Способ определения количества фибринмономеров в крови

Авторы патента:

Дурова Маргарита Викторовна (RU)

Щукин Валерий Александрович (RU)

Зарубина Ирина Анатольевна (RU)

Бышевский Анатолий Шулимович (RU)

Ральченко Ирина Викторовна (RU)

Шорохова Татьяна Дмитриевна (RU)

G01N33/86 - основанные на времени свертываемости крови

Владельцы патента RU 2433412:

Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования ТЮМЕНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава) (RU)

Изобретение относится к медицине, а именно к биохимическому способу определения концентрации компонентов свертывания крови и продуктов их превращения в биологических жидкостях. Предложенный способ заключается в том, что количество фибринмономеров, растворенных в 0,5 N гидроксиде натрия, определяют спектрофотометрически с использованием этанолового теста. Предложенный способ количественного определения фибринмономеров в крови позволяет выявить патологический процесс в организме с достоверностью 95%. 2 табл.

При многих заболеваниях и патологических состояниях (геморрагические и ишемические инсульты, атеросклероз, инфаркт миокарда, операционные травмы, кесарево сечение и т.д.) возникает необходимость количественного определения содержания фибринмономеров и продуктов деградации фибрина в плазме крови, однако до настоящего времени применяются только качественные методы определения наличия фибринмономеров в плазме крови.

Известен способ выявления фибринмономеров в плазме крови по образованию желеобразной массы под влиянием 50% этанола [Лычев В.Г. Диагностика и лечение диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. - М.: Медицина, 1993. - 160 с.]. Желеобразность плазмы через 10 мин после добавления 50% этанола рассматривают как признак наличия в ней фибринмономеров. Если образуются крупнозернистые частицы, то результат оценивают как слабоположительный, либо - отрицательный. Метод не позволяет определить концентрацию фибринмономеров.

А.Н.Момонт с соавт. предложили метод определения фибринмономеров и продуктов деградации фибрина по образованию в плазме зерен (паракоагулянта) фибрина после добавления раствора фенантролина [Момонт А.Н., Елыкомов В.А., Баркаган З.С. Клиническая и лабораторная диагностика. 1996. - №4. - С.17-20]. Основными недостатками метода являются его субъективность и наличие ложно положительных результатов, которые возникают, в частности, в результате недостаточного перемешивания крови и цитрата натрия или при хранении плазмы более 1 часа, что ведет к инактивации факторов свертывания крови.

Задачей настоящего изобретения является разработка объективного способа определения количества фибринмономеров в плазме крови.

Технический результат - простой, не требующий больших материальных затрат, основанный на спектрофотометрическом определении фибринмономеров.

Технический результат достигается тем, что осадок плазмы гомогенизируют в 0,5 N гидроксиде натрия проводят спектрофотометрический анализ взвеси и количество фибринмономеров определяют по фигрограмме.

Положительный эффект предлагаемого способа достигают за счет количественного определения фибринмономеров спектрофотометрически. Сравнительная характеристика предлагаемого способа и способа прототипа представлена в таблице 1.

Предложенный способ осуществляют следующим образом.

Из локтевой вены берут кровь в пластиковую пробирку, содержащую 3,8% раствора натрия лимоннокислого 3-замещенного (цитрата натрия). Соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1 (4,5 мл крови и 0,5 мл цитрата натрия). Содержимое центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин (2000g). В результате получаем бедную тромбоцитами плазму, затем к 0,4 мл плазмы крови добавляем 0,15 мл 50% этанола и центрифугируем при 3500 об/мин - 15 мин. Полученный центрифугат (осадок) промываем 0,14 М раствором хлорида натрия и центрифугируем дважды при 3.500 об/мин по 10 мин. Полученный осадок гомогенизируем в 7 мл 0,5 н. раствора едкого натрия в течение 1-2 мин и помещаем в кварцевую кювету для спектрофотометрии при светопропускании 280 нм и по фигрограмме определяем количество фибринмономеров. Колебания экстинции от 0,1 до 0,8 свидетельствуют о концентрации фибринмономеров в плазме крови.

Примеры практического использования предложенного способа

Пример 1

В неврологическое отделение ОКБ №2 г.Тюмени поступила больная Щербакова А.И., 68 лет с диагнозом: «Ишемический инсульт» (средней степени тяжести).

