Способы и композиции для диагностики анкилозирующих спондилитов с использованием биомаркеров

Группа изобретений относится к медицине, а именно к ортопедии и артрологии, и может быть использована при лечении анкилозирующего спондилита. Способы по изобретению касаются определения эффективности антитела TNFα или его антигенсвязывающей части и могут быть использованы в лечении анкилозирующего спондилита с использованием биомаркера деградации коллагена и биомаркера синовита. Наборы по изобретению содержат детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер деградации коллагена и биомаркер синовита, инструкции по применению и реактивы для выделения образца из организма пациента. Использование изобретений позволяет повысить эффективность лечения анкилозирующего спондилита. 12 н. и 62 з.п. ф-лы, 4 табл., 4 ил.

 

Родственные заявки

Данная заявка претендует на приоритет по предварительной заявке США 60/732444, поданной 1 ноября 2005, содержание которой включено здесь в виде ссылки.

Настоящая заявка связана с патентами США №№ 6090382, 6258562 и 6509015, каждый из которых включен здесь в виде ссылки. Данная заявка также связана с патентной заявкой США № 09/801185, поданной 7 марта 2001; патентной заявкой США № 10/302356, поданной 22 ноября 2002; патентной заявкой США № 10/163657, поданной 5 июня 2002; и патентной заявкой США № 10/133715, поданной 26 апреля 2002; патентной заявкой США № 10/222140, поданной 16 августа 2002; патентной заявкой США № 10/693233, поданной 24 октября 2003; патентной заявкой США № 10/622932, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/623039, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/623076, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/623065, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/622928, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/623075, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/623035, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/622683, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/622205, поданной 18 июля 2003; патентной заявкой США № 10/622210, поданной 18 июля 2003; и патентной заявкой США № 10/623318, поданной 18 июля 2003. Данная заявка также связана с заявкой США №11/104117. Полное содержание каждого из этих патентов и патентных заявок включено здесь в виде ссылки.

Уровень техники

Повышенные уровни TNF играют важную роль в патологическом воспалении. TNF, также называемый как (TNFα), вовлечен в патофизиологию различных заболеваний и расстройств человека, включая сепсис, инфекции, аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантатов и заболевания «трансплантат против хозяина» (см., например, Moeller и др. (1990) Cytokine 2:162;, патент США № 5231024, выданный Moeller и др., европейскую патентную публикацию № 260610 B1 Moeller, A. и др.; Vasilli (1992) Annu. Rev. Immunol. 10:411; Tracey and Cerami (1994) Annu. Rev. Med. 45:491).

Анкилозирующий спондилит (AS), который ассоциирован с повышенными уровнями TNF (Lange и др. (2000) Eur J Med Res. 5(12):507), является распространенным воспалительным ревматическим заболеванием, которое приводит к прогрессирующей неподвижности спины и ограничению подвижности. AS представляет собой форму хронического воспаления позвоночных и крестцово-подвздошных суставов, которая может вызывать боль и неподвижность внутри и вокруг позвоночника. Со временем хроническое воспаление позвоночника (спондилит) может приводить к полному цементированию (слиянию) позвоночника, процессу, называемому анкилозом, который, в свою очередь, может приводить к потере подвижности позвоночника.

AS часто диагностируют с использованием сочетания способов, включая изучение симптомов, физический осмотр и рентгеновский анализ. Симптомы пациента с AS могут включать в себя боль и утреннюю неподвижность позвоночника и крестцовых участков при наличии или в отсутствие сопутствующего воспаления в других суставах, сухожилиях и органах. Тем не менее, ранние симптомы AS могут быть очень обманчивы, поскольку неподвижность и боль внизу спины могут наблюдаться при многих других состояниях, и, как результат, может пройти время, прежде чем диагноз AS будет хотя бы рассматриваться. В дополнение, физический осмотр пациента может выявить признаки воспаления и уменьшение подвижности суставов, часто особенно выраженные в позвоночнике. Гибкость нижней части спины и/или шеи может быть уменьшена. Дальнейшие ключи к диагнозу могут быть предложены на основании рентгеновских аномалий позвоночника или присутствия генетического тест-маркера, гена HLA-B27 в крови.

Структурные повреждения, ассоциированные с AS, и результаты деградации и резорбции хряща и кости сустава приводят к разрушению сустава. Терапевтически важно уделять внимание как симптомам пациента, имеющего AS, так и структурным повреждениям суставов, вызванным разрушением суставов, ассоциированным с болезнью.

Традиционное лечение AS включало введение нестероидных противовоспалительных лекарственных средств (NSAID) пациенту для снижения боли и неподвижности позвоночника и других суставов. Обычно используемые NSAID включают в себя индометацин (индоцин), толметин (толектин), сулиндак (клинорил), напроксен (напросин) и диклофенак (вольтарен). Недавно показана эффективность в уменьшении симптомов, ассоциированных с AS, биологических агентов против TNF, таких как этанерцепт, инфликсимаб и адалимумаб.

Сущность изобретения

Несмотря на прогресс в лечении AS с использованием биологических агентов против TNF, для помощи практикующим терапевтам в диагностике симптомов пациента и назначении режимов лечения требуются диагностические и прогностические тесты. В дополнение, для лучшей оценки улучшения состояния больного требуются диагностические и прогностические тесты с целью обеспечения лучшего медицинского обслуживания пациенту наряду со сниженной ценой лечения.

Изобретение связано с биомаркерами, которые могут быть использованы для определения улучшений общего статуса заболевания AS, особенно в отношении структурных повреждений, ассоциированных с AS. Представленное изобретение связано со способом определения эффективности ингибитора TNF в уменьшении деградации хряща и/или синовита, связанных с AS. Изобретение также включает в себя способ выявления пациентов с AS, являющихся кандидатами на лечение ингибиторами TNF, например адалимумабом, на основании их уровня биомаркеров деградации хряща и/или биомаркеров синовита.

Изобретение связано со способом определения эффективности человеческого антитела TNFα или его антигенсвязывающей части в лечении анкилозирующего спондилита, причем указанный способ включает в себя сравнение заранее определяемого уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента, имеющего AS, после лечения человеческим антителом против TNFα с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, ассоциированным с болезненным состоянием; и определение того, снижается ли уровень биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента после лечения по сравнению со стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, причем снижение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациентов после лечения человеческим антителом против TNFα по сравнению со стандартным уровнем указывает на эффективность человеческого антитела против TNFα в лечении AS.

Изобретение связано также со способом мониторинга эффективности человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в отношении замедления прогресса структурных повреждений, ассоциированных с анкилозирующим спондилитом (AS), у пациентов, включающим в себя определение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента и сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, ассоциированным с AS, причем снижение уровня биомаркера указывает на то, что человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть эффективны в уменьшении скорости развития структурных повреждений, ассоциированных с AS, у пациента.

Изобретение также включает в себя способ прогнозирования эффективности человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в лечении AS у пациента, причем указанный способ включает в себя сравнение предварительно определяемого уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента после лечения человеческим антителом против TNFα или его антигенсвязывающей частью с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, ассоциированным с AS; и оценку того, снижается ли уровень биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, причем снижение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита по сравнению со стандартным уровнем указывает на то, что человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть могут быть эффективны в лечении AS у пациента.

Изобретение также связано со способом определения эффективности человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в отношении анкилозирующего спондилита, включающим в себя сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, полученного у пациента, имеющего AS, перед лечением, с уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, полученным у указанного пациента после лечения, причем снижение уровня биомаркера после лечения указывает на эффективность человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части.

В одном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является С-телопептид коллагена II типа (CTX-II). В другом варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является мочевой С-телопептид коллагена II типа (CTX-II).

В одном варианте осуществления биомаркером синовита является матриксная металлопротеиназа 3 (MMP3). В другом варианте осуществления биомаркером синовита является сывороточная металлопротеиназа 3 (MMP3).

В одном варианте осуществления определяют эффективность человеческого антитела к TNFα или его антигенсвязывающей части в облегчении структурных повреждений, ассоциированных с AS.

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению дополнительно включает в себя сравнение уровня С-реактивного белка (CRP) пациента с известным стандартным уровнем CRP, ассоциированным с указанным болезненным состоянием; и

оценку того, повышается ли уровень CRP пациента по сравнению с известным стандартным уровнем CRP, причем снижение уровня С-реактивного белка по сравнению с известным стандартом указывает на эффективность лечения.

В одном варианте осуществления человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть диссоциирует от человеческого TNFα с K_d порядка 1×10^-8 М или менее и константой скорости K_off порядка 1×10^-3 с^-1 или менее, причем обе [константы] определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и нейтрализует цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном тесте in vitro на клетках L929 с IC₅₀ порядка 1×10^-7 M или менее.

В одном варианте осуществления человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:

a) диссоциирует от человеческого TNFα с константой скорости K_off порядка 1×10^-3 с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

b) имеет CDR3-домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 3 последовательность путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет CDR3-домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 4 последовательность путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

В другом варианте осуществления человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 3 последовательность путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), имеющую CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 4 последовательность путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

В еще одном варианте осуществления изобретения человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В еще одном варианте осуществления человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть представляет собой адалимумаб.

В еще одном варианте осуществления изобретения уровень биомаркера определяют с использованием ELISA.

Изобретение также включает в себя набор для проведения любых вышеупомянутых способов, содержащий детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер деградации коллагена и/или биомаркер синовита; инструкцию по применению; и, необязательно, реактивы для выделения образца из организма пациента.

В одном варианте осуществления детектируемый агент распознает либо мочевой CTX-II, либо сывороточный MMP3.

Изобретение также связано со способом определения эффективности ингибитора TNFα в лечении AS у пациента, причем указанный способ включает в себя сравнение предварительно определяемого уровня CTX-II у пациента после лечения ингибитором TNFα с известным стандартным уровнем CTX-II, ассоциированным с болезненным состоянием; и оценку того, снижается ли уровень CTX-II пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем CTX-II, причем снижение уровня CTX-II у пациента по сравнению с известным стандартным уровнем указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в лечении AS у пациента.

Изобретение дополнительно связано со способом определения эффективности ингибитора TNFα в уменьшении структурных повреждений, ассоциированных с анкилозирующим спондилитом (AS), у пациента, причем указанный способ включает в себя сравнение предварительно определяемого уровня CTX-II у пациента с AS после лечения ингибитором TNFα с известным стандартным уровнем CTX-II, ассоциированным с болезненным состоянием; и оценку того, снижается ли уровень CTX-II пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем CTX-II, причем снижение уровня CTX-II после лечения ингибитором TNFα по сравнению с известным стандартным уровнем указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в уменьшении структурных повреждений, ассоциированных с AS, у пациента.

Изобретение также связано со способом определения эффективности ингибитора TNFα в лечении AS у пациента, причем указанный способ включает в себя сравнение предварительно определяемого уровня CTX-II у пациента после лечения с предварительно определяемым уровнем CTX-II у пациента перед лечением; и оценку того, снижается ли уровень CTX-II у пациента после лечения по сравнению с уровнем CTX-II у пациента перед лечением, причем снижение уровня CTX-II у пациента после лечения по сравнению с уровнем CTX-II у пациента перед лечением указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в лечении AS у пациента.

В одном из вариантов осуществления уровень CTX-II после лечения уменьшался по меньшей мере приблизительно на 5-10% по сравнению с уровнем CTX-II перед лечением. В другом варианте осуществления уровень CTX-II после лечения уменьшался по меньшей мере приблизительно на 9% по сравнению с уровнем CTX-II перед лечением. В другом варианте осуществления уровень CTX-II после лечения составлял по меньшей мере приблизительно 5-100%, приблизительно 5-80%, приблизительно 5-60%, приблизительно 5-45%, приблизительно 5-35%, приблизительно 5-30%, приблизительно 5-25%, приблизительно 5-20%, приблизительно 5-15%, приблизительно 5-10%, приблизительно 6-9%, приблизительно 7-8% или приблизительно 9% относительно исходного или известного стандартного уровня.

В одном варианте осуществления уровень MMP-3 после лечения составлял по меньшей мере приблизительно 5-50%, приблизительно 5-45%, приблизительно 5-40%, приблизительно 5-35%, приблизительно 5-30%, приблизительно 5-25%, приблизительно 5-20%, приблизительно 5-15%, приблизительно 5-13%, приблизительно 6-12%, приблизительно 7-11% или приблизительно 8% относительно исходного или известного стандартного уровня для субъекта, имеющего AS. В другом варианте осуществления эффективность ингибитора TNF показана, когда уровни MMP-3 уменьшались по меньшей мере на 12% относительно исходного или известного стандартного уровня для субъекта, имеющего AS.

В одном варианте осуществления CTX-II представляет собой мочевой CTX-II. В одном варианте осуществления MMP-3 представляет собой сывороточный MMP-3.

В одном варианте осуществления уровень CTX-II или уровень MMP-3 определяют с использованием ELISA.

Изобретение также связано со способом определения того, является ли пациент, имеющий AS, кандидатом на лечение адалимумабом, включающим в себя сравнение уровня биомаркера деградации коллагена указанного пациента с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена у интактного субъекта, и оценку того, повышается ли уровень биомаркера деградации коллагена пациента по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена, причем повышение уровня биомаркера указывает на то, что указанный пациент является кандидатом на лечение адалимумабом.

В одном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является С-телопептид коллагена II типа. В одном варианте осуществления уровень биомаркера деградации коллагена определяют измерением концентрации С-телопептида коллагена II типа в моче пациента.

