок NS3, получают путем рекомбинантной технологии. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, который не ограничивает его, применяют рекомбинантный белок NS3 с последовательностью SEQ. ID. NO:1 (соответствующей номерам доступа в банке генов GeneBank DQ068198.1 и AAY84763.1, VRL 28-NOV-2005). В изобретении также применялась другая последовательность рекомбинантного белка SEQ. ID. NO:2 (соответствующая номеру доступа в банке генов GeneBank D90208).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения также можно применять полипептид, включающий фрагмент белка NS3, при условии, что указанный фрагмент способен к индукции CD4+ и CD8+ ответов. Поэтому указанный фрагмент должен включать по меньшей мере один CD8+ индуцирующий эпитоп и один CD4+ индуцирующий эпитоп.

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая комбинация согласно настоящему изобретению включает поли(I:С), анти-CD40 антитело и полипептид, содержащий белок NS3.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения иммуностимулирующая комбинация обладает всеми компонентами, образующими часть одной и тоже фармацевтической композиции, где каждый из компонентов присутствует в фармацевтически приемлемых количествах. Кроме того, изобретение также относится к указанной фармацевтической композиции.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения установлено, что компоненты иммуностимулирующей комбинации составляют части по меньшей мере двух фармацевтических композиций. Более того, настоящее изобретение относится к применению указанной иммуностимулирующей комбинации, отличающемуся тем, что указанные фармацевтические композиции вводят одновременно. В другом варианте осуществления настоящего изобретения применение указанной иммуностимулирующей комбинации отличается тем, что указанные фармацевтические композиции вводят в разное время одним и тем же способом введения или разными способами. В связи с этим один конкретный вариант осуществления настоящего изобретения относится к набору для введения в организм вышеуказанной иммуностимулирующей комбинации, отличающемуся тем, что он включает по меньшей мере две различные фармацевтические композиции.

Другой объект настоящего изобретения относится к способу получения иммунного ответа к вирусу гепатита С, отличающемуся тем, что он заключается во введении указанной выше стимулирующей комбинации в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ по настоящему изобретению заключается в профилактическом лечении. В более предпочтительном варианте осуществления изобретения способ по настоящему изобретению заключается в терапевтическом лечении.

Кроме вышеперечисленного настоящее изобретение также относится к вакцине против вируса гепатита С, отличающейся тем, что она включает иммуностимулирующую комбинацию, указанную выше и составляющую объект настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

Фиг.1. Иммунизация с применением анти-CD40-антитела, поли(I:С) вместе с белком NS3 вызывает мультиэпитопные CD4+ и CD8+ Т-ответы. Мышам линии HHD (две мыши на группу) вводили по 50 мкг анти-СD40 (внутрибрюшинно). Спустя 4 ч им вводили по 50 г поли(I:С) (внутривенно) и по 500 г рекомбинантного белка NS3 (внутрибрюшинно) (SEQ. ID. NO:1). Спустя шесть суток животных забивали и выделяли спленоциты для проведения их стимуляции in vitro различными антигенами и анализа индуцированного иммунного ответа. (А) Клетки стимулировали в течение 5 суток эпитопами CD8+ 1073, 1406 или 1038 (10 мкМ) в присутствии IL-2. После этого для каждой группы спленоцитов проводили оценку литического ответа на клетки-мишени, нагруженные (пептид, черные столбцы) или ненагруженные (контроль, белые столбцы) соответствующими пептидами. Полученные результаты показаны при отношении эффектор:мишень, 100:1. (Б) Таким же способом спленоциты культивировали с различными концентрациями (0,1-10 мкМ) пептидов 1073 (черные кружки), 1406 (белые треугольники) или 1038 (черные треугольники), а в культуральных супернатантах, полученных после 48 ч стимуляции, посредством ИФА определяли содержание IFN-γ. (В) Спленоциты также стимулировали в течение 48 ч путем применения 5 или 1 мкг/мл белка NS3, использованного в иммунизации (SEQ. ID. NO:1), 1 мкг/мл белка NS3, образованного бактериями (SEQ. ID. NO:3), или культуральной средой (контроль) для оценки CD4+ ответа. По истечении этого времени супернатанты собирали и посредством ИФА (ELISA) проводили оценку количества образованного IFN-γ.