У больной взяли кровь из локтевой вены в шприц со стабилизирующим раствором (3,8% р-р цитрата натрия) в соотношении 1:9. Пробу в количестве 5 мл поместили в центрифужную пробирку и центрифугировали с ускорением 2000g в течение 10 мин, затем к 0,4 мл плазмы крови переносили в другую пробирку и добавляли 0,15 мл 50% этанола. Включали секундомер и по истечении 10 мин отмечали появление зерен паракоагулянта, затем центрифугировали при 3500 об/мин - 15 мин. Полученный центрифугат (осадок) промывали 0,14 М раствором хлорида натрия и дважды центрифугировали при 3500 об/мин (ускорении 1500g) по 10 мин. Декантат удаляли. Полученный осадок гомогенизировали в 7 мл 0,5 н. раствора едкого натрия в течение 1-2 мин и помещали в кварцевую кювету для спектрофотометрии при светопропускании 280 нм и по фигрограмме определяем количество фибринмономеров. О концентрации фибринмономеров в плазме крови судили по величине светопреломления. Зарегистрировано светопропускание - 0,41.

Пример 2

Больной Лезин Е.Н., 46 лет был доставлен в отделение реаниамации ОКБ №2 г.Тюмени машиной СМП по экстренным показаниям. Клинически поставлен диагноз: «Ишемический инсульт» (высокой степени тяжести).

Из локтевой вены взяли кровь в пластиковую пробирку, содержащую 3,8% раствора натрия лимоннокислого 3-замещенного (цитрата натрия). Соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1 (4,5 мл крови и 0,5 мл цитрата натрия). Содержимое центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин (2000g). В результате получли бедную тромбоцитами плазму, затем к 0,4 мл плазмы крови добавили 0,15 мл 50% этанола и центрифугировали при 3500 об/мин - 15 мин. Полученный центрифугат (осадок) промывали 0,14 М раствором хлорида натрия, а затем центрифугировали дважды при 3.500 об/мин по 10 мин. Полученный осадок гомогенизировали в 7 мл 0,5 н. раствора едкого натрия в течение 1-2 мин и помещали в кварцевую кювету для спектрофотометрии при светопропускании 280 нм и по фигрограмме определяли количество фибринмономеров. Светопропускание равно 0,76, что свидетельствует о концентрации фибринмономеров в плазме крови.

Для количественного выражения содержания фибринмономеров в плазме крови использовали фигрограмму, которая в условных единицах активности отражает концентрапцию фибринмономеров, соответствущую 6,0 ЕА.

Пример 3

В неврологическое отделение ОКБ №2 г.Тюмени поступила больная Лагутина Л.А., 48 лет с диагнозом «Ишемический инсульт» (легкой степени тяжести).

Из локтевой вены взяли кровь в пластиковую пробирку, содержащую 3,8% раствора натрия лимоннокислого 3-х замещенного (цитрата натрия). Соотношение объемов крови и цитрата натрия - 9:1 (4,5 мл крови и 0,5 мл цитрата натрия). Содержимое центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин (2000g). В результате получили бедную тромбоцитами плазму. Затем к 0,4 мл плазмы крови добавили 0,15 мл 50% этанола и центрифугировали при 3500 об/мин - 15 мин. Полученный центрифугат (осадок) промывали 0,14 М раствором хлорида натрия и центрифугировали дважды при 3500 об/мин по 10 мин. Полученный осадок гомогенизировали в 7 мл 0,5 н. раствора едкого натрия в течение 1-2 мин. Полученный) взвесь помещали в кварцевую кювету для спектрофотометрии. Использовали длину волны 280 нм.

Для количественного выражения содержания фибринмономеров в плазме крови использовали фигрограмму, которая отражает светопропускание в условных единицах активности. По светопропусканию показатель составил 0,27, а по данным фигрограммы - 2,2 ЕА.

Пример 4

Больной Орлов Э.А., 34 лет был доставлен в отделение реаниамации ОКБ №2 г.Тюмени машиной СМП по экстренным показаниям. Клинический диагноз: «Ишемический инсульт высокой степени тяжести».