В одном варианте осуществления изобретение дополнительно включает в себя сравнение уровня биомаркера синовита указанного пациента с известным стандартным уровнем биомаркера синовита у интактного субъекта; и оценку того, повышается ли уровень биомаркера синовита пациента по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера синовита, причем повышение уровня биомаркера синовита пациента указывает на то, что пациент является кандидатом на лечение адалимумабом.

В одном варианте осуществления биомаркером синовита является матриксная металлопротеиназа 3 (MMP3).

Изобретение включает в себя способ определения того, является ли пациент, имеющий AS, кандидатом на лечение адалимумабом, включающий в себя сравнение уровня биомаркера синовита указанного пациента с известным стандартным уровнем биомаркера синовита у интактного субъекта, и оценку того, повышается ли уровень биомаркера синовита пациента по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера синовита, причем повышение уровня биомаркера синовита указывает на то, что указанный пациент является кандидатом на лечение адалимумабом.

В одном варианте осуществления биомаркером синовита является матриксная металлопротеиназа 3 (MMP3).

В одном варианте осуществления уровень биомаркера синовита определяют измерением концентрации MMP3 в сыворотке пациента.

В одном варианте осуществления изобретение дополнительно включает в себя сравнение уровня биомаркера деградации коллагена указанного пациента с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена у интактного субъекта; и оценку того, повышается ли уровень биомаркера деградации коллагена пациента по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена, причем повышение уровня биомаркера деградации коллагена пациента указывает на то, что пациент является кандидатом на лечение адалимумабом.

В одном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является C-телопептид коллагена II типа.

Изобретение включает в себя способ мониторинга эффективности терапевтического лечения анкилозирующего спондилита (AS), включающий в себя определение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у субъекта, причем уменьшение или изменение уровня биомаркера указывает на уменьшение или изменение в скорости прогрессирования структурного повреждения при AS.

В одном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является мочевой C-телопептид коллагена II типа.

В одном варианте осуществления биомаркером синовита является сывороточная матриксная металлопротеиназа 3 (MMP3).

В одном варианте осуществления терапевтическим лечением является введение адалимумаба.

Изобретение также включает в себя способ определения структурных повреждений у пациента, имеющего AS, включающий в себя определение основного уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента с целью установления основного уровня биомаркера указанного пациента; определение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у указанного пациента через некоторое время для установления последующего уровня биомаркера; сравнение основного уровня биомаркера указанного пациента с последующим уровнем биомаркера; и оценку того, понижается ли последующий уровень биомаркера по сравнению с основным уровнем биомаркера, причем снижение последующего уровня биомаркера указывает на уменьшение структурных повреждений.

Изобретение дополнительно включает в себя способ модуляции биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента, имеющего AS, включающий в себя введение адалимумаба указанному пациенту.

В одном варианте осуществления ингибитор TNFα выбран из группы, состоящей из антитела к TNFα или его антигенсвязывающей части, слитого белка TNF или рекомбинантного TNF-связывающего белка.

В одном варианте осуществления слитый белок TNF представляет собой этанерцепт.

В одном варианте осуществления антитело к TNFα или его антигенсвязывающая часть выбраны из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела и поливалентного антитела.

В одном варианте осуществления антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть выбраны из группы, состоящей из инфликсимаба, голимумаба и адалимумаба.

В одном варианте осуществления человеческое антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует от человеческого TNFα с Kd порядка 1×10^-8 М или менее и константой скорости K_off порядка 1×10^-3 с^-1 или менее, причем обе [константы] определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и нейтрализует цитотксичность человеческого TNFα в стандартном анализе in vitro на клетках L929 с IC₅₀ порядка 1×10^-7 M или менее.

В одном варианте осуществления человеческое антитело или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:

a) диссоциирует от человеческого TNFα с константой скорости K_off порядка 1×10^-3 с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

b) имеет CDR3-домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 3 последовательность путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет CDR3-домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 4 последовательность путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

В одном варианте осуществления человеческое антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

В одном варианте осуществления изобретение дополнительно включает в себя сравнение предварительно определяемого уровня биомаркера синовита, полученного у пациента после лечения, с известным стандартным уровнем биомаркера синовита, ассоциированным с AS; и оценку того, снижается ли уровень биомаркера синовита после лечения по сравнению с известным основным уровнем биомаркера синовита, причем снижение уровня биомаркера синовита после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера синовита указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в лечении AS у пациента.

В одном варианте осуществления биомаркером синовита является MMP-3.

Изобретение также включает в себя набор для проведения описанных выше способов, содержащий детектируемый агент, специфически распознающий CTX-II; инструкции по применению; и, необязательно, реактивы для выделения образца из организма пациента. В одном варианте осуществления набор дополнительно содержит детектируемый агент, специфически распознающий MMP-3.

Краткое описание чертежей

Фигура 1 демонстрирует схему наблюдения исследования, описанного в примере 1.

Фигура 2 демонстрирует диаграмму, которая показывает, что пациенты после адалимумаба испытывали статистически значимое снижение уровней CTX-II в моче по сравнению с плацебо на 12 неделе и 24 неделе.

Фигура 3 демонстрирует диаграмму, которая показывает, что пациенты после адалимумаба испытывали статистически значимое снижение уровней MMP3 в моче по сравнению с плацебо на 12 неделе и 24 неделе.

Фигура 4 демонстрирует диаграмму, которая показывает, что уровни CRP были значительно снижены у пациентов после адалимумаба по сравнению с плацебо на 12 неделе и 24 неделе.

Подробное описание изобретения

I. Определения

Для того чтобы легче было понять представленное изобретение, сначала должны быть определены некоторые термины.

Здесь термин «биомаркер» относится обычно к молекуле, например к гену (или нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный ген), белку, углеводной структуре или гликолипиду, экспрессия которого внутри или вне образца, полученного из ткани или клетки млекопитающего, может быть обнаружена стандартными способами в данной области (так же, как и описанными здесь), и прогнозирует или указывает на состояние субъекта, из организма которого был получен образец. Если биомаркер является белком, то модуляция или изменение экспрессии включает в себя модуляцию различными посттрансляционными модификациями. Биомаркер может быть использован для распознавания активности заболевания, включая улучшения состояния и ухудшение состояния, основываясь на уровне биомаркера. Соответственно, в одном варианте осуществления биомаркером, применимым в представленном изобретении, является любая молекула, экспрессия которой регулируется (увеличивается или уменьшается) у пациента болезненным состоянием, например спондилоартропатией, по сравнению с нормальным контролем, т.е. интактным субъектом. В одном варианте осуществления выбранные наборы одного, двух, трех и более биомаркеров согласно данному изобретению могут быть использованы как конечные точки для быстрой диагностики или прогнозирования для определения ответа пациента на лечение против TNF.

Термин «биомаркер деградации коллагена» относится к молекуле, например к гену (или нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный ген), белку, углеводной структуре или гликолипиду, который ассоциирован с разрушением коллагена. Биомаркер деградации коллагена применяется для распознавания болезненного процесса, т.е. разрушения коллагена, у субъекта, от которого получен образец ткани. В одном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является фрагмент коллагена, например фрагмент коллагена типа II. В одном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является С-телопептид коллагена II типа (CTX-II).

Термин «биомаркер синовита» относится к молекуле, например к гену (или нуклеиновой кислоте, кодирующей указанный ген), белку, углеводной структуре или гликолипиду, который ассоциирован с синовитом или воспалением синовии. Биомаркер синовита может быть использован для указания увеличения ремоделирования, пролиферации, деградации, воспаления, разрушения, разложения, патологической перестройки или деградации синовии или синовиального коллагена пациента. В одном варианте осуществления биомаркером синовита является эндопептидаза, ассоциированная с деградацией внеклеточного матрикса (ECM), например матриксная металлопротеиназа. В одном варианте осуществления биомаркером синовита, используемым в изобретении, является MMP-3.

Термин «известный стандартный уровень» или «уровень контроля» относится к принятому или определяемому заранее уровню биомаркера, который используется для сравнения с уровнем биомаркера, полученным из образца пациента. В одном варианте осуществления известный стандартный уровень биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита основан на субъекте или субъектах, имеющих AS, и, таким образом, представляет болезненное состояние. В другом варианте осуществления известный стандартный уровень биомаркера указывает на неизмененное, т.е. не болезненное состояние субъекта, не имеющего AS.

При сравнении с известным стандартным уровнем определенного биомаркера отклонения от известного стандартного уровня обычно указывают либо на улучшение, либо на ухудшение болезненного состояния. Альтернативно, при сравнении с известным стандартным уровнем определенного биомаркера равенство известному стандартному уровню обычно указывает на подтверждение активности заболевания, подтверждение не болезненного состояния или, если уровень биомаркера пациента получен после терапевтического лечения заболевания, неудачу лечения в отношении улучшения болезненного состояния пациента.

Здесь термин «экспрессия», если он используется в сочетании с детекцией экспрессии биомаркера согласно представленному изобретению, может относиться к обнаружению транскрипции гена, кодирующего белок биомаркера, к обнаружению трансляции белка биомаркера и/или к обнаружению белка биомаркера, получаемого в результате метаболизма большего белка, например деградации коллагена II типа, приводящей к выходу фрагмента CTX-II. Обнаружение экспрессии биомаркера относится к акту обнаружения того, экспрессируется ли биомаркер или нет. Количественная оценка экспрессии относится к акту определения уровня данного биомаркера, например, в нг/мл. Обнаружение и/или количественная оценка экспрессии может включать в себя определение того, увеличилась ли экспрессия биомаркера по сравнению с известным стандартным уровнем, уменьшилась ли по сравнению с известным стандартным уровнем или по существу не изменилась по сравнению с известным стандартным уровнем. Таким образом, стадия количественной оценки и/или обнаружения экспрессии не требует того, чтобы экспрессия биомаркера фактически увеличивалась или уменьшалась, но вместо этого может также включать в себя отсутствие обнаружения экспрессии биомаркера или обнаружение того, что экспрессия биомаркера не изменилась или не отличается (например, обнаружение отсутствия значительной экспрессии биомаркера или отсутствие существенного изменения в экспрессии биомаркера по сравнению с контролем).

Здесь термин «уровень» или «количество» относится к измеряемому количеству биомаркера. Количество может быть либо (a) абсолютным количеством, измеренным в молекулах, молях или массе на единицу объема клеток, либо (b) относительным количеством, например, измеренным путем денситометрического анализа. В предпочтительных вариантах осуществления определяют уровни РНК и/или белка биомаркера.

Здесь термин «субъект» или «пациент» относится либо к человеку, либо к животному, отличному от человека.

Здесь термин «образец» относится к набору сходных клеток или ткани, полученной у субъекта. Источником образца ткани или клетки может быть твердая ткань из свежего, замороженного и/или сохраненного органа или тканевого образца, или биопсии, или аспирата; кровь или любые компоненты крови; жидкости организма, такие как кровь, сыворотка, плазма, моча, слюна, пот или синовиальная жидкость. В одном варианте осуществления биомаркер синовита получают из образца сыворотки. В одном варианте осуществления биомаркер деградации хряща получают из образца мочи.

Здесь термин «человеческий TNFα» (сокращенный здесь как hTNFα или просто hTNF) должен относиться к человеческому цитокину, который существует в виде секретируемой формы 17 кДа и связанной с мембраной формы 26 кДа, биологически активной формы, которая состоит из тримера нековалентно связанных молекул 17 кДа. Структура hTNFα описана дополнительно, например, Pennica, D., и др. (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., и др. (1987) Biochemistry 26:1322-1326; и Jones, E.Y., и др. (1989) Nature 338:225-228. Термин «человеческий TNFα» предполагает включение рекомбинантного человеческого TNFα (rhTNFα), который может быть получен обычными методами рекомбинантной экспрессии или приобретен коммерчески (R & D Systems, № по каталогу 210-TA, Minneapolis, MN). TNFα также именуется как TNF.

Термин «ингибитор TNFα» включает в себя агенты, которые служат препятствием активности TNFα. Термин также включает в себя каждое из человеческих антител против TNFα и части антител, описанные здесь, так же как и описанные в патентах США №№ 6090382; 6258562; 6509015 и патентных заявках США №№ 09/801185 и 10/302356. В одном варианте осуществления ингибитором TNFα, используемым в изобретении, является антитело против TNFα или его фрагмент, включая инфликсимаб (Remicade®, Johnson and Johnson; описан в патенте США № 5656272 и включен в данное описание в виде ссылки), CDP571 (гуманизированное моноклональное антитело IgG4 против TNF-альфа), CDP 870 (гуманизированный фрагмент моноклонального антитела против TNF-альфа), anti-TNF dAb (Peptech), CNTO 148 (голимумаб; Medarex и Centocor, см. WO 02/12502) и адалимумаб (Humira® Abbott Laboratories, человеческое моноклональное антитело против TNF, описанное в патенте США № 6090382 как D2E7). Дополнительные антитела к TNF, которые могут быть использованы в изобретении, описаны в патентах США №№ 6593458; 6498237; 6451983; и 6448380, каждый из которых включен сюда в виде ссылки. В другом варианте осуществления ингибитором TNFα является слитый белок TNF, например этанерцепт (Enbrel®, Amgen; описан в WO 91/03553 и WO 09/406476, включенных сюда в виде ссылки). В другом варианте осуществления ингибитором TNFα является рекомбинантный TNF-связывающий белок (r-TBP-I) (Serono).