Фиг.2. Оценка количества белка NS3, необходимого для индукции CD4+ и CD8+ Т-ответов в иммунизации с применением поли(I:С) и анти-CD40. Мышей линии HHD (две на группу) иммунизировали белком NS3 (SEQ. ID. NO:1) (500, 250, 125 или 25 мкг/мышь) вместе с поли(I:С) и анти-CD40, следуя протоколу, описанному на фиг.1. Также анализировали контрольную группу, иммунизированную тем же способом, в котором использовали в качестве антигенов 5 мкг NS3 (SEQ. ID. NO:1) и 50 мкг пептидов 1073 и 1038 наряду с поли(I:С) и анти-CD40. Спустя шесть суток животных забивали и проводили выделение и стимуляцию спленоцитов различными антигенами (А). Для оценки индуцированного литического ответа клетки стимулировали в течение 5 суток эпитопом CD8+ 1073 (10 мкМ) и IL-2. Затем этот ответ оценивали путем конфронтации различных количеств эффекторных клеток против фиксированного количества клеток-мишеней, нагруженных пептидами. Кроме того, также проводили анализ полученного CD8+ ответа посредством оценки образования IFN-γ. Для этого клетки стимулировали различными концентрациями пептидов 1073 (Б) и 1038 (В). Клетки также стимулировали белком NS3 (SEQ. ID. NO:1) (Г), чтобы оценить CD4+ ответ. После 48 ч проводили оценку содержащегося в супернатантах количества IFN-γ.

Фиг.3. Иммунизация с применением поли(I:С) и анти-CD40 вместе с белком NS3 индуцирует CD4+ и CD8+ ответы в других линиях мышей с другим ГКГС. Мыши линии C57BL6 (которые имеют молекулы ГКГС типа Н-2b) (две мыши на группу) получали одну (белые квадраты) или две (черные квадраты) иммунизации 100 мкг белка NS3 (SEQ. ID. NO:1) вместе с поли(I:С) и анти-CD40, следуя протоколу, указанному на фиг.1. Спустя шесть суток животных забивали и спленоциты культивировали с различными антигенами для оценки CD8+ и CD4+ ответов. Для стимуляции спленоцитов и оценки CD8+ ответов применяли рестриктированный эпитоп Н-2 Db 1629-1637 (GAVQNEVTL) (SEQ. ID. NO:7) (А). Белок NS3 (SEQ. ID. NO:1) (Б) применяли в качестве стимула для определения CD4+ ответа. После двух суток культивирования супернатанты собирали и оценивали количество образованного IFN-γ.

Фиг.4. Иммунизация белком NS3 вместе с поли(I:С) и анти-CD40 индуцирует CD8+ ответы, способные к распознаванию клеток, которые экспрессируют белки ВГС. (А) Мышам линии HHD (две на группу) вводили по 100 мкг белка NS3 (SEQ. ID. NO:2) вместе с поли(I:С) и анти-CD40 согласно указанию на фиг.1. Спустя шесть суток животных забивали и спленоциты стимулировали клетками T1/HCVcon (Т1-клетки, подвергшиеся трансфекции плазмидой, которая экспрессирует белки ВГС), обработанными митомицином, в присутствии IL-2. После 5 суток стимуляции оценивали способность спленоцитов распознавать клетки T1/HCV в анализах литической активности. Для этого различные количества спленоцитов подвергали конфронтации с фиксированным количеством клеток T1/HCVcon (черные кружки) или контрольных Т1-клеток, не подвергнутых трансфекции (белые кружки).