У больного взяли кровь из локтевой вены в шприц со стабилизирующим раствором (3,8% р-р цитрата натрия) в соотношении 1:9. Пробу в количестве 5 мл поместили в центрифужную пробирку и центрифугировали с ускорением 2000g в течение 10 мин, затем к 0,4 мл плазмы крови переносили в другую пробирку и добавляли 0,15 мл 50% этанола. Включали секундомер и по истечении 10 мин отмечаем появление зерен паракоагулянта, затем центрифугировали при 3500 об/мин - 15 мин. Полученный центрифугат (осадок) промывали 0,14 М раствором хлорида натрия и дважды центрифугировали при 3500 об/мин (ускорении 1500g) по 10 мин. Декантат удаляли. Полученный осадок гомогенизировали в 7 мл 0,5 н. раствора едкого натрия в течение 1-2 мин и помещали в кварцевую кювету для спектрофотометрии при светопропускании 280 нм и по фигрограмме определяли количество фибринмономеров. О концентрации фибринмономеров в плазме крови судили также по величине светопреломления. Зарегистрировано светопропускание - 0,79.

Приведенные примеры иллюстрируют возможность применения данного способа для количественного определения фибринмономеров в плазме крови на основании спектрофотометрического анализа и учета результатов по фигрограмме. Всего проведено 20 исследований с плазмой крови от больных, находящихся на лечении в областной клинической больнице №2 г.Тюмени (таблица 2). Положительный эффект применения предложенного способа по сравнению с прототипом представлен в таблице 2. Предложенный способ позволяет выявить патологический процесс в организме с достоверностью 95%.

Способ количественного определения фибринмономеров в крови

Таблица 1
Сравнительная характеристика определения фибринмономеров в крови по предложенному способу и прототипу
Признаки	Предлагаемый способ	Способ-прототип
1. Использованиие реактивов для исследования	50% раствор этанола	раствора фенантролина
2. Обработка плазмы для исследования	Повторное центрифугирование	Не проводится
3. Разрешающая способность способа	Количественное определение фибринмономеров	Качественное определение фибринмономеров
4. Объективность исследований	Спектрофотометрическое определение фибринмономеров	Визуальное определение результатов исследований
5. Определение тяжести патологического процесса с целью назначения специфического лечения	Возможность использования метода для назначения специфического лечения	Специфическое лечение не проводится

Способ количественного определения фибринмономеров в крови

Таблица 2
Колебания показания светопропускания у больных ишемическим инсультом
Порядковый номер	Показатели светопропускания	ЕА на мл
1	0.31	3.1
2	0.442	4.2
3	0.452	4.3
4	0.43	4.2
5	0.69	6.1
6	0.411	4.1
7	0.268	2.5
8	0.761	6.5
9	0.315	3.1
10	0.361	3.4
11	0.572	5.3
12	0.703	6.4
13	0.568	5.2
14	0.575	5.3
15	0.521	5.1
16	0.345	3.2
17	0.395	3.9
18	0.461	4.5
19	0.462	4.5
20	0.794	7.0

Способ определения фибринмономеров в крови, включающий использование этанолового теста, отличающийся тем, что после обработки плазмы этанолом, центрифугирования и промывания осадка хлоридом натрия проводят повторное центрифугирование, полученный осадок гомогенизируют 0,5 N гидроксидом натрия в течение 1-2 мин, а результат учитывают на основании спектрофотометрического анализа при светопропускании 280 нм и количество фибринмономеров определяют по фиброграмме.

Способ определения функционального состояния системы гемостаза // 2430380

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения функционального состояния системы гемостаза. .

Способ определения активности тромбина // 2429488

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования. .

Измерение активности тромбина в цельной крови // 2422835

Изобретение относится к способу in vitro измерения активности тромбина в образце крови. .

Способ оценки риска повторных тромботических событий у больных острым коронарным синдромом // 2419800

Изобретение относится к медицине, клинико-лабораторной диагностике и экспериментальной медицине. .

Способ экспресс-оценки функционального состояния системы гемостаза // 2413954

Изобретение относится к области медицины, а именно к инструментальным способам оценки функционального состояния системы гемостаза и касается способа экспресс-оценки функционального состояния системы гомеостаза.

Способ диагностики резистентности к ацетилсалициловой кислоте // 2413953

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и касается способа диагностики резистентности к ацетилсалициловой кислоте. .

Способ коррекции внутрисосудистой активности тромбоцитов у детей со сколиозом // 2408351

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии, и ортопедии. .

Способ коррекции тромбопластинообразования у детей со сколиозом // 2405522

Изобретение относится к области медицины, а именно к гематологии и ортопедии. .