Здесь термин «антитело» предполагается относящимся к молекулам иммуноглобулина, состоящим из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (H) цепей и двух легких (L) цепей, связанных дисульфидными мостиками. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращаемую здесь как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращаемую здесь как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен, CL. Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, названные областями, определяющими комплементарность (CDR), рассеянные областями, которые являются более консервативными, названными каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, выстроенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Антитела согласно изобретению описаны более подробно в патентах США №№ 6090382; 6258562; и 6509015, каждый из которых полностью включен в данное описание путем ссылки.

Здесь термин «антигенсвязывающая часть» антитела (или просто «часть антитела») относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hTNFα). Было показано, что антигенсвязывающая функция может выполняться фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином «антигенсвязывающая часть», включают в себя (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) фрагмент F(ab')2, бивалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанные дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий их доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Ward и др. (1989) Nature 341:544-546), который состоит из домена VH; (vi) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH кодируются разными генами, они могут быть объединены с применением способов рекомбинации, с помощью синтетического линкера, который позволяет создать их как единую белковую цепь, в которой области VL и VH соединяются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечные Fv (scFv); см., например, Bird и др. (1988) Science 242:423-426; и Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также подразумеваются как попадающие в термин «антигенсвязывающая часть» антитела. Также включены другие формы одноцепочечных антител, такие как димерные антитела. Димерные антитела представляют собой двухвалентные биспецифичные антитела, в которых домены VH и VL экспрессируются на одной полипептидной цепи, но с использованием линкера, который слишком короткий, чтобы позволять соединяться двум доменам одной и той же цепи, таким образом, вынуждая домены соединяться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антигенсвязывающих сайта (см., например, Holliger и др. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak и др. (1994) Structure 2:1121-1123). Части антител согласно изобретению описаны более подробно в патентах США №№ 6090382, 6258562, 6509015, каждый из которых полностью включен в данное описание путем ссылки.

Связывающие фрагменты получают способами рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Связывающие фрагменты включают в себя Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc, Fv, отдельные цепи, одноцепочечные антитела. Иные, чем «биспецифичные» или «бифункциональные» иммуноглобулины или антитела, следует понимать как иммуноглобулины или антитела, имеющие, каждый, идентичные сайты связывания. «Биспецифичное» или «бифункциональное антитело» представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две разных пары тяжелой/легкой цепи и два разных сайта связывания. Биспецифические антитела могут быть получены различными способами, включая слияние гибридом или сшивание фрагментов Fab'. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny и др., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Здесь термин «консервативная аминокислотная замена» представляет собой одну из таких замен, при которых аминокислотный остаток заменен на остаток другой аминокислоты, имеющей схожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих схожие боковые цепи, определены в данной области, включая основные боковые цепи (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотные боковые цепи (например, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту), незаряженные полярные боковые цепи (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), неполярные боковые цепи (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), бета-разветвленные боковые цепи (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматические боковые цепи (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин).

Термин «химерные антитела» относится к антителам, в которых одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелых и легких цепей гомологична соответствующим последовательностям антител, полученных от определенного вида или принадлежащих конкретному классу, тогда как остальной сегмент цепей гомологичен соответствующим последовательностям от других видов. В одном варианте осуществления изобретение включает в себя химерное антитело или антигенсвязывающий фрагмент, в котором вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепей воспроизводят вариабельные области антител, полученных от одного из видов млекопитающих, в то время как константные области гомологичны последовательностям антител от других видов. В предпочтительном варианте осуществления химерные антитела созданы пересадкой CDR от мышиного антитела на каркасные области человеческого антитела.

Термин «гуманизированные антитела» относится к антителам, которые содержат по меньшей мере одну цепь, содержащую каркасные остатки вариабельной области в основном из цепи человеческого антитела (называемого здесь акцепторным иммуноглобулином или антителом) и по меньшей мере одну область, определяющую комплементарность (CDR), в основном из отличного от человеческого антитела (например, мышиного). В дополнение к пересадке CDR, гуманизированные антитела обычно подвергают дополнительным изменениям с целью улучшения аффинности и/или иммуногенности.

Термин «поливалентное антитело» относится к антителу, содержащему более одного сайта распознавания антигена. Например, «бивалентное» антитело имеет два сайта распознавания антигена, в то время как «тетравалентное» антитело имеет четыре сайта распознавания антигена. Термины «моноспецифичные», «биспецифичные», «триспецифичные», «тетраспецифичные» и т.д. относятся к числу сайтов распознавания антигена с различной специфичностью (в противоположность количеству сайтов распознавания антигена), присутствующих в поливалентном антителе. Например, все сайты распознавания антигена «моноспецифичного» антитела связываются с одинаковым эпитопом. «Биспецифичное» антитело или антитело с «двойной специфичностью» имеет по меньшей мере один сайт распознавания антигена, связывающего первый эпитоп, и по меньшей мере один сайт распознавания антигена, связывающего второй эпитоп, отличный от первого эпитопа. «Поливалентное моноспецифичное» антитело имеет многочисленные сайты распознавания антигена, все из которых связывают одинаковый эпитоп. «Поливалентное биспецифичное» антитело имеет многочисленные сайты распознавания антигена, некоторое число из которых связывает первый эпитоп и некоторое число из которых связывает второй эпитоп, отличный от первого.

Здесь термин «человеческое антитело» подразумевает включение антител, имеющих вариабельные и константные области, образованные из человеческих зародышевых иммуноглобулиновых последовательностей. Человеческие антитела согласно изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими зародышевыми иммуноглобулиновыми последовательностями (например, мутации, введенные случайным или сайт-специфичным мутагенезом in vitro или соматической мутацией in vivo), например, в CDR и, в частности, в CDR3. Тем не менее, используемый здесь термин «человеческое антитело» подразумевает включение антител, в которых последовательности CDR, происходящие из зародышевых последовательностей других видов млекопитающих, таких как мышь, пересажены на человеческие каркасные последовательности.

Здесь термин “рекомбинантное человеческое антитело” предполагает включение всех человеческих антител, получаемых, экспрессируемых, созданных или выделенных рекомбинантными способами, таких как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (описаны дополнительно ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител (описанной дополнительно ниже), антитела, выделенные от животного (например, мыши), трансгенного в отношении человеческих генов иммуноглобулина (см., например, Taylor и др. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287), или антитела, получаемые, экспрессируемые, созданные или выделенные любыми другими способами, вовлекающими встраивание человеческих последовательностей генов иммуноглобулина в другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельные и константные области, образованные из человеческих зародышевых последователей иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления, тем не менее, такие рекомбинантные человеческие антитела подвергаются мутагенезу in vitro (или, когда используется животное, трансгенное в отношении человеческого Ig, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и связаны с человеческими зародышевыми последовательностями VH и VL и происходят от них, могут в действительности не существовать в человеческом зародышевом репертуаре in vivo.

Такие химерные, гуманизированные, человеческие антитела и антитела с двойной специфичностью могут быть получены способами рекомбинантной ДНК, известными в данной области, например, с использованием способов, описанных в международной заявке PCT № PCT/US86/02269; европейской патентной заявке № 184187; европейской патентной заявке № 171496; европейской патентной заявке № 173494; международной заявке PCT № WO 86/01533; патенте США № 4816567; европейской патентной заявке № 125023; Better и др. (1988) Science 240:1041-1043; Liu и др. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu и др. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun и др. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura и др. (1987) Cancer Res. 47:999-1005; Wood и др. (1985) Nature 314:446-449; Shaw и др. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi и др. (1986) BioTechniques 4:214; патенте США No. 5225539; Jones и др. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan и др. (1988) Science 239:1534; и Beidler и др. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060, Queen и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), патентах США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693762, Selick и др., WO 90/07861 и Winter, патент США № 5225539.

Здесь термин “выделенное антитело" предполагается относящимся к антителу, которое по существу свободно от других антител, имеющих различные антигенные специфичности (например, выделенные антитела, которые специфически связываются с hTNFα, по существу свободны от антител, которые специфически связываются с антигенами, иными, чем hTNFα). Выделенные антитела, которые специфически связываются с hTNFα, могут, тем не менее, иметь кросс-реактивность к другим антигенам, таким как молекулы TNFα других видов (описанные более подробно ниже). Более того, выделенные антитела могут быть по существу свободными от иного клеточного материала и/или химикатов.

Здесь термин "нейтрализующее антитело" (или «антитело, нейтрализующее активность hTNFα») предполагается относящимся к антителу, связывание которого с hTNFα приводит к ингибированию биологической активности hTNFα. Это ингибирование биологической активности hTNFα может быть оценено путем измерения одного или нескольких индикаторов биологической активности hTNFα, таких как индуцируемая hTNFα цитотоксичность (или in vitro, или in vivo), индуцируемая hTNFα клеточная активация и связывание hTNFα с рецепторами hTNFα. Эти индикаторы биологической активности hTNFα могут быть оценены одним или несколькими определенными стандартными исследованиями in vitro или in vivo, известными в данной области (см. патент США № 6090382). Предпочтительно способность антитела нейтрализовать активность hTNFα оценивают по ингибированию индуцируемой hTNFα цитотоксичности клеток L929. В качестве дополнительного или альтернативного параметра активности hTNFα может быть оценена способность антитела ингибировать индуцируемую hTNFα экспрессию ELAM-1 на HUVEC, измеренную индуцируемой hTNFα клеточной активацией.

Здесь термин «поверхностный плазмонный резонанс» относится к оптическому феномену, который позволяет анализировать в реальном времени биоспецифические взаимодействия путем обнаружения изменений в концентрациях белка в матрице биосенсора, например, с использованием системы BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ). Для дополнительных описаний см. пример 1 патента США 6258562 и Jönsson и др. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jönsson и др. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson и др. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; и Johnnson и др. (1991) Anal. Biochem.198:268.

Здесь термин «Koff» должен относиться к константе off скорости диссоциации антитела из комплекса антиген/антитело.

Здесь термин «Kd» должен относиться к константе диссоциации конкретного взаимодействия антиген-антитело.

Используемый здесь термин «IC₅₀» должен относиться к концентрации ингибитора, требуемой для подавления интересующей биологической границы, например нейтрализации цитотоксической активности.

Здесь термин «молекула нуклеиновой кислоты» подразумевает включение молекул ДНК и молекул РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК.

Используемый здесь термин «выделенная молекула нуклеиновой кислоты» в отношении нуклеиновых кислот, кодирующих антитела или части антител (например, VH, VL, CDR3), которые связывают hTNFα, должен относиться к молекуле нуклеиновой кислоты, в которой нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело или часть антитела, свободны от других нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела или части антител, которые связывают антигены, отличные от hTNFα, которые могут естественным образом обрамлять нуклеиновую кислоту в человеческой геномной ДНК. Таким образом, например, выделенная нуклеиновая кислота согласно изобретению, кодирующая область VH антитела против hTNFα, не содержит других последовательностей, кодирующих другие области VH, которые связывают антигены, отличные от hTNFα.

Используемый здесь термин «вектор» должен относиться к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Одним из типов векторов является «плазмидный» вектор, который относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальную точку начала репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, не-эписомальные векторы млекопитающих) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицированы вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы способны направлять экспрессию генов, с которыми они оперативно связаны. Такие векторы называются здесь «рекомбинантными экспрессионными векторами» (или просто «экспрессионными векторами»). Как правило, экспрессионные векторы, применяемые в способах с использованием рекомбинантной ДНК, часто представлены в форме плазмид. В представленной спецификации «плазмида» и «вектор» могут быть использованы взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто применяемую форму вектора. Тем не менее, изобретение предполагает включение таких других форм экспрессионных векторов, как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.

Здесь термин «рекомбинантная клетка-хозяин» (или просто «клетка-хозяин») предполагается относящимся к клетке, в которую введен рекомбинантный экспрессионный вектор. Следует понимать, что такие термины предполагаются относящимися не только к конкретной клетке, но и к потомству такой клетки. Поскольку могут происходить некоторые видоизменения в последующих поколениях за счет мутаций или влияния окружающей среды, подобное потомство может быть, фактически, не идентичным родительской клетке, но все еще включенным в область действия используемого здесь термина «клетка-хозяин.

Используемый здесь термин «доза» относится к количеству ингибитора TNFα, введенного субъекту.

Термин «многократно-вариабельная доза» включает в себя различные дозы ингибитора TNFα, которые вводят субъекту для терапевтического лечения. «Режим многократно-вариабельной дозы» или «терапия многократно-вариабельной дозой» описывают расписание лечения, которое основано на введении различных количеств ингибитора TNFα в различные моменты времени в течение курса лечения. Режимы многократно-вариабельной дозы описаны в патентной заявке PCT/US05/12007.

Используемый здесь термин «дозирование» относится к введению вещества (например, антитела против TNFα) для достижения терапевтический цели (например, лечения ревматоидного артрита).

Используемые здесь термины «двухнедельный режим дозирования», «двухнедельное дозирование» и «двухнедельное введение» относятся ко времени курса введения вещества (например, антитела против TNFα) субъекту для достижения терапевтической цели. Двухнедельный режим дозирования не подразумевает включения недельного режима дозирования. Предпочтительно вещество вводят каждые 9-19 дней, более предпочтительно каждые 11-17 дней, еще более предпочтительно каждые 13-15 дней и наиболее предпочтительно каждые 14 дней.