Фиг.5. Иммунизация с применением поли(I:С) и анти-CD40 вместе с белком NS3 индуцирует устойчивые CD4+ и CD8+ ответы. Мышам линии HHD (две на группу) вводили по 100 мг белка NS3 (SEQ. ID. NO:2) вместе с поли(I:С) и анти-CD40, согласно указанию на фиг.1. Спустя две недели животным проводили вторую иммунизацию при тех же самых условиях. Спустя шестьдесят суток после второй иммунизации животных забивали и проводили выделение спленоцитов для исследования устойчивых CD8+ и CD4+ Т-ответов. (А) Спленоциты стимулировали эпитопом CD8+ 1073 (10 мкМ) или в отсутствие антигена и спустя 48 ч культуральные супернатанты собирали для оценки образованного количества IFN-γ. (Б) Спленоциты культивировали в течение 5 суток с пептидом 1073 (10 мкМ) и IL-2 и затем исследовали их способность лизировать клетки-мишени, нагруженные пептидом 1073. Для этого различные количества клеток-эффекторов подвергали конфронтации с фиксированным количеством клеток-мишеней, нагруженных пептидом 1073 (черные кружки) или ненагруженных пептидом (белые кружки). (В) CD4+ ответ исследовали посредством стимуляции спленоцитов белком NS3 (1 мкг/мл) (SEQ. ID. NO:2) или в отсутствие антигена. Спустя 48 ч супернатанты собирали и оценивали количество образованного IFN-γ.

Способ осуществления настоящего изобретения

Следующие примеры, никоим образом не ограничивающие изобретение иллюстрации варианта осуществления настоящего изобретения.

Соответствующие материалы и методы

Эпитопы, антигены и реагенты

Использованные пептиды или эпитопы синтезируют вручную в полипептидном синтезаторе, используя Fmoc chemistry (D.A.Wellings и Е. Atherton, Methods Enzymol, 289, 1997, сс.44-67). Для контролирования каждого шага применяют нингидриновый тест Кайзера. В конце синтеза их соединяют и снимают защиту с использованием трифторуксусной кислоты и промывают диэтиловым эфиром. Чистота пептидов всегда превышала 90% на основании определения ВЭЖХ.

Синтезированные и использованные в примерах пептиды и эпитопы
Пептид или эпитоп	Последовательность
1038-1047	GLLGCIITSL; SEQ. ID. NO:4
1073-1081	CVNGVCWTV; SEQ. ID. NO:5
1406-1415	KLVALGINAV; SEQ. ID. NO:6
1629-1637	GAVQNEVTL; SEQ. ID. NO:7

Нумерация пептида или эпитопа относится к его положению относительно штамма Н ВГС, при этом в качестве контроля берут полную последовательность штамма Н гепатита С человека, который обычно используют в качестве прототипа (номер доступа в GeneBank M67463). Так, например, база данных «HCV Immunology Database» (http://hcv.lanl.gov/content/immuno/immuno-main.html) представляет эпитопы для обоих типов Т-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов и хелперных Т-лимфоцитов, идентифицированных в вирусных белках различных штаммов и изолятов вируса гепатита С, все из которых также упорядочены в соответствии с их относительным положением относительно штамма Н вируса согласно установленному реперу банка генов GeneBank.

В качестве иммуногена используют рекомбинантный пептид из 655 аминокислот, который содержит полную последовательность белка NS3 (SEQ. ID. NO:1, номер доступа AAY84763.1, VRL 28-NOV-2005, 631 аминокислота). Помимо 631 аминокислоты белка NS3 полипептид также включает хвост с последовательностью с-myc для определения с анти-myc моноклональным антителом и хвост из остатков гистидина. Белок получают из дрожжей Pichia pastoris. Его хранят в виде суспензии в растворе Трис 22,5 мМ / мочевина 3,76 М / NaCl 300 мМ. Очистку белка проводят посредством Ni-колоночной хроматографии.

В качестве иммуногена используют также другой рекомбинантный пептид, который содержит 635 аминокислот, включающих полную последовательность белка NS3 (SEQ. ID. NO:2, номер в каталоге D90208). Помимо аминокислот, соответствующих белку NS3, полипротеин также включает хвост из остатков гистидина для его очистки. Последовательность ДНК, соответствующую белку NS3, получают путем расщепления рестриктазами Sal I и Not I плазмиды gWIZ, содержащей последовательность NS3 (предоставленную доктором G. Inchauspe, Лион, Франция). Продукт расщепления клонируют между сайтами BsrG I и Not I плазмиды рЕТ-45 (+) (фирма Novagen, Мэдисон, штат Висконсин). Его экспрессируют с использованием Е. coli и чистят посредством аффинной хроматографии в никелевой колонке с последующей ионообменной хроматографией.