Способ оптимизации диагностики стадий острого синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови // 2402277

Изобретение относится к медицине, а именно к интенсивной терапии, реаниматологии, медицине критических состояний, лабораторной диагностике, и может быть использовано врачами-реаниматологами, интенсивистами, врачами-лаборантами для своевременной диагностики и, как следствие, проведения индивидуализированной интенсивной терапии синдрома острого диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.

Способ оценки степени тяжести нарушения агрегации эритроцитов // 2447450

Изобретение относится к медицине, а именно к внутренним болезням, и может быть использовано для оперативной оценки нарушений микроциркуляции

Анализатор для автоматического определения показателей гемостаза // 2452936

Изобретение относится к медицинской технике, а именно к анализаторам для автоматического определения показателей гемостаза (коагуляторам)

Способ определения активности и функциональности тромбина и фибриногена // 2462721

Изобретение относится к биохимии

Диагностика тромбоэмболических заболеваний вен путем определения содержания d-димеров и растворимого фибрина // 2475760

Способ определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в сыворотке крови, плазме, эритроцитах и в моче // 2525437

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической биохимии, и предназначено для определения окислительной модификации белков в пуле веществ средней молекулярной массы в биологической среде при любых патологических состояниях путем биохимического исследования. Производят забор биологической среды, выбранной из плазмы крови, эритроцитов или мочи, осаждают белки путем добавления 10% раствора трихлоруксусной кислоты, и в случае образования осадка проводят центрифугирование при 1000 об/мин в течение 15 минут, затем добавляют 0,05 М раствор 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М соляной кислоте, после чего пробу центрифугируют при 1000 об/мин в течение 20 минут, и в случае выпадения осадка осадок промывают 2 раза раствором этанол-этилацетат (1:1), затем подсушивают на водяной бане 10 минут и затем растворяют в 8 М растворе мочевины, выдерживая пробы в кипящей водяной бане в течение 10 минут до полного растворения, с последующим анализом раствора спектрофотометрическим методом. Способ обеспечивает увеличение информативности биохимических тестов, снижение расходов биологического материала. Способ пригоден как для однократного исследования, так и для мониторинга состояния окислительной модификации белков и уровня средних молекул в раннем послеоперационном периоде. 9 табл., 2 прим.

Способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей // 2533287

Изобретение относится к области медицины и представляет собой способ диагностики нарушений агрегации тромбоцитов при муковисцидозе у детей, включающий проведение теста на агрегацию тромбоцитов с индукторами на агрегометре «Multiplate», при этом в кюветы с магнитной мешалкой и электродами добавляют 400 мкл NaCl при 37°C и затем сразу добавляют 400 мкл цельной крови из пробирки с гирудином, инкубируют в камере прибора две минуты, затем добавляют в кювету 30 мкл индуктора агрегации, выбранного из группы: растворимый рецептор тромбина - пептид-6, аденозиндифосфат, арахидоновая кислота, при этом скорость агрегации тромбоцитов изображается на экране прибора в виде кривой и автоматически рассчитывается площадь под кривой U, по значению площади U под кривой судят о состоянии агрегации трмбоцитов в сравнении с референсными значениями в группе здоровых детей и при повышении порогового значения площади U выше референсного судят о гиперагрегации тромбоцитов, а при понижении порогового значения площади U ниже референсного судят о гипоагрегации тромбоцитов. Изобретение обеспечивает своевременную диагностику нарушений в микроциркуляторном русле при муковисцидозе. 2 пр., 1 ил.