Термин «комбинация», например, в выражении «первый агент в комбинации со вторым агентом» включает совместное введение первого агента и второго агента, которые, например, могут быть растворены или перемешаны в одном и том же фармацевтически приемлемом носителе, или введение первого агента с последующим введением второго агента, или введение второго агента с последующим введением первого агента. Представленное изобретение, таким образом, включает в себя способы комбинирования терапевтического лечения и комбинирования фармацевтических композиций.

Термин «сопутствующий», например, в выражении «сопутствующее терапевтическое лечение» включает введение агента в присутствии второго агента. Способ сопутствующего терапевтического лечения включает в себя способы, в которых первый, второй, третий или дополнительные агенты вводят совместно. Способ сопутствующего терапевтического лечения также включает в себя способы, в которых первый или дополнительные агенты вводят в присутствии второго или дополнительных агентов, где второй или дополнительные агенты, например, могли быть введены предварительно. Способ сопутствующего терапевтического лечения может быть использован по стадиям разными исполнителями. Например, один исполнитель может ввести субъекту первый агент, а второй исполнитель может ввести субъекту второй агент, и стадии введения могут быть выполнены одновременно, или почти одновременно, или в разное время, пока первый агент (и дополнительные агенты) присутствует после введения в присутствии второго агента (и дополнительных агентов). Исполнитель и субъект могут быть одним и тем же лицом (например, человеком).

Здесь термин «комбинированная терапия» относится к введению двух или более терапевтических субстанций, например антитела против TNFα и другого препарата. Другой препарат(ы) может быть введен сопутствующим образом, перед или после введения антитела против TNFα.

Здесь термин «набор» относится к упакованному продукту, содержащему компоненты для введения антитела против TNFα согласно изобретению для лечения связанного с TNFα расстройства. Набор предпочтительно включает коробку или контейнер, содержащий компоненты набора. Коробка или контейнер снабжен меткой или одобренным управлением по контролю за продуктами и лекарствами протоколом. Коробка или контейнер содержит компоненты согласно изобретению, которые предпочтительно упакованы в пластиковые, полиэтиленовые, полипропиленовые, этиленовые или пропиленовые сосуды. Сосуды могут быть тюбиками с крышкой или бутылочками. Набор может также включать в себя инструкции по применению антитела против TNFα согласно изобретению. В одном варианте осуществления набор согласно изобретению включает в себя композицию, содержащую человеческое антитело D2E7, как описано в PCT/IB03/04502 и патентной заявке США № 10/222140.

Различные аспекты изобретения описаны здесь более подробно.

II. Биомаркеры деградации хряща и спондилита

Существует потребность во введении поддающегося измерению инструмента оценки анкилозирующего спондилита (AS) с тем, чтобы иметь возможность определить улучшения, особенно ранние структурные улучшения, у пациентов с AS, подвергаемых лечению ингибитором TNF. В настоящее время наиболее часто используемыми способами оценки активности AS являются скорость оседания эритроцитов (ESR) и уровень С-реактивного белка (CRP), тем не менее, этих маркеров недостаточно для оценки активности заболевания AS (Ruof and Stucki (1999) J Rheumatol 26:966). В изобретении предложены биомаркеры, которые применимы при оценке способности лечения против TNF предотвращать структурные повреждения, ассоциированные с AS, у пациента. В дополнение, в изобретении предложен способ определения ответа пациента на улучшения в структурном разрушении суставов, ассоциированном с AS. Способы, описанные здесь, распознают изменения в прогрессировании структурных повреждений у пациента, которые могут быть не столь заметными при использовании более традиционных путей, таких как радиография. Способы согласно изобретению полезны, поскольку они предоставляют возможности для терапевта определить эффективность лечения против TNF у пациента без необходимости ждать клинических результатов, что может занимать длительные периоды времени.

В общем, изобретение включает в себя сравнение уровней биомаркеров у пациентов, имеющих AS или с подозрением на AS, с известным стандартным уровнем, ассоциированным с активностью болезни, для определения того, повышается ли уровень биомаркера пациента, уменьшается или является одинаковым по сравнению с контролем. При определении эффективности ингибитора TNF в лечении AS у пациента, особенно в отношении улучшения структурных повреждений, уровни биомаркера могут быть определены заранее или, альтернативно, могут включать в себя получение образца от пациента и затем использование уровня биомаркера, определенного по образцу в сравнительной оценке согласно изобретению.

В изобретении идентифицированы определенные биомаркеры, ассоциированные со структурным разрушением, включая деградацию хряща и синовит, которые могут быть использованы для определения, является ли выбранная терапия против TNF достаточной для лечения или должна быть рассмотрена другая терапия, включая другую терапию против TNF. Такие способы прогнозирования приносят пользу общему здоровью субъекта, поскольку для определения соответствующей терапии могут быть предприняты более быстрые шаги. Способы, описанные здесь, также снижают общую стоимость процесса лечения за счет более быстрой отмены неэффективной терапии.

В изобретении предложен способ определения эффективности ингибитора TNF в лечении спондилоартропатии, например, анкилозирующего спондилита, включающий в себя измерение биомаркеров разрушения хряща и синовита. Эффективность определяют по способности ингибитора TNF уменьшать биомаркеры, известные как отражающие активность болезни, относящейся к деградации хряща и/или синовиту у субъекта.

В одном варианте осуществления изобретение включает в себя способ определения эффективности ингибитора TNFα, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в отношении анкилозирующего спондилита (AS), когда определяемый заранее уровень биомаркера деградации коллагена или биомаркера синовита у пациента, имеющего AS, после лечения ингибитором TNFα (уровень биомаркера после лечения) сравнивают с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, ассоциированным с болезненным состоянием. После сравнения двух уровней определяют, снижается ли уровень биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем, причем снижение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента после лечения ингибитором TNFα по сравнению с известным стандартным уровнем указывает на эффективность ингибитора TNFα в лечении AS.

В другом варианте осуществления изобретения предложен способ определения эффективности ингибитора TNF, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в отношении анкилозирующего спондилита (AS), включающий в себя сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, полученного у пациента с AS перед лечением, с уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, полученным у указанного пациента после лечения, причем снижение уровня биомаркера после лечения указывает на эффективность ингибитора TNF в лечении AS у пациента.

Ингибитор TNF может быть использован для уменьшения или предотвращения структурных повреждений, ассоциированных с AS, путем понижения уровня биомаркера, ассоциированного с деградацией хряща и/или синовитом. В одном аспекте изобретения предложен способ мониторинга эффективности ингибитора TNF, например, человеческого антитела к TNFα или его антигенсвязывающей части в уменьшении прогрессирования структурных повреждений, ассоциированных с анкилозирующим спондилитом (AS) у пациента, включающий в себя определение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента и сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита, ассоциированным с AS. В этом случае уменьшение уровня биомаркера у пациента по сравнению с известным стандартным уровнем указывает на то, что ингибитор TNF эффективен в уменьшении прогрессирования структурных повреждений, ассоциированных с AS, у пациента.

В другом аспекте изобретения предложен способ прогнозирования эффективности ингибитора TNF, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в лечении AS у пациента, включающий в себя сравнение заранее определяемого уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента после лечения человеческим антителом против TNFα или его антигенсвязывающей частью с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента, имеющего AS. Основываясь на двух уровнях биомаркеров, производят оценку того, снижается ли уровень биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита. В этом случае снижение уровня биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита у пациента по сравнению с известным стандартным уровнем указывает на то, что можно прогнозировать, что человеческое антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть будут эффективны в лечении AS у пациента.

В описанных выше ситуациях, когда определено, что ингибитор TNF эффективен для уменьшения биомаркеров, ассоциированных с деструкцией хряща и/или синовита, которая, в свою очередь, отражает уменьшение в структурной деструкции, например разрушении суставов, может быть рассмотрено продолжение лечения ингибитором TNF. В одном варианте осуществления может быть рассмотрено назначение пациенту того же режима дозирования. Альтернативно, может быть рассмотрено снижение дозы ингибитора TNF, показанной как эффективная при лечении AS у пациента.

В изобретении предложен способ использования биомаркера разрушения хряща, отдельно или в комбинации с биомаркером синовита, так же как и способ использования биомаркера синовита, отдельно или в комбинации с биомаркером деградации хряща, для определения эффективности лечения AS ингибитором TNF.

Дополнительно может быть выполнен анализ биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита на образце от пациента, который еще не получал лечения ингибитором TNF. Анализ биомаркера деградации коллагена и биомаркера синовита может быть выполнен для определения, будет ли пациент, скорее всего, отвечать на лечение антителом против TNFα, например адалимумабом. Сравнимые уровни биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита из образца пациента относительно известного стандартного уровня, охарактеризованного как уровень, показательный для AS, может указывать на то, что пациент страдает AS и, таким образом, будет кандидатом на лечение ингибитором TNF. Соответственно, такой пациент может быть выбран для лечения антителом против TNFα, например адалимумабом, с целью предотвращения структурных повреждений, которые могут случиться в процессе развития болезни.

В одном варианте осуществления контрольный уровень основан на собственном исходном уровне биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита пациента, где исходный уровень определяют перед лечением ингибитором TNF. В таком случае уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита, который определяют после лечения, сравнивают с исходным уровнем пациента. После этого производят определение, является ли ингибитор TNF эффективным, на основании снижения уровня биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита у пациента после лечения. В другом варианте осуществления основной уровень, используемый в качестве контроля, основан на собственном уровне биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита у пациента в определенной точке в процессе лечения ингибитором TNF, причем основной уровень в определенной временной точке в процессе лечения сравнивают с уровнем биомаркера в выбранное после этого время, в то время как пациент продолжает находиться на лечении.

В одном варианте осуществления известный стандартный уровень основан на общепринятом уровне биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита, ассоциированного с болезненным состоянием, например, ассоциированным с пациентом(ами), имеющим AS. Известный стандартный уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита может быть основан на единственном пациенте с AS или, альтернативно, на среднем значении, полученном от группы пациентов с AS. Например, в одном варианте осуществления известный стандартный уровень сывороточного MMP-3 для пациента с AS находится между приблизительно 10-200, приблизительно 15-180, приблизительно 20-140, приблизительно 30-120, приблизительно 40-100, приблизительно 50-80, приблизительно 25-57 или приблизительно 60-70 нг/мл. В другом варианте осуществления известный стандартный уровень мочевого CTX-II для пациента с AS составляет между приблизительно 300-1000, приблизительно 300-800, приблизительно 300-600, приблизительно 315-395, приблизительно 320-390, приблизительно 325-385, приблизительно 330-380, приблизительно 325-385, приблизительно 324-388, приблизительно 335-375, приблизительно 340-370, приблизительно 345-365 или приблизительно 350-360 нг/мл.

Альтернативно, в другом варианте осуществления известный стандартный уровень может быть основан на уровнях биомаркеров деградации хряща и/или синовита от здорового, интактного субъекта(ов). Известный стандартный уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита может быть основан на одном интактном здоровом субъекте или, альтернативно, на среднем значении для группы интактных здоровых субъектов. Примеры нормальных значений мочевого CTX-II, т.е. значения здоровых, не имеющих AS субъектов описаны у Haima (2005) Osteo Medical Group Clinical and Technical Monograph и Mouritzen и др. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332. Например, в одном варианте осуществления известный стандартный уровень сывороточного MMP-3 у интактного здорового субъекта составляет приблизительно от 13 до 15 нг/мл (см. Chen и др. (2006) Rheumatology 45:414).

Значения, находящиеся между указанными выше уровнями биомаркера, например приблизительно от 323 до приблизительно 329 мг/мл мочевого CTX-II, также предполагаются как часть изобретения. В дополнение, границы значений, использующие комбинации любых приведенных выше значений в качестве верхних и/или нижних границ, предполагаются включенными. В дополнение, верхние границы, описанные выше, не подразумевают ограничений в отношении увеличенных уровней MMP-3 и CTX-II у пациентов с AS.

Уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита считается изменившимся относительно контроля, т.е. собственного уровня пациента перед лечением или известного стандартного уровня, если уровень или выше/увеличен, или ниже/уменьшен относительно контроля. В одном варианте осуществления уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита, полученный от пациента с AS, считается выше/увеличенным по сравнению с контрольным уровнем, если уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита выше/увеличен по сравнению с контрольным уровнем на значение, большее, чем стандартная ошибка измерения, применимая к оценке уровня. В одном варианте осуществления уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита, полученный от пациента с AS, считается ниже/уменьшенным по сравнению с контрольным уровнем, если уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита ниже/уменьшен по сравнению с контрольным уровнем на значение, большее, чем стандартная ошибка измерения, применимая к оценке уровня. В другом варианте осуществления уровень биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита, полученный у больного пациента, может быть сочтен выше/увеличенным или ниже/уменьшенным по сравнению с контрольным уровнем, если разница в контрольном уровне и в уровне биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита, полученного из образца пациента, по меньшей мере в два, три, четыре или пять раз выше или ниже, чем стандартная ошибка измерений контроля и образца.