Также для анализов in vitro в качестве антигена используют рекомбинантный полипептид (фирма Mikrogen, номер в каталоге 94302), который содержит последние 20 аминокислот неструктурного белка NS2 и первые 508 аминокислот белка NS3 ВГС (SEQ. ID. NO:3).

В качестве агониста TLR3 используют поли(I:С), полученный из фирмы Amersham (номер в каталоге 27-4732-01).

В качестве агониста CD40 используют анти-СD40-антитела, изначально очищенные от гибридомы FGK-45 (A. Rolink и др., Immunity, 5, 1996, сс.319-330).

Все реагенты содержали <1 единицы эндотоксина на мг продукта, что было установлено посредством анализа с лизатом QCL-1000 амебоцитов мечехвоста (фирма Bio Whittaker).

Мыши

Шести-восьминедельных мышей линии С57В1/6 получают из фирмы Harlan. Также используют мышей линии HHD, трансгенных по молекулам человека HLA-A2.1 (S. Pascolo и др., J. Exp. Med., 185, 1997, сс.2043-2051). Всех животных содержат в условиях отсутствия патогенов и обрабатывают в соответствии с правилами института.

Клеточные линии

В качестве клеток-мишеней в тестах с высвобождением хрома для определения активности цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), получаемых от мышей линии HHD, используют клетки Т2 (R. Salter и др., Immunogenetics, 21, 1985, сс.235-246).

Для анализов распознавания клеток, которые экспрессируют белки ВГС, используют клетки Т1, подвергнутые трансфекции плазмидой - носителем кодирующей области ВГС (клетки T1/HCVcon). Эти клетки были предоставлены доктором D. Moradpour (Фрейбург, Германия; В. Volk и др., J Gen Virol, 86, 2005, сс.1737-1746). В качестве контроля также используют клетки Т1, не подвергавшиеся трансфекции (АТСС, номер в каталоге CRL-1991).

Все клетки выращивают в полноценной среде (RPMI 1640, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ глутамина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола). Культура клеток линии T1/HCVcon также содержала 2 мг/мл G418 (фирма Gibco).

Иммунизация

Группы из двух мышей иммунизируют путем внутрибрюшинного введения 50 мкг анти-CD40. Спустя 4 ч им вводят 50 мкг поли(I:С) (внутривенно) и различные количества антигенов: белка NS3 или смеси NS3 с пептидами (внутрибрюшинно).

Стимуляция селезеночных клеток для выработки цитокинов

Клетки селезенки ресуспендируют в полноценной среде и вносят при плотности 8×10⁵ клеток/лунку в 0,2 мл в 96-луночные планшеты с U-образным дном в отсутствие или в присутствии пептидов или рекомбинантного белка NS3 ВГС.

Спустя двое суток супернатанты собирают для оценки присутствия IFN-γ посредством ИФА (фирма BD-Pharmigen), следуя инструкциям производителя.

Оценка литической активности ЦТЛ

Для оценки ответов ЦТЛ спленоциты, полученные от иммунизированных животных, инкубируют с пептидами (10 мкмолей) в течение 2 ч при 37°С, дважды промывают и культивируют в 24-луночных планшетах до скопления 5×10⁶ клеток/лунку. В экспериментах по оценке распознавания клеток линии T1/HCVcon 7,5×10⁶ спленоцитов мышей HHD культивируют с 7,5×10⁵ клеток линии T1/HCVcon, предварительно обработанных митомицином С (фирма Sigma). Во всех случаях спустя 2-е суток в лунки добавляют 2,5 Ед/мл IL-2 (фирма Boehringer-Mannheim GmbH, Германия) и спустя 5 суток клетки выделяют для проведения анализов, основанных на высвобождении хрома.

Литическую активность оценивают путем инкубирования различных количеств эффекторных клеток в течение 4 ч с 3000 клеток-мишеней Т2, предварительно нагруженных ⁵¹Cr, c или без пептида (мишень). В случае клеток, стимулируемых T1/HCVcon, эффекторные клетки противопоставляют клеткам T1/HCVcon или Т1, предварительно нагруженным ⁵¹Cr. Культуральные супернатанты собирают после 4 ч инкубации.