Способ определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте // 2538219

Изобретение относится к способу определения резистентности тромбоцитов к ацетилсалициловой кислоте (АСК) путем импедансного исследования агрегационной функции тромбоцитов in vitro, при котором исследуют агрегационную активность после инкубации образца биологического материала с АСК с использованием индуктора агрегации, причем агрегацию тромбоцитов индуцируют коллагеном в оптимальной концентрации 2 мг/мл и одновременно с измерением импеданса проводят определение динамики освобождения гранул тромбоцитов люминесцентным методом, где перед проведением агрегации пробы калибруются с помощью стандарта аденозинтрифосфата (АТФ), по полученным агрегатограммам определяют значения амплитуды агрегации в Омах и присваивают полученным значениям баллы: значения ≤6 соответствуют 0 баллов, значения 7-9 соответствуют 1 баллу, значения 10-12 соответствуют 2 баллам, значения >12 соответствуют 3 баллам; затем определяют интенсивность высвобождения АТФ из гранул тромбоцитов в нмолях и присваивают полученным значениям баллы: значения <0,5 соответствуют 0 баллам, значения 0,5-1,0 соответствуют 1 баллу, значения 1,0-1,5 соответствуют 2 баллам, значения >1,5 соответствуют 3 баллам, и далее рассчитывают индекс резистентности (ИР) по формуле, при этом значение показателя ИР более 4 указывает на наличие аспиринорезистентности тромбоцитов. Изобретение обеспечивает проведение быстрой комплексной диагностики резистентности тромбоцитов к АСК с оценкой функционального состояния гранул тромбоцитов до начала лечения и возможность предотвращения развития нежелательных тромботических или геморрагических осложнений. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ определения функционального состояния системы гемостаза // 2548780

Изобретение относится к медицине, а именно к гемокоагулогии, и может быть использовано для выявления лиц группы риска развития гемокоагуляционных осложнений. Сущность способа: проводят измерение амплитуды записи процесса свертывания крови в его начале, определяют показатели начала и конца процесса свертывания электрокоагулограммы крови и сравнивают их с одноименными показателями процесса свертывания крови в норме и при разнонаправленных отклонениях диагностируют нарушения функционального состояния системы гемостаза. Определяют постоянную времени по калибровочной характеристике, калибровку проводят априори для двух измеренных U1, U2 и известных U01, U02 значений нижней t1 и верхней t2=kt1 границ адаптивного диапазона, калибровочной характеристикой U0i служит функция предельного напряжения крови, компенсирующая неопределенность постоянной времени Т0, выбранной произвольно T*, и связывающая эталонную Uэi и измеренную Ui характеристики за счет нормирования измеренных значений известными по калибровочной характеристике U0i находят действительные значения постоянной времени Т0 и предельного напряжения U0 крови по которым последовательно строят калибровочную характеристику предельного напряжения крови, эталонную характеристику Uэi и определяют показатели начала Тн и конца Тк процесса свертывания крови где Uн, Uк - нормированные пороги напряжения начала и конца процесса свертывания крови. Изобретение позволяет снизить методическую погрешность на десятки порядков, повысить точность времени свертывания на 4 порядка, а оперативность сокращает в три раза, что в итоге повышает метрологическую эффективность компьютерных анализаторов для автоматизации выявления лиц группы риска развития гемокоагуляционных осложнений. 4 ил.

Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 // 2556116

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, конкретно к получению мутантов инфестина 4, и может быть использовано для диагностических целей при определении характеристик свертывания крови и ее компонентов. Полипептид характеризуется последовательностью мутанта инфестина 4 MutB SEQ ID NO: 1. При этом указанная последовательность может иметь модификации вне участка ингибирующей петли, существенно сохраняющие активность указанного полипептида. Изобретение позволяет получить высокоселективный ингибитор фХIIа, селективность или активность которого выше, чем у нативного инфестина 4 и Mut15. Полипептид используют для ингибирования контактной активации в тестируемом образце крови или ее продукта для увеличения времени хранения образца. 3 н. и 22 з.п. ф-лы, 7 ил., 3 табл., 4 пр.

Способ двухфазного получения липосом и способы их применения при изготовлении диагностических реагентов // 2567746

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложены способ двухфазного получения липосом, способ получения диагностического реагента для определения протромбинового времени и способ получения диагностического реагента для определения тромбопластинового времени. Способ двухфазного получения липосом включает получение липосомной эмульсии. Липосомную эмульсию с концентрацией липидов в ней 0,5-1,5 г/мл получают путем механического смешивания. Способ получения диагностического реагента для определения протромбинового времени включает использование липосомы по вышеуказанному способу. Липосомную эмульсию и природный или рекомбинантный тканевый фактор смешивают в пропорции 2:1 в буферной среде. Способ получения диагностического реагента для определения тромбопластинового времени включает использование липосомы по вышеуказанному способу. Липосомную эмульсию и отрицательно заряженный активный компонент смешивают в пропорции 1:1 в буферной среде. Преимуществом изобретений является техническое упрощение способа получения липосомных эмульсий, простота реализации методов получения диагностических объектов. 3 н. и 4 з.п. ф-лы, 13 пр.