В одном варианте осуществления эффективность ингибитора TNF показана в случае, когда уровни CTX-II у субъекта, имеющего AS, уменьшаются по меньшей мере на приблизительно 5-100%, приблизительно 5-80%, приблизительно 5-60%, приблизительно 5-45%, приблизительно 5-40%, приблизительно 5-35%, приблизительно 5-30%, приблизительно 5-25%, приблизительно 5-20%, приблизительно 5-15%, приблизительно 5-10%, приблизительно 6-9%, приблизительно 7-8% или приблизительно 9% относительно основного уровня или известного стандартного уровня. В одном варианте осуществления эффективность ингибитора TNF показана в случае, когда уровни MMP-3 уменьшаются по меньшей мере на приблизительно 5-50%, приблизительно 5-45%, приблизительно 5-40%, приблизительно 5-35%, приблизительно 5-30%, приблизительно 5-25%, приблизительно 5-20%, приблизительно 5-15%, приблизительно 5-13%, приблизительно 6-12%, приблизительно 7-11% или приблизительно 8% относительно основного уровня или известного стандартного уровня у пациента, имеющего AS. В другом варианте осуществления эффективность ингибитора показана, когда уровни MMP-3 уменьшились по меньшей мере приблизительно на 12% по отношению к основному уровню или известному стандартному уровню у пациента, имеющего AS.

Диапазоны, средние по отношению к указанным выше уровням биомаркера, например, приблизительно от 8 до приблизительно 10%, также подразумеваются как часть данного изобретения. В дополнение, диапазоны значений, использующие комбинацию любых указанных выше значений как верхние и/или нижние пределы, тоже подразумеваются как включенные. Дополнительно, верхние процентные значения, описанные выше, не подразумеваются как ограничивающие по отношению к процентам уменьшения уровней MMP-3 и CTX-II у пациентов с AS, например, более высокий процент уменьшения также рассматривается изобретением.

Биомаркеры деградации хряща

Суставный хрящ состоит почти полностью из основанной на коллагене-II сети волокон, связанной с протеогликановым аггреканом (см. Poole AR, 2003. Rheum Dis Clin North Am 29:803-818 и Eyre (1991)Semin Arthritis Rheum. 21(3 Suppl 2)^2-11). При болезни суставов коллаген II типа постепенно расщепляется коллагеназами. Коллаген II типа деградирует так, что продукты процесса деградации распределяются на три группы в соответствии с локализацией определенного эпитопа в молекуле коллагена (для описания см. Birmingham и др. (2006) Biomarker Insights 2:61, включено в данное описание в виде ссылки). Различные типы эпитопов, включая неоэпитопы и эпитопы телопептида, могут быть использованы в качестве индикаторов событий разрушения, ассоциированных с коллагеном.

Зрелый коллаген II типа состоит из тройной спиральной структуры с короткими телопептидами с обоих концов. Телопептиды, ковалентно поперечно-связанные с другими нитями коллагена, служат для соединения отдельных молекул коллагена в жесткую волокнистую сеть. Фрагменты зрелого коллагена образуются, когда разрушается внеклеточная хрящевая матрица. Такие фрагменты могут быть найдены как в сыворотке, так и в моче, и могут быть измерены в виде маркеров катаболизма хряща. Телопептиды включают в себя col2CTx и CTX-II (WO 91/08478; Christgau и др. (2001) Bone 29:209; Matyas и др. (2004) Arthritis Rheum 50:543; и Eyre (1989) «Peptide fragments containing HP and LP cross-links», USP 5702909, каждый из которых включен здесь в виде ссылки).

Протеолиз приводит к потере эпитопов коллагена типа II в жидкостях организма, таким образом, путем исследования эпитопов коллагена II типа в жидкостях организма может быть определено количество разрушенного коллагена (см. Birmingham и др. (2006) Biomarker Insights 2:61 и Christgau и др. (2001) Bone 29:209, каждый из которых включен в данное описание). Способность отслеживать и замедлять или обращать процесс деградации коллагена важна с точки зрения клиники, поскольку широкая деградация волокон зрелого поперечно-связанного коллагена II типа считается критической, возможно даже необратимой, стадией разрушения сустава (Billinghurst и др. (1997)).

В описанном здесь изобретении используются биомаркеры деградации хряща для определения эффективности ингибитора TNF в лечении AS, который имеет компонент заболевания, включающий в себя структурные повреждения, например повреждения суставов. В одном варианте осуществления CTX-II, локализованный почти исключительно в хряще, используют в способах и композициях согласно изобретению в качестве биомаркера распада хряща.

CTX-II

В предпочтительном варианте осуществления биомаркером деградации коллагена является С-телопептид коллагена II типа (CTX-II). CTX-II представляет собой фрагмент коллагена, происходящий от С-конца коллагена II типа. CTX-II идентичен неопептиду Col2CTx, обнаруженному на С-конце фрагмента в 1/4 длины расщепленного коллагена II типа (для описания см. Birmingham и др. (2006), включенный здесь в виде ссылки).

CTX-II известен как биомаркер деградации хряща. Сначала CTX-II ассоциировали с деградацией хряща у пациентов с остеоартритами коленей (Garnero и др. (2001) Annals Rheum Dis 60:619), причем было определено дальнейшее повышение CTX-II в моче пациентов с серьезными остеоартритами (Jung и др. (2004) Pathobiol 71:70). Также показана корреляция CTX-II со степенью разрушения суставов (Christgau и др. (2001) Bone 29:209; Garnero and Delmas (2003) Curr Op Rheumat 25:641).

В одном аспекте изобретения предложен способ определения эффективности ингибитора TNFα в лечении AS у пациента, включающий в себя сравнение заранее определяемого уровня CTX-II у пациента после лечения ингибитором TNFα с известным стандартным уровнем CTX-II, ассоциированным с AS. Была произведена оценка, касающаяся взаимоотношений между двумя уровнями CTX-II для определения того, снижается ли уровень CTX-II пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем CTX-II. Снижение уровня CTX-II по сравнению с известным стандартным уровнем, представляющим болезненное состояние AS, указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в лечении AS у пациента. В этом случае известный стандартный уровень будет представлять уровень CTX-II у субъекта, имеющего активное заболевание AS, то есть пораженного, не подвергнутого лечению пациента.

В другом аспекте изобретения предложен способ определения эффективности ингибитора TNFα в уменьшении структурных повреждений, ассоциированных с анкилозирующим спондилитом (AS) у пациента, включающий в себя сравнение заранее определяемого уровня CTX-II у пациента, имеющего AS, после лечения ингибитором TNFα с известным стандартным уровнем CTX-II, ассоциированным с AS. Затем производят оценку в отношении двух уровней CTX-II для определения того, снижается ли уровень CTX-II пациента после лечения по сравнению с известным стандартным уровнем CTX-II. Если уровень CTX-II пациента ниже, чем известный стандартный уровень CTX-II, то такой результат указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в уменьшении структурных повреждений, ассоциированных с AS, у пациента.

В одном варианте осуществления изобретение связано со способом определения эффективности ингибитора TNFα в лечении AS у пациентов, включающим в себя сравнение предварительно определяемого уровня CTX-II, полученного у пациента после лечения, с предварительно определяемым уровнем CTX-II, полученным у пациента перед лечением. В отношении двух уровней CTX-II производят оценку для определения того, снижается ли уровень CTX-II после лечения по сравнению с уровнем CTX-II перед лечением, причем снижение уровня CTX-II после лечения по сравнению с уровнем CTX-II перед лечением указывает на то, что ингибитор TNFα эффективен в лечении AS у пациента.

Биомаркеры синовита

Синовит (воспаление) известен возникновением на ранних стадиях воспалительных заболеваний, таких как остеоартриты, и ассоциирован с радиологическим прогрессированием болезни. Процесс, при котором воспаление, включая доклинические воспаления, может обострять повреждения суставов, вероятно, вовлекает изменения функции хондроцитов, увеличение ангиогенеза и/или ускоренное ремоделирование кости (Bonnet and Walsh DA (2005) Rheumatology 44:16). В описанном здесь изобретении используются синовиальные биомаркеры для определения эффективности ингибитора TNF в лечении AS. В одном варианте осуществления сыворотку MMP-3, которая, вероятно, возникает в воспаленном суставе (Kruithof и др. (2005) Arthritis Rheum 52:3898), используют в качестве биомаркера синовита для определения эффективности ингибитора TNF в лечении AS.

MMP-3

Деградация молекул хрящевого матрикса включает в себя цинк-зависимые эндопептидазы, а именно матриксные металлопротеиназы (MMP). MMP, группа Zn2⁺-зависимых эндопептидаз, расщепляют составляющие внеклеточного матрикса (ECM), такого как коллагены и протеогликаны. MMP являются медиаторами различных физиологических процессов путем разрушения компонентов внеклеточного матрикса.

MMP-3 представляет собой фермент, который разрушает фибронектин, ламинин, коллагены III, IV, IX и X и протеогликаны хряща. В настоящее время существует по меньшей мере 20 типов человеческих MMP, которые сгруппированы в соответствии со структурой и специфическими субстратами: коллагеназы (MMP-1, -8, -13), стромелизина, желатиназы (MMP-2, -9) и плазменных связанных с мембраной металлопротеиназ (см., например, Nabeshima K и др. 2002 Pathol Int 52: 255-64).

В предпочтительном варианте осуществления биомаркером синовита, используемым в изобретении, является MMP-3. Показано увеличение уровней MMP-3 в сыворотке при ревматоидных воспалительных заболеваниях, характеризуемых суставными синовитами, такими как RA, ревматическая полимиалгия, псориатический артрит и острый кристаллический артрит. Уровни сыворотки MMP-3 приняты как отражающие суставное воспаление (см. Ribbens и др. (2002) Annals of the Rheumatic Diseases 61:161). В дополнение, предшествующие исследования связали матриксные металлопротеиназы (MMP), особенно MMP-3 (стомелизин 1) со значением индекса активности анкилозирующего спондилита Bath (BASDAI) у пациентов с AS (см. Yang, C. и др. (2004) Arthritis Rheum 51:691-9).

Аминокислотная последовательность MMP-3 известна и может быть найдена, например, в GenBank под номером AAI07491. Нуклеотидная последовательность MMP-3 также известна и может быть найдена, например, в GenBank под номером NM002422.

Изобретение дополнительно включает в себя использование биомаркера деградации хряща, например, CTX-II и биомаркера синовита, например MMP-3, по одному или в комбинации друг с другом, для выполнения способов согласно изобретению. В дополнение, каждый биомаркер может быть использован в комбинации с C-реактивным белком для дальнейшего определения эффективности ингибитора TNF в лечении AS.

Уровни С-реактивного белка (CRP) могут быть использованы в комбинации с биомаркером деградации хряща, например CTX-II, и биомаркером синовита, например MMP-3, в качестве индикатора болезненного состояния AS и эффективности выбранной терапии против TNF. CRP принадлежит к семейству белков пентраксина, названному так потому, что он содержит пять одинаковых субъединиц, кодируемых одним геном на хромосоме 1, которые ассоциируют с образованием стабильной дискообразной пятимерной структуры. CRP образуется исключительно в печени и секретируется в увеличенных количествах в течение 6 часов после острых воспалительных стимулов. Повышенные уровни CRP представляют собой чувствительный признак происходящего воспаления и, таким образом, обеспечивают важное дополнение к осторожной клинической оценке.

Исследования для определения уровня биомаркеров

Уровень биомаркера деградации хряща и/или синовита в образце можно анализировать несколькими способами, известными в данной области. Когда образец получен от пациента, может быть использован любой известный в данной области способ, подходящий для обнаружения и количественной оценки биомаркера деградации хряща или синовита для применения в способах согласно изобретению (либо на уровне нуклеиновой кислоты, либо, предпочтительно, на уровне белка). Такие способы хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются ими, вестерн-блоты, нозерн-блоты, саузерн-блоты, иммуногистохимию, ELISA, например амплифицированный ELISA, количественный анализ крови, например сывороточный ELISA, количественный анализ мочи, например, для установления уровней белковой экспрессии или деградации в случае CTX-II, иммунопреципитацию, иммунофлуоресценцию, проточную цитометрию, иммуноцитохимию, масс-спектрометрический анализ, например MALDI-TOF и SELDI-TOF, методики гибридизации нуклеиновой кислоты, способы обратной транскрипции нуклеиновой кислоты и способы амплификации нуклеиновой кислоты. Примеры таких анализов описаны более подробно ниже.

Основанные на белках анализы

Способы по изобретению могут быть выполнены с использованием основанных на белках анализов для определения уровня выбранного биомаркера. Примеры основанных на белках анализов включают в себя иммуногистохимические и/или вестерн-анализы, количественные основанные на крови анализы, например сывороточный ELISA, и количественный основанный на моче анализ, например ELISA мочи. В одном варианте осуществления иммуноанализы осуществляют для предоставления количественной оценки выбранного биомаркера.

Белки из образцов пациента могут быть выделены с использованием методик, хорошо известных специалистам в данной области. Используемые способы выделения белка могут быть, например, такими, как способы, описанные у Harlow and Lane (Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).

Количество биомаркера деградации хряща или синовита может быть определено количественной оценкой соответствующего экспрессируемого полипептида. Полипептид может быть обнаружен и оценен количественно любым из нескольких способов, известных специалисту в данной области. Они могут включать в себя аналитические биохимические способы, такие как электрофорез, капиллярный электрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), тонкослойная хроматография (TLC), гипердиффузионная хроматография и тому подобное, или различные иммунологические способы, такие как реакции преципитации в жидкости или геле, иммунодиффузия (одинарная или двойная), иммуноэлектрофорез, радиоиммунный анализ (RIA), иммуноферментный анализ (ELISA), иммунофлуоресцентный анализ и вестерн-блоттинг.