Процент специфического лизиза рассчитывают по формуле: (cpm в эксперименте - cpm спонтанное) / (cpm максимальное - cpm спонтанное) ×100, где спонтанный лизис (оцениваемый в качестве cpm спонтанное) соответствует клеткам-мишеням, инкубируемым в отсутствие эффекторных клеток, и максимальный лизис (cpm максимальное) получают путем инкубации клеток-мишеней в 5% Тритоне х-100.

Пример 1

Иммунизация посредством анти-CD40 и поли(I:С) вместе с белком NS3 индуцирует мультиэпитопные CD4+ и CD8+ Т-ответы.

Установлено, что иммунизация с помощью анти-СВ40 и поли(I:С) сама по себе очень эффективна для индукции CD8+ ответов посредством использования в качестве иммуногенов синтетических пептидов, которые представляют эпитопы CD8+ клеток. Хотя эта стратегия индуцирует сильные ответы, показано, что если проводится совместная иммунизация с использованием малых количеств белка NS3 (5 мкг/мышь), которая индуцирует CD4+ ответ, происходит усиление CD8+ ответа, а также увеличивается CD8+ ответ с высокой аффинностью, другими словами, такой ответ, который распознает низкие концентрации антигена. Более того, иммунизация пептидами эффективна только у тех индивидуумов, которые обладают молекулами HLA той же самой рестрикции, что и выбранные эпитопы. С целью попытки решения этих двух вопросов проводят исследование, способна ли иммунизация с применением более высоких количеств рекомбинантного белка NS3 к индукции ответов не только CD4+ , но также CD8+. Для этого мышей иммунизируют NS3 вместе с поли(I:С) и анти-CD40 и исследуют индуцируемые ответы. Мышам линии HHD (две мыши на группу) вводят внутрибрюшинно по 50 мкг анти-CD40. Спустя четыре часа им вводят по 50 мкг поли(I:С) (внутривенно) и по 500 мкг рекомбинантного белка NS3 (внутрибрюшинно) (SEQ. ID. NO:1). По истечении шести суток животных забивают и выделяют спленоциты. С целью анализа способности NS3, в сочетании с поли(I:С) и анти-CD40 в качестве адъювантов, индуцировать CD4+ и CD8+ Т-ответы спленоциты стимулируют in vitro различными антигенами, которые специфически активируют эти клеточные популяции. (А) Чтобы проанализировать CD8+ ответ в первом эксперименте спленоциты стимулируют в течение 5 суток эпитопами CD8+ 1073, 1406 или 1038 в присутствии IL-2. После этого для каждой группы клеток, стимулированной пептидом, оценивают их способность вызывать лизис клеток-мишеней, которые нагружены соответствующим пептидом (черные столбцы) или контрольных клеток-мишеней без пептида (белые столбцы). Фиг.1, А показывает результаты, полученные при соотношении эффектор:мишень 100:1. (Б) Ответ CD8+, индуцируемый после иммунизации с применением NS3, также анализируют посредством исследования продукции IFN-γ по отношению к тем же эпитопам CD8+. Для этого спленоциты культивируют с различными количествами 1073 (черные кружки), 1406 (белые треугольники) или 1038 (черные треугольники). После 48 ч культивирования супернатанты собирают и оценивают содержание IFN-γ. (В) С целью анализа индуцированного CD4+ ответа спленоциты стимулируют белком NS3, использованным в иммунизации (SEQ. ID. NO:1). Кроме того, клетки стимулируют коммерческим белком NS3, образуемым бактериями (SEQ. ID. NO:3). Таким же образом, что и в предшествующем пункте, степень активации оценивают посредством продукции IFN-γ.