В одном варианте осуществления уровень биомаркера деградации хряща или синовита может быть определен с использованием иммуноанализа. Антитела, направленные на биомаркеры, описанные здесь, могут быть использованы для отсева биологических образцов человека, например жидкостей, на предмет уровней определенного антигена-биомаркера, например биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита. В целях иллюстрации жидкости организма, такие как сыворотка крови или моча, могут быть получены у пациента и исследованы на определенный эпитоп, или как освобожденный антиген, или связанный с мембраной клеток в жидкости образца, с использованием антител против биомаркеров, например, в стандартных анализах RIA или ELISA, известных в данной области. Антитела, используемые в таких способах, предпочтительно являются моноклональными антителами. В одном варианте осуществления иммуносерологическая оценка in vitro сыворотки, извлеченной у пациента, таким образом, позволяет неинвазивное определение прогрессирования или уменьшения дегенерации хряща, так же как и увеличение или уменьшение синовита на основании уровня соответствующих биомаркеров в сыворотке. В одном варианте осуществления проводили иммуноанализ для количественной оценки деградации хряща, измеряя уровень CTX-II в моче человека. В одном варианте осуществления проводили иммуноанализ для количественной оценки синовита, измеряя уровни MMP-3 в сыворотке человека.

В иммуноанализах агентом для обнаружения полипептидных биомаркеров деградации хряща или синовита может быть любое антитело, способное связывать белок биомаркера деградации хряща или синовита. Антитела могут быть поликлональными или, более предпочтительно, моноклональными. Могут быть использованы интактные антитела или их фрагменты (например, Fab или F(ab')₂.

В одном варианте осуществления антитела, направленные на CTX-II, включая мочевой CTX-II, используют в иммуноанализах, например ELISA, для определения уровня CTX-II в образце от пациента, имеющего AS. В одном варианте осуществления уровни CTX-II могут быть измерены либо в образцах мочи, либо в образцах сыворотки пациента. В одном варианте осуществления антитело, которое может быть использовано в способах и композициях согласно изобретению для обнаружения и количественной оценки мочевого CTX-II человека, представляет собой моноклональное антитело mAbF46 (см. Christgau и др. (2001) Bone 29:209) и F4601 (см. Oestergaard и др. (2006) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670).

В одном варианте осуществления антитела, направленные на MMP-3, включая сывороточный MMP-3, используют для иммуноанализов, например ELISA, для определения уровня MMP-3 в образце от пациента, имеющего AS. В одном варианте осуществления MMP-3 может быть измерен в образцах сыворотки пациента. В одном варианте осуществления антитело для обнаружения и количественной оценки мочевого MMP-3 человека представляет собой моноклональное антитело mAb1B4 (Murray GI и др. Gut 43:791-7 (1998)).

Анализы с применением конкурентного связывания могут быть использованы для определения уровня белка, соответствующего биомаркеру деградации коллагена и/или синовита. Один из примеров анализа с применением конкурентного связывания представляет собой связанный с ферментом иммуносорбентный сэндвич-анализ (ELISA). ELISA может быть использован для обнаружения присутствия биомаркера деградации коллагена и/или биомаркера синовита в образце. ELISA является чувствительным иммуноанализом, в котором используется фермент, связанный с антителом или антигеном, в качестве маркера для обнаружения специфичного белка, особенно антигена или антитела. ELISA представляет собой анализ, в котором связанный антиген или антитело определяют по связанному ферменту, который обычно превращает бесцветный субстрат в окрашенный продукт или в продукт, который может быть обнаружен. Одним из наиболее обычных типов ELISA является «сэндвич-ELISA». В одном варианте осуществления уровень биомаркера деградации хряща и/или синовита определяют с применением ELISA.

В дополнение, опытный специалист может быстро адаптировать известные способы определения белка/антитела для использования при определении количества маркера в представленном изобретении (например, CTX-II и/или MMP-3).

Способы определения CTX-II в качестве биомаркера для разрушения суставов известны в данной области и описаны, например, у Oestergaard и др. (2006) Osteoarthritis Cartilage. 14(7):670 и Mouritzen и др. (2003) Annals of the Rheumatic Diseases 62:332, включенных здесь в виде ссылки. Анализы для определения уровней CTX-II коммерчески доступны, включая, например, Urine Cartilaps® и Serum Cartilaps® (Nordic Bioscience Diagnostics). Тест Urine Cartilaps® используется в клинических исследованиях для количественного определения деградации хряща при ревматоидных артритах и остеоартритах. Например, Urine CartiLaps® ELISA основан на конкурентном связывании моноклонального антитела с мочевыми фрагментами коллагена II типа, например CTX-II, или с биотинилированными синтетическими пептидами, связанными с поверхностью микропланшетов для титрования, покрытых стрептавидином. Сначала биотинилированные синтетические пептиды связаны с поверхностью покрытых стрептавидином лунок микропланшетов для титрования. После отмывки стандартные, контрольные и мочевые пробы вносят пипетированием в лунки с последующим добавлением раствора моноклонального антитела. Лунки промывают и добавляют в лунки раствор конъюгированного с пероксидазой кроличьего иммуноглобулина против мышиных антител. После второй стадии промывки во все лунки вносят хромогенный субстрат и цветную реакцию останавливают серной кислотой, после чего измеряют абсорбцию. Дополнительные примеры, касающиеся измерения CTX-II с использованием ELISA, описаны у Christgau (2001 Bone 29:209, включенном здесь в виде ссылки).

В одном варианте осуществления проводили иммуноанализы для определения уровня биомаркера синовита (MMP-3) в сыворотке человека. Способы определения MMP-3 как биомаркера синовита известны в данной области и описаны, например, у Tamarat и др. (2003) PNAS 100:8555. В дополнение, доступны коммерческие наборы для тестирования уровней белка MMP-3, включая Human Matrix Metalloproteinase-3 Biotrak ELISA system (Amersham) (см. также Yang и др. (2004) Arthritis and Rheumatism 51:691). Дополнительные примеры, описывающие, как исследовать белок MMP-3, описаны у Chen и др. (2006) Rheumatology 45:414.

В одном варианте осуществления антитела или фрагменты антител используют в способах, таких как вестерн-блот или иммунофлуоресцентные методики, для обнаружения экспрессируемых белков. В таких применениях, как правило, предпочтительно иммобилизировать или антитело, или белки на твердой основе. Подходящие твердофазные основы включают в себя любые основы, способные связывать антиген или антитело. Хорошо известные основы или носители включают в себя стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, нейлон, амилазы, естественные и модифицированые целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит.

Специалисту в данной области будут известны многие другие подходящие носители для связывания антитела или антигена, и он будет способен адаптировать их для использования в настоящем изобретении. Например, белок, выделенный из клеток, может быть разделен электрофорезом в полиакриламидном геле и иммобилизован на твердофазной основе, такой как нитроцеллюлоза. Основа может быть отмыта подходящими буферами с последующей обработкой детектируемым меченым антителом. Затем твердофазная основа может быть промыта буфером второй раз для удаления несвязанного антитела. Количество связанной метки на твердой основе может быть затем обнаружено обычными способами. Способы обнаружения белков с применением электрофоретических методик хорошо известны специалистам в данной области (см. в основном R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y.; Deutscher, (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., N.Y.).

Другие стандартные способы с использованием антител для обнаружения и количественной оценки маркеров деградации коллагена и/или синовита включают в себя, но не ограничиваются ими, радиоиммунный анализ (RIA), рецепторный анализ, ферментный иммуноанализ (EIA), цитохимический биоанализ, лигандный анализ, иммунорадиометрический анализ, флуороиммунный анализ и связанный с ферментом иммуносорбентный анализ (ELISA). Другие способы включают в себя, для простоты детекции и ее количественной природы, сэндвич-анализ или двойной анализ с антителами, в котором существует большое число вариаций, все из которых подразумеваются в рамках представленного изобретения. Эти способы хорошо известны, и специалисту в данной области будет понятно, что требуется некоторое количество экспериментов для оптимизации взаимодействия между антителами и антигенами и детекции антигенов антителами. Эти и другие методики иммуноанализов могут быть найдены в Principles And Practice Of Immunoassay, 2nd Edition, Price and Newman, eds., MacMillan (1997) and Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Ch. 9 (1988), каждый из которых полностью включен здесь в виде ссылки.

Антитела, используемые в иммуноанализах, известные в данной области и описанные здесь при определении уровней биомаркеров, могут быть помечены обнаруживаемой меткой. Термин «помечены» по отношению к зонду или антителу предполагается включающим прямое мечение зонда или антитела сочетанием (например, физическим связыванием) детектируемого вещества с зондом или антителом, так же как и непрямое мечение зонда или антитела по реакции с другим реагентом, который помечен непосредственно. Примеры непрямого мечения включают в себя детекцию первичного антитела с использованием флуоресцентно меченного вторичного антитела и концевое мечение ДНК зонда биотином, так что он может быть обнаружен флуоресцентно меченным стрептавидином.

В одном варианте осуществления антитело является меченным, например, радиоактивной меткой, хромофором, флуорофором или ферментом. В другом варианте осуществления антитело является модифицированным (например, антитело, конъюгированное с субстратом, или с белком, или с лигандом, или с парой белок-лиганд (например, биотин-стрептавидин), или фрагментом антитела (например, одноцепочечным антителом, выделенным гипервариабельным доменом антитела и т.п.), который специфически связывается с белком-биомаркером деградации хряща или синовита).

В одном варианте осуществления способы протеомики, например масс-спектрометрия, используют для детекции и количественной оценки биомаркера деградации хряща или синовита. Например, времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-TOF MS) или времяпролетная масс-спектрометрия с лазерной ионизацией и поверхностным усилением (SELDI-TOF MS), которые включают в себя применение биологического образца, такого как сыворотка, к белок-связывающему чипу (Wright, G.L., Jr., и др. (2002) Expert Rev Mol Diagn 2:549; Li, J., и др. (2002) Clin Chem 48:1296; Laronga, C., и др. (2003) Dis Markers 19:229; Petricoin, E.F., и др. (2002) 359:572; Adam, B.L., и др. (2002) Cancer Res 62:3609; Tolson, J., и др. (2004) Lab Invest 84:845; Xiao, Z., и др. (2001) Cancer Res 61:6029), могут быть использованы для количественной оценки уровня биомаркера деградации хряща или синовита. Масс-спектрометрические способы описаны, например, в патентах США №№ 5622824, 5605798 и 5547835, полное содержание которых включено здесь в виде ссылки.

РНК

В одном варианте осуществления уровень мРНК, кодирующей указанный биомаркер, может быть измерен с использованием способов, известных специалисту в данной области, например нозерн-анализ. Экспрессия генов биомаркера может быть обнаружена на уровне РНК. РНК может быть экстрагирована из клеток с использованием способов экстракции РНК, включающих в себя, например, использование кислотной фенольно-гуанидин-изотиоцианатной экстракции (RNAzol B; Biogenesis), Rneasy-наборов для получения РНК (Qiagen) или PAXgene (PreAnalytix, Switzerland). Типичные форматы анализов с использованием гибридизации рибонуклеиновой кислоты включают ядерный кинетический анализ, RT-PCR, анализ защиты РНКаз (Melton и др., Nuc. Acids Res. 12:7035), нозерн-блоттинг и гибридизацию In Situ. Экспрессия генов может быть также обнаружена анализом на микропланшете, как описано ниже.

Для нозерн-блоттинга образцы РНК сначала разделяют по размеру с использованием электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях. Затем РНК переносят на мембрану, сшивают и гибридизуют с меченым зондом. Могут быть использованы неизотопные или меченные с высокой специфической активностью радиоизотопами зонды, включая случайно инициированные, ник-транслированные или полученные с помощью ПЦР ДНК-зонды, транскрибированные in vitro РНК-зонды и олигонуклеотиды. Дополнительно могут быть использованы в качестве зондов последовательности только с частичной гомологией (например, кДНК от другого вида или фрагмент геномной ДНК, который может содержать экзон).

Анализ защиты от нуклеаз (включая как анализ защиты от рибонуклеаз, так и анализ нуклеазой S1) предусматривает исключительно чувствительный способ детекции и количественного определения специфических мРНК. Основой анализа NPA является гибридизация в растворе антисмыслового зонда (радиоактивно меченного или неизотопного) с образцом РНК. После гибридизации одноцепочечный, негибридизованный зонд и РНК разрушаются нуклеазами. Оставшиеся защищенные фрагменты разделяют на акриламидном геле. NPA позволяет одновременное определение нескольких типов РНК.

Гибридизация in situ (ISH) является мощным и гибким инструментом для локализации специфических мРНК в клетках или тканях. Гибридизация с зондом происходит в клетках или тканях. Поскольку в процессе сохраняется клеточная структура, ISH предоставляет информацию о местонахождении мРНК в образце ткани.

Процедура начинается с фиксирования образцов в буферизованном нейтральном формалине и парафинизации ткани. Образцы затем разрезают на части и устанавливают на предметные стекла микроскопа. (Альтернативно, ткани могут быть разрезаны замороженными и затем фиксированы параформальдегидом). После серии промывок для депарафинизации и регидратации частей проводят обработку протеиназой К для улучшения доступности зондов, после чего меченый зонд гибридизуют с частями образца. Меченные радиоизотопами зонды визуализируют жидкой пленкой, нанесенной и высушенной на стеклах, в то время как неизотопно меченные зонды обычно обнаруживают колориметрическими или флуоресцентными реактивами. Этот последний метод детекции является основой для флуоресцентной гибридизации In Situ (FISH).

Способы обнаружения, которые могут быть использованы, включают в себя радиоактивные метки, ферментные метки, хемилюминесцентные метки, флуоресцентные метки и другие подходящие метки.

Обычно для амплификации целевых РНК используют RT-PCR. По этой методике фермент обратную транскриптазу используют для преобразования РНК в комплементарную ДНК (кДНК), которая может быть затем амплифицирована для облегчения детекции. Относительная количественная RT-PCR включает в себя амплификацию внутреннего контроля одновременно с интересующим геном. Внутренний контроль используют для нормализации образцов. При условии нормализации могут быть сделаны прямые сравнения относительного количества определенной мРНК среди образцов. Обычно используемые внутренние контроли включают в себя, например, GAPDH, HPRT, актин и циклофилин.

Известно много способов амплификации ДНК, большинство из которых основано на ферментативной цепной реакции (такой как полимеразная цепная реакция, лигазная цепная реакция или самоподдерживающаяся репликация последовательности) или на репликации всего или части вектора, в который они были клонированы.

Многие способы амплификации сигнала и цели описаны в литературе, например обычные обзоры этих способов в Landegren, U. и др., Science 242:229-237 (1988) и Lewis, R., Genetic Engineering News 10:1, 54-55 (1990).

ПЦР представляет собой способ амплификации нуклеиновой кислоты, обычный в данной области и описанный, между прочим, в патентах США №№ 4683195 и 4683202. ПЦР может быть использована для амплификации любой известной нуклеиновой кислоты в диагностических целях (Mok и др., 1994, Gynaecologic Oncology 52:247-252). Самоподдерживающаяся репликация последовательности (3SR) представляет собой вариацию TAS, которая вовлекает изотермическую амплификацию нуклеиновой кислоты-шаблона путем последовательных воздействий активностями обратной транскриптазы (RT), полимеразы и нуклеазы, опосредованных ферментным коктейлем и соответствующими олигонуклеотидными праймерами (Guatelli и др., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874). Реакция лигазной амплификации или система лигазной амплификакции использует ДНК-лигазу и четыре олигонуклеотида, два на каждую целевую цепь. Эта методика описана Wu, D. Y. and Wallace, R. B., 1989, Genomics 4:560. В методике с применением Q. бета репликазы для амплификации целевой РНК для амплификации целевой ДНК используется РНК-репликаза из бактериофага Q. бета, которая реплицирует одноцепочечную РНК, как описано Lizardi и др., 1988, Bio/Technology 6:1197. Количественная ПЦР (Q-PCR) представляет собой методику, которая позволяет определять относительные количества транскриптов в образце.

III. Ингибиторы TNF

Данное изобретение связано со способом определения эффективности ингибитора TNFα, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в лечении анкилозирующего спондилита (AS). В изобретении также предложен способ мониторинга эффективности ингибитора TNFα, например, человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в уменьшении прогрессирования структурных повреждений, ассоциированных с анкилозирующим спондилитом (AS), у пациента. Изобретение дополнительно включает в себя способ прогнозирования эффективности ингибитора TNFα, например человеческого антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части в лечении AS у пациента. Композиции и наборы, относящиеся к заявленным способам, также рассматриваются как часть изобретения.

В одном варианте осуществления данные способы включают в себя определение эффективности выделенных человеческих антител или их антигенсвязывающих частей, связанных с человеческим TNFα с высокой аффинностью и низкой скоростью освобождения и имеющих высокую нейтрализующую способность. Предпочтительно, человеческие антитела, используемые в изобретении, являются рекомбинантными нейтрализующими человеческими антителами против hTNFα. Наиболее предпочтительные рекомбинантные нейтрализующие антитела согласно изобретению называются здесь как D2E7, также называются как HUMIRA® и адалимумаб (аминокислотная последовательность VL-области D2E7 показана в SEQ ID NO: 1; аминокислотная последовательность VH-области D2E7 показана в SEQ ID NO: 2). Свойства D2E7 (адалимумаб/HUMIRA®) описаны в Salfeld и др., патентах США №№ 6090382, 6258562 и 6509015, которые включены здесь в виде ссылки. Способы согласно изобретению также могут быть выполнены с использованием химерных и гуманизированых мышиных антител против hTNFα, которых подвергали клиническим исследованиям для лечения ревматоидного артрита (см., например, Elliott, M.J., и др. (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M.J., и др. (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C., и др. (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению включает в себя определение эффективности антител D2E7 и частей антител, связанных с D2E7 антител и частей антител и других человеческих антител и частей антител с одинаковыми свойствами с D2E7, такими как высокая аффинность связывания hTNFα при низкой кинетике диссоциации и высокая нейтрализующая способность, в лечении AS. В одном варианте осуществления изобретения предложено лечение выделенным человеческим антителом или его антигенсвязывающей частью, которые диссоциируют от человеческого TNFα с K_d порядка 1×10^-8 M или менее и константой скорости K_off порядка 1×10^-3 с^-1 или менее, причем обе [константы] определены поверхностным плазмонным резонансом, и нейтрализуют цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе in vitro на L929 с IC₅₀ порядка 1×10^-7 M или менее. Более предпочтительно, выделенное человеческое антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует от человеческого TNFα с K_off порядка 5×10^-4 с^-1 или менее, или даже более предпочтительно, с K_off порядка 1×10^-4 с^-1 или менее. Более предпочтительно, выделенное человеческое антитело или его антигенсвязывающая часть нейтрализует цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном in vitro анализе на L929 с IC₅₀ порядка 1×10^-8 M или менее, еще более предпочтительно, с IC₅₀ порядка 1×10^-9 M или менее и даже еще более предпочтительно, с IC₅₀ порядка 1×10^-10 M или менее. В предпочтительном варианте осуществления антителом является выделенное человеческое рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающая часть.

Хорошо известно в данной области, что CDR3-домены легкой и тяжелой цепи антитела играют важную роль в специфичности/аффинности связывания антитела с антигеном. Соответственно, в другом аспекте изобретение относится к способам прогнозирования ответа пациента на лечение AS, причем лечение включает в себя введение человеческих антител, которые имеют низкую кинетику диссоциации при ассоциации с hTNFα и которые имеют CDR3-домены легкой и тяжелой цепи, которые структурно идентичны или связаны с аналогичным доменом D2E7. Положение 9 CDR3 VL D2E7 может быть занято Ala или Thr без существенного влияния на K_off. Соответственно, консенсусный фрагмент для CDR3 VL D2E7 содержит аминокислотную последовательность Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO: 3). Дополнительно, положение 12 CDR3 VH D2E7 могут занимать Tyr или Asn без значительного влияния на K_off. Соответственно, консенсусный фрагмент для CDR3 VH D2E7 содержит аминокислотную последовательность V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO: 4). Более того, как показано в примере 2 патента США № 6090382, CDR3-домен тяжелых и легких цепей D2E7 подвержен замещению единственным остатком аланина (в положении 1, 4, 5, 7 или 8 в VL CDR3 или в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 в VH CDR3), без значительного влияния на K_off. В дальнейшем подготовленный специалист признает, что при условии подверженности доменов VL и VH CDR3 D2E7 заменам на аланин замены на другие аминокислоты внутри CDR3-доменов могут быть возможны при сохранении низкой константы скорости отделения антитела, в частности замены на консервативные аминокислоты. Предпочтительно, в CDR3-доменах VL и/или VH D2E7 произведено не более чем от одной до пяти консервативных аминокислотных замен. Более предпочтительно, в CDR3-доменах VL и/или VH D2E7 произведено не более чем от одной до трех консервативных аминокислотных замен. В дополнение к этому, консервативные аминокислотные замены не должны быть произведены в положениях аминокислот, важных для связывания с hTNFα. Положения 2 и 5 CDR3 VL D2E7 и положения 1 и 7 CDR3 VL D2E7 кажутся критическими для взаимодействия с hTNFα, и, таким образом, консервативные аминокислотные замены предпочтительно не должны производиться в этих положениях (хотя замена аланином в положении 5 CDR3 VL D2E7 приемлема, как описано выше) (см. патент США № 6090382).

Соответственно, в другом варианте осуществления изобретения предложены способы определения эффективности лечения AS, включающие в себя введение выделенного человеческого антитела или его антигенсвязывающей части. Антитело или его антигенсвязывающая часть предпочтительно имеет следующие характеристики:

a) диссоциирует от человеческого TNFα с константой скорости K_off порядка 1×10^-3 с^-1 или менее, определенной с помощью поверхностного плазмонного резонанса;

b) имеет CDR3-домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 3 последовательность путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;

c) имеет CDR3-домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 4 последовательность путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

Более предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует от человеческого TNFα с K_off порядка 5×10^-4 с^-1 или менее. Даже более предпочтительно, антитело или его антигенсвязывающая часть диссоциирует от человеческого TNFα с K_off порядка 1×10^-4 с^-1 или менее.

В еще одном варианте осуществления в изобретении предложены способы определения эффективности лечения AS, включающие введение выделенного человеческого антитела или его антигенсвязывающей части. Антитело или его антигенсвязывающая часть предпочтительно содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), имеющую CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 3 последовательность путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 и с вариабельной областью тяжелой цепи (HCVR), имеющей CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или модифицированную по сравнению с SEQ ID NO: 4 последовательность путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11. Предпочтительно, LCVR дополнительно имеет CDR2-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 (то есть CDR2 VL D2E7), и HCVR дополнительно имеет CDR2-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6 (то есть CDR2 VH D2E7). Еще более предпочтительно, LCVR дополнительно имеет CDR1-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 (то есть CDR1 VL D2E7), и HCVR имеет CDR1-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 (то есть CDR1 VH D2E7). Каркасные области VL предпочтительно образованы из семейства зародышевых генов человека V_κI, более предпочтительно из зародышевого гена человека А20 V_κ и наиболее предпочтительно из последовательностей каркасной области VL D2E7, показанных на фигурах 1А и 1B патента США № 6090382. Каркасные области VH предпочтительно образованы из семейства зародышевых генов человека V_н3, более предпочтительно из зародышевого гена человека DP-31 VH и наиболее предпочтительно из последовательностей каркасной области VH D2E7, показанных на фигурах 2А и 2B патента США № 6090382.

Соответственно, в другом варианте осуществления изобретения предложены способы определения эффективности лечения AS, где лечение включает в себя введение выделенного антитела человека или его антигенсвязывающей части. Антитело или его антигенсвязывающая часть предпочтительно содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 (т.е. VL D2E7), и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 (т.е. VH D2E7). В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Предпочтительно, константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или константную область тяжелой цепи IgG4. Кроме того, антитело может содержать константную область легкой цепи, представляющую собой или константную область легкой цепи каппа, или константную область легкой цепи лямбда. Предпочтительно, антитело содержит константную область легкой цепи каппа. Альтернативно, часть антитела может быть, например, фрагментом Fab или одноцепочечным фрагментом Fv.

В дополнительных вариантах осуществления изобретения предложены способы определения эффективности лечения AS, где лечение включает в себя введение выделенного человеческого антитела или его антигенсвязывающей части, содержащих связанные с D2E7 VL и VH CDR3-домены. Например, антитела или их антигенсвязывающие части с вариабельной областью легкой цепи (LCVR), имеющей CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, или с вариабельной областью тяжелой цепи (HCVR), имеющей CDR3-домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35.

В другом варианте осуществления способ согласно изобретению включает в себя определение эффективности лечения AS, где лечение включает в себя введение ингибитора TNFα, включая, но не ограничиваясь ими, антитело против TNFα или его фрагмент, включая инфликсимаб (Remicade®, Johnson and Johnson; описан в патенте США № 5656272, включенном здесь в виде ссылки), CDP571 (гуманизированное моноклональное антитело IgG4 против TNF-альфа), CDP 870 (фрагмент гуманизированного моноклонального антитела против TNF-альфа), anti-TNF dAb (Peptech), CNTO 148 (голимумаб; Medarex and Centocor, см. WO 02/12502) и адалимумаб (Humira® Abbott Laboratories, человеческое анти-TNF-mAb, описанное в патенте США № 6090382 как D2E7). Другие примеры включают в себя этанерцепт (описан в WO 91/03553 и WO 09/406476), растворимый рецептор TNF I типа, пегилированный растворимый рецептор TNF I типа (PEGs TNF-R1) или p55TNFRIgG (ленерцепт). В другом варианте осуществления ингибитором TNFα является рекомбинантный TNF-связывающий белок (r-TBP-I) (Serono).

Антитело против TNFα, используемое в способах и композициях согласно изобретению, может быть модифицировано для улучшенного лечения AS. В некоторых вариантах осуществления антитело к TNFα или его антигенсвязывающая часть химически модифицированы для получения желаемого эффекта. Например, пегилирование антител и фрагментов антител согласно изобретению можно проводить любой из реакций пегилирования, известных в данной области, как описано, например, в следующих ссылках Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0154316; и EP 0401384 (каждая из которых полностью включена в данное описание). Предпочтительно, пегилирование выполняют путем реакции алкилирования или реакции алкилирования с реакционно-способной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реакционно-способного водорастворимого полимера). Предпочтительный водорастворимый полимер для пегилирования антител и фрагментов антител согласно изобретению представляет собой полиэтиленгликоль (PEG). Используемый здесь термин «полиэтиленгликоль» включает все формы PEG, которые могут быть использованы для создания производных других белков, такие как моно(C1-C10)алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль.