Во-первых, можно отметить, что этот антиген способен к индукции CD8+ ответов, которые можно обнаружить в обоих анализах, и в оценке с высвобождением хрома (фиг.1, А), и посредством индукции образования IFN-γ (фиг.1, Б). Кроме того, этот ответ является мультиэпитопным, направленным по отношению к различным эпитопам CD8+, которые были описаны в последовательности NS3 (например, пептиды 1073, 1406 и 1038). Кроме того, подтверждено, что он способен к индукции CD4+ ответов, которые распознают NS3, используемый в иммунизации, и коммерческий белок NS3, получаемый в бактериях (фиг.1, В). Ответ по отношению к последнему был ниже, предположительно, благодаря тому факту, что в последовательности обоих белков существуют некоторые изменения и что белок, экспрессируемый в бактериях, был короче, в связи с чем он мог утратить некоторые эпитопы, распознаваемые CD4+ Т-лимфоцитами.

Пример 2

Введение 25 мкг рекомбинантного белка NS3 вместе с поли(I:С) и анти-CD40 достаточно для индукции CD4+ и CD8+ Т-ответов.

Из предварительных экспериментов известно, что при использовании 5 мкг NS3 индуцируются CD4+ ответы, но не индуцируются CD8+ ответы, поэтому желательно выявление минимального количества NS3, которое было бы достаточно для индукции CD8+ ответов. Для этого мышей линии HHD иммунизируют 500, 250, 125 и 25 мкг NS3 (SEQ. ID. NO:1). Также в качестве контроля включают группу, которую иммунизируют пептидами, соответствующими CD8+ эпитопам, которые могли бы индуцировать CD8+ ответы, плюс 5 мкг NS3 (SEQ. ID. NO:1), который мог бы индуцировать CD4+ ответ. Для этого в каждой группе животных, иммунизированных дозой NS3, проводят анализ CD8+ ответа и CD4+ ответа. CD8+ ответ анализируют в виде способности лизировать клетки-мишени, нагруженные эпитопом CD8+ 1073 (фиг.2, А), вместе со способностью продуцировать IFN-γ относительно различных концентраций эпитопов CD8+ 1073 (фиг.2, Б) и 1038 (фиг.2, В). CD4+ ответы оценивают посредством способности продуцировать IFN-γ относительно различных концентраций NS3 (SEQ. ID. NO:1) (фиг.2, Г). Этот эксперимент показывает, что все анализируемые количества NS3 способны индуцировать CD8+ ответы, при этом при исследовании литических ответов к пептиду 1073 (фиг.2, А) доза 25 мкг индуцирует наиболее слабые ответы. Кроме того, все дозы способны индуцировать образование IFN-γ относительно эпитопов 1073 (фиг.2, Б) и 1038 (фиг.2, В), что указывает на то, что способность к индукции мультиэпитопных ответов сохраняется даже при снижении доз. Кроме того, подтвердилось предположение, что все они индуцируют CD4+ ответы. Исходя из того что в большинстве случаев индуцированный ответ был слабее при использовании 25 мкг NS3, для последующих экспериментов выбрана доза 100 мкг/мышь, начиная с которой не наблюдается повышения индукции ответов.

Пример 3

Иммунизация посредством поли(I:С) и анти-CD40 вместе с белком NS3 индуцирует CD4+ и CD8+ ответы в других линиях мышей с иным ГКГС.

Исходя из того что в таком крупном антигене, как белок NS3, можно найти CD4+ и CD8+ эпитопы, которые могут быть представлены другими молекулами ГКГС, способность этого протокола иммунизации к индукции CD4+ и CD8+ ответов исследуют на другой линии мышей с другими молекулами ГКГС. Для этого мышей С57/В16, имеющих Н-2b-рестриктированные молекулы ГКГС, иммунизируют посредством 100 мкг NS3 (SEQ. ID. NO:1). С целью улучшения ответов одна группа получает одну иммунизацию, а другая группа получает повторную иммунизацию. Во-первых, оценивают CD8+ ответ по образованию IFN-γ против пептида 1629-1637 (SEQ. ID. NO:7), который содержит CD8+ эпитоп, представленный молекулами ГКГС класса I H-2 Db. На фиг.3, А видно, что различимый ответ индуцируется в обеих группах мышей, хотя уровни значительно выше в группе, которая получает две иммунизации (черные квадраты), чем в первой группе, которая получает одну иммунизацию (белые квадраты). Также в двух группах (фиг.2, Б) определяют CD4+ ответ, оцениваемый по образованию IFN-γ против рекомбинантного белка NS3 (SEQ. ID. NO:1), и снова показано, что две иммунизации (черные квадраты) индуцируют более сильные ответы по сравнению с одной иммунизацией (белые квадраты).

Пример 4

Иммунизация белком NS3 вместе с поли(I:С) и анти-CD40 индуцирует CD8+ ответ, способный к распознаванию клеток, которые экспрессируют белки ВГС.

Для того чтобы исследовать, способна ли иммунизация с использованием белка NS3 вместе с поли(I:С) и анти-СD40 к индукции ответов, которые потенциально могли бы убивать клетки, инфицированные ВГС, в качестве модели in vitro используют клетки-мишени, подвергнутые трансфекции плазмидой, которая экспрессирует белки ВГС (T1/HCVcon). Эти клетки экспрессируют те же пептиды в своих молекулах ГКГС класса I, которые могут экспрессироваться клеткой, инфицированной ВГС, поэтому какой-либо определенный ответ против них можно расценивать в качестве ответа против последней. Белок NS3 (SEQ. ID. NO:1), использованный в экспериментах, представленных на фиг.1-3, соответствует штамму вируса, отличному от вирусного штамма, присутствующего в клетках T1/HCVcon. Эти два штамма показывают некоторые отличия в CD8+ эпитопах, исследованных до сих пор. С целью оптимизации распознающей способности CD8+ эпитопов, присутствующих в клетках T1/HCVcon, для этого эксперимента в качестве иммуногена используют белок NS3 (SEQ. ID. NO:2), последовательность которого имеет степень гомологии, большую, чем белок, присутствующий в клетках T1/HCVcon. Спустя шесть суток после иммунизации мышей линии HHD введением 100 мкг NS3 спленоциты стимулируют с использованием клеток T1/HCVcon. Распознающую способность клеток T1/HCVcon анализируют в исследованиях литической активности. Для этого стимулированные спленоциты подвергают конфронтации с клетками T1/HCVcon и контрольными Т1-клетками. На фиг.4 показано, что иммунизация с использованием NS3 индуцирует ответы с большей способностью к лизису клеток Т1, которые экспрессируют белки ВГС (черные кружки), чем контрольные клетки Т1 (белые кружки).

Пример 5

Иммунизация посредством поли(I:С) и анти-CD40 вместе с белком NS3 индуцирует устойчивые CD4+ и CD8+ Т-ответы.

Одной из основных особенностей, которой должен обладать протокол вакцинации, является способность индуцировать устойчивые иммунные ответы, с тем чтобы защита, предоставляемая иммунизацией, могла сохраняться длительное время. Чтобы исследовать, способна ли иммунизация с использованием поли(I:С) и анти-CD40 вместе с белком NS3 индуцировать такого рода ответ, мышей линии HHD иммунизируют 100 мкг белка NS3 в соответствии с протоколом, описанным в примере 1. С целью усиления ответа спустя 15 суток животные получают повторную дозу иммунизации при тех же условиях. Через шестьдесят суток после вторичной иммунизации животных забивают и их спленоциты стимулируют различными антигенами, чтобы проанализировать CD4+ и CD8+ Т-ответы, сохраняющиеся к этому моменту. Чтобы исследовать CD8+ Т-ответы, клетки стимулируют эпитопом 1073 и проводят оценку продукции IFN-γ и литической активности. На фиг.5, А показано, что спустя шестьдесят суток после второй иммунизации спленоциты мышей, иммунизированных поли(I:С) и анти-CD40 вместе с белком NS3, способны к образованию больших количеств IFN-γ при стимулировании пептидом 1073, но не показывают такой способности в отсутствие антигена. Кроме того, эти клетки способны к лизису клеток-мишеней, нагруженных пептидом 1073 (черные кружки), но не способны к лизису клеток-мишеней, которые не содержат антигена (белые кружки) (фиг.5, Б). Кроме того, также исследуют CD4+ ответ, используя в качестве антигена белок NS3, применяемый в иммунизации. Фиг.5, В показывает, что этот протокол иммунизации также индуцирует сильные и устойчивые CD4+ ответы, которые специфически распознают NS3.

1. Иммуностимулирующая комбинация для профилактики и лечения гепатита С, которая отличается тем, что она включает:
а) полиинозиновую-полицитидиловую кислоту [поли(I:С)], действующую в качестве агониста Toll-подобного рецептора TLR3,
б) агонист CD40,
в) полипептид, который включает белок NS3 вируса гепатита С или фрагмент указанного белка NS3, обладающий способностью к индукции CD8+ и CD4+ ответов, в которой агонист CD40 выбран из анти-С040-антитела, CD40L (природный лиганд CD40) и их фрагментов, которые сохраняют свою способность к связыванию с CD40.

2. Иммуностимулирующая комбинация по п.1, отличающаяся тем, что агонист CD40 является анти-CD40-антителом.

3. Иммуностимулирующая комбинация по п.1, отличающаяся тем, что она включает:
а) поли(I:С),
б) анти-CD40-антитело и
в) полипептид, содержащий белок NS3.

4. Иммуностимулирующая комбинация по п.2, отличающаяся тем, что полипептид, содержащий белок NS3, является полипептидом с последовательностью SEQ. ID. NO: 1.

5. Иммуностимулирующая комбинация по п.1, отличающаяся тем, что все компоненты образуют часть единой фармацевтической композиции.

6. Иммуностимулирующая комбинация по п.3, отличающаяся тем, что все компоненты образуют часть единой фармацевтической композиции.

7. Иммуностимулирующая комбинация по п.4, отличающаяся тем, что все компоненты образуют часть единой фармацевтической композиции.

8. Иммуностимулирующая комбинация по п.1, отличающаяся тем, что все компоненты образуют часть по меньшей мере двух различных фармацевтических композиций.

9. Иммуностимулирующая комбинация по п.3, отличающаяся тем, что все компоненты образуют часть по меньшей мере двух различных фармацевтических композиций.

10. Иммуностимулирующая комбинация по п.4, отличающаяся тем, что все компоненты образуют часть по меньшей мере двух различных фармацевтических композиций.

11. Применение иммуностимулирующей комбинации, определенной в любом из пп.1-10, для приготовления лекарственного средства для профилактики и лечения гепатита С.

12. Применение иммуностимулирующей комбинации, определенной в любом из пп.1-10, для приготовления лекарственного средства для лечения гепатита С.

13. Применение иммуностимулирующей комбинации по п.11, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство включает по меньшей мере две фармацевтические композиции, которые пригодны для совместного введения.

14. Применение иммуностимулирующей комбинации по п.12, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство включает по меньшей мере две фармацевтические композиции, которые пригодны для совместного введения.

15. Применение иммуностимулирующей комбинации по п.11, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство включает по меньшей мере две фармацевтические композиции, которые пригодны для раздельного введения.

16. Применение иммуностимулирующей комбинации по п.12, отличающееся тем, что указанное лекарственное средство включает по меньшей мере две фармацевтические композиции, которые пригодны для раздельного введения.

17. Применение иммуностимулирующей комбинации по п.15, отличающееся тем, что эти фармацевтические композиции пригодны для раздельного введения различными путями.

18. Применение иммуностимулирующей комбинации по п.16, отличающееся тем, что эти фармацевтические композиции пригодны для раздельного введения различными путями.

19. Фармацевтическая композиция, содержащая иммуностимулирующую комбинацию, описанную в любом из пп.1-4, отличающаяся тем, что каждый из компонентов содержится в фармацевтически приемлемых количествах.

20. Набор для введения иммуностимулирующей комбинации, описанной в любом из пп.1-4, отличающийся тем, что он включает по меньшей мере две различные фармацевтические композиции, как определено в п.19, при этом каждая из них содержит по меньшей мере один из компонентов а), б) или в) указанной иммуностимулирующей комбинации.

21. Способ получения иммунного ответа на вирус гепатита С, отличающийся тем, что он заключается во введении стимулирующей комбинации, определенной в любом из пп.1-10, в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа.

22. Способ по п.21, отличающийся тем, что он предусматривает профилактическое лечение.

23. Способ по п.21, отличающийся тем, что он предусматривает терапевтическое лечение.

24. Вакцина против вируса гепатита С, отличающаяся тем, что она включает иммуностимулирующую комбинацию по любому из пп.1-10.