Способы получения пегилированных антител и фрагментов антител согласно изобретению обычно включают в себя стадии (a) взаимодействия антитела или фрагмента антитела с полиэтиленгликолем, таким как реакционно-способный сложный эфир или альдегидное производное PEG, в соответствующих условиях, в результате чего антитело или фрагмент антитела присоединяется к одной или нескольким группам PEG, и (b) получения продуктов реакции. Обычному специалисту в данной области будет очевиден выбор оптимальных условий реакции для реакции ацилирования, основанной на известных параметрах и желаемом результате.

Пегилированные антитела и фрагменты антител обычно можно применять для лечения AS путем введения антител и фрагментов антител против TNFα, описанных в данном изобретении. Как правило, пегилированные антитела и фрагменты антител имеют увеличенный период полураспада по сравнению с непегилированными антителами и фрагментами антител. Пегилированные антитела и фрагменты антител могут быть использованы самостоятельно, совместно или в комбинации с другими фармацевтическими композициями.

В еще одном варианте осуществления антитела против TNFα или их фрагменты могут быть изменены таким образом, чтобы константная область антитела была модифицирована для уменьшения по меньшей мере одной опосредованной константной областью биологической эффекторной функции по сравнению с немодифицированным антителом. Для модификации антитела согласно изобретению таким образом, чтобы оно демонстрировало уменьшение связывания с рецептором Fc, сегмент константной области антитела может быть мутирован в определенных областях, необходимых для взаимодействий с рецептором Fc (FcR) (см., например, Canfield, S.M. и S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; и Lund, J. и др. (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662). Уменьшение способности связываться с FcR у антитела может также уменьшить другие эффекторные функции, которые основаны на взаимодействиях с FcR, такие как опсонизация и фагоцитоз и антиген-зависимая клеточная цитотоксичность.

Антитело или часть антитела, используемые в способах согласно изобретению, могут быть изменены или связаны с другой функциональной молекулой (например, другим пептидом или белком). Соответственно, антитела и части антител согласно изобретению подразумеваются как включающие производные и модифицированные другими путями формы человеческих антител против hTNFα, описанных в данном документе, включая иммуноадгезионные молекулы. Например, антитело или часть антитела согласно изобретению могут быть функционально связаны (химическим сочетанием, генетическим слиянием, нековалентным объединением или иным способом) с одним или несколькими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифичное антитело или димерное антитело), детектируемый агент, цитотоксический агент, фармацевтический агент и/или белок или пептид, который может служить связующим звеном между антителом или частью антитела и другой молекулой (такой как основная область стрептавидина или полигистидиновая метка).

Одним из типов измененных антител являются антитела, полученные поперечным сшиванием двух или более антител (одинакового типа или разных типов, например, для создания биспецифичных антител). Подходящие кросс-линкеры включают в себя те, которые являются гетеробифункциональными, имеющими две различные реактивные группы, разделенные соответствующим разделителем (например, сложный эфир м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимида), или гомобифункциональными (например, дисукцинимидилсуберат). Такие линкеры доступны от Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Применимые детектируемые агенты, с помощью которых могут быть изменены антитело или часть антитела, включают в себя флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые агенты включают в себя флуоресцин, флуоресцина изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и тому подобное. Антитело может также быть модифицировано детектируемым ферментом, таким как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, оксидаза глюкозы и тому подобное. Если антитело модифицировано детектируемым ферментом, то его обнаруживают добавлением дополнительных реагентов, которые фермент использует для получения детектируемого продукта реакции. Например, когда присутствует детектируемый агент пероксидаза хрена, добавление перекиси водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, который можно обнаружить. Антитело может также быть модифицировано биотином и обнаружено путем непрямого измерения связывания с авидином или стрептавидином.

Антитело или часть антитела, используемые в способах или композициях согласно изобретению, могут быть получены рекомбинантной экспрессией генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными экспрессионными векторами, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкие и тяжелые цепи иммуноглобулина антитела так, что легкие и тяжелые цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, предпочтительно, секретируются в среду, в которой клетки-хозяева культивируются, из которой антитела могут быть выделены. Стандартные способы с применением рекомбинантной ДНК используют для получения генов тяжелой и легкой цепи антитела, инкорпорации этих генов в рекомбинантные экспрессионные векторы и введения этих векторов в клетки-хозяева, как описано в Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. и др. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и в патенте США № 4816397, Boss и др.

Для экспрессии D2E7 или родственного D2E7 антитела сначала получали фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Эти ДНК могут быть получены амплификацией и модификацией зародышевых генов вариабельных последовательностей легкой и тяжелых цепей с использованием полимеразной цепной реакции (PCR). Зародышевые последовательности ДНК генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи известны в данной области (см., например, базу человеческих зародышевых последовательностей «Vbase»; см. также Kabat, E.A., и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I.M., и др. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops". J. Mol Biol. 227:776-798; and Cox, J.P.L. и др. (1994) "A Directory of Human Germ-line V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из них непосредственно включено здесь в виде ссылки). Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельную область тяжелой цепи D2E7 или связанного с D2E7 антитела, член семейства V_H3 человеческих зародышевых генов VH амплифицировали с помощью обычной PCR. Наиболее предпочтительно, амплифицировали зародышевую последовательность DP-31 VH. Для получения фрагмента ДНК, кодирующего вариабельную область легкой цепи D2E7 или связанного с D2E7 антитела, член семейства V_kI человеческих зародышевых генов VL амплифицировали с помощью обычной PCR. Наиболее предпочтительно, амплифицировали зародышевую последовательность А20 VL. Праймеры для PCR, подходящие для использования при амплификации зародышевой линии VH DP-31 и зародышевой линии VL А20, могут быть разработаны на основе нуклеотидных последовательностей, раскрытых в ссылках, цитированных выше, с использованием обычных способов.

После получения фрагментов VH и VL зародышевой линии эти последовательности могут быть подвергнуты мутации, чтобы кодировать D2E7 или связанные с D2E7 аминокислотные последовательности, раскрытые в данном изобретении. Аминокислотные последовательности, кодируемые последовательностями ДНК VH и VL зародышевой линии, сначала сравнивают с D2E7 или связанными с D2E7 аминокислотными последовательностями VH и VL для идентификации аминокислотных остатков в D2E7 или связанных с D2E7 последовательностях, которые отличаются от зародышевой линии. Затем соответствующие нуклеотиды последовательностей ДНК зародышевой линии подвергают мутации таким образом, чтобы мутантные последовательности зародышевой линии кодировали D2E7 или связанную с D2E7 аминокислотную последовательность, используя генетический код для определения, какие нуклеотидные замены должны быть произведены. Мутагенез последовательностей зародышевых линий проводят стандартными способами, такими как ПЦР-опосредованный мутагенез (при котором мутантные нуклеотиды вводят в праймеры для ПЦР, так что продукт ПЦР содержит мутации) или сайт-направленный мутагенез.

После получения фрагментов ДНК, кодирующих D2E7 или связанные с D2E7 сегменты VH и VL (путем амплификаци и мутагенеза генов VH и VL зародышевой линии, как описано выше), этими фрагментами ДНК можно в дальнейшем манипулировать стандартными способами с использованием рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельной области в полноразмерные гены цепей антитела, в гены фрагмента Fab или в ген scFv. В этих манипуляциях фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, оперативно связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Используемый в данном контексте термин «оперативно связан» предназначен для обозначения того, что два фрагмента ДНК связаны так, что аминокислотные последовательности, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются в рамке считывания.

Выделенная ДНК, кодирующая область VH, может быть преобразована в полноразмерный ген тяжелой цепи путем оперативного связывания VH-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2 и CH3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, E.A., и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG4. Для гена тяжелой цепи фрагмента Fab кодирующая VH ДНК может быть оперативно связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только CH1-константную область тяжелой цепи.

Выделенная ДНК, кодирующая область VL, может быть преобразована в полноразмерный ген легкой цепи (так же, как и в ген легкой цепи Fab) путем оперативного связывания кодирующей VL ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области (см., например, Kabat, E.A., и др. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены путем стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может быть константной областью каппа или лямбда, но наиболее предпочтительно представляет собой константную область каппа.

Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, оперативно связываются с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly₄-Ser)₃, таким образом, что последовательности VH и VL могут экспрессироваться в виде связанного одноцепочечного белка, с областями VL и VH, объединенными гибким линкером (см., например, Bird и др. (1988) Science 242:423-426; Huston и др. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty и др., Nature (1990) 348:552-554).

Для экспрессии антител или частей антител, используемых в изобретении, ДНК, кодирующие частичные или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, полученные как описано выше, вставляют в экспрессионные векторы, так что гены оперативно связываются с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В этом контексте термин «оперативно связываются» должен означать, что ген антитела лигируют в вектор таким образом, что последовательности контроля транскрипции и трансляции в векторе выполняют предназначенную им функцию регуляции транскрипции и трансляции гена антитела. Экспрессионный вектор и последовательности контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела могут быть вставлены в раздельные векторы или, более типично, оба гена вставлены в один и тот же экспрессионный вектор. Гены антител вставляют в экспрессионный вектор стандартными способами (например, лигированием комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и вектора или лигированием тупых концов, если отсутствуют сайты рестрикции). Перед вставкой последовательностей легкой или тяжелой цепи D2E7 или родственных D2E7 экспрессионный вектор может уже нести последовательности константной области антитела. Например, один из подходов к преобразованию VH и VL-последовательностей D2E7 или родственных D2E7 в полноразмерные гены антител заключается во вставке их в экспрессионные векторы, уже кодирующие константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи, соответственно, таким образом, что сегмент VH оперативно связывается с сегментом(ами) CH в векторе и сегмент VL оперативно связывается с сегментом CL в векторе. Дополнительно или альтернативно, рекомбинантные экспрессионные векторы могут кодировать сигнальный пептид, который способствует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела может быть клонирован в вектор так, что сигнальный пептид связывается в рамке считывания с геном аминоконца цепи антитела. Сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом иммуноглобулина или гетерологичным сигнальным пептидом (т.е. сигнальным пептидом из белка, не являющегося иммуноглобулином).

В дополнение к генам цепи антитела, рекомбинантный экспрессионный вектор может нести регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Термин «регуляторная последовательность» подразумевает включение промоторов, энхансеров и других элементов контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепи антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Специалистами в данной области будет признано, что конструкция экспрессионного вектора, включая выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации, желаемый уровень экспрессии белка и т.п. Предпочтительные регуляторные последовательности для клеток-хозяев млекопитающих включают в себя вирусные элементы, которые управляют высокими уровнями экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса Симиана 40 (SV40)(такие как промотор/энхансер SV 40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и полиомы. Для дополнительного описания вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, патент США № 5168062, Stinski, патент США № 4510,245, Bell и др. и патент США № 4968615, Schaffner и др.

В дополнение к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям, рекомбинантные экспрессионные векторы, используемые в изобретении, могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, сайты инициации репликации) и селектируемые маркерные гены. Селектируемые маркерные гены обеспечивают отбор клеток-хозяев, в которые введен вектор (см., например, патенты США №№ 4399216, 4634665 и 5179017, все Axel и др.). Например, обычно селектируемый маркерный ген придает устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гидромицин или метотрексат, клетки-хозяина, в которую введен вектор. Предпочтительные селектируемые маркерные гены включают в себя ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для использования в клетках-хозяевах dhfr^- с метотрексатной селекцией/амплификацией) и ген neo (для селекции G418).

Для экспрессии тяжелых и легких цепей экспрессионный вектор(ы), кодирующий тяжелые и легкие цепи, трансфицируют в клетку-хозяина обычными способами. Различные формы термина «трансфекция» предполагают включение широкого ассортимента способов, обычно используемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например электропорация, фосфат-кальциевая преципитация, ДЕАЕ-декстрановая тренсфекция и тому подобное. Хотя теоретически возможна экспрессия антител согласно изобретению как в прокариотических, так и в эукариотических клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках, а наиболее предпочтительно, в клетках млекопитающих, является наиболее предпочтительной, поскольку такие эукариотические клетки, и, в частности, клетки млекопитающих, более перспективны, чем прокариотические клетки в плане сборки и секреции правильно свернутого и иммунологически активного антитела. Прокариотическая экспрессия генов антитела описана как неэффективная для получения активного антитела с высоким выходом (Boss, M.A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих для экспрессии рекомбинантных антител согласно изобретению включают в себя клетки яичников китайского хомячка (клетки CHO) (включая dhfr- клетки CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, используемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NS0, клетки COS и клетки SP2. Когда рекомбинантные экспрессионные векторы, кодирующие гены антитела, вводят в клетку-хозяина млекопитающих, антитела продуцируются путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для экспрессии антитела в клетке-хозяине, или, более предпочтительно, секреции антитела в культуральную среду, в которой выращивают клетки-хозяева. Антитела могут быть выделены из культуральной среды с использованием стандартных способов очистки белка.

Клетки-хозяева также могут быть использованы для получения фрагментов интактных антител, таких как фрагменты Fab или молекулы scFv. Следует понимать, что варианты описанной выше процедуры входят в объем представленного изобретения. Например, может быть желательно трансфицировать клетку-хозяина ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) антитела согласно изобретению. Технология рекомбинантной ДНК может быть также использована для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих отдельно или обе легкую и тяжелую цепи, которые не являются необходимыми для связывания hTNFα. Молекулы, экспрессируемые с таких усеченных молекул ДНК, также охватываются антителами согласно изобретению. В дополнение, могут быть получены бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепь от антитела по изобретению, а другая тяжелая и другая легкая цепь специфичны в отношении антигена, отличного от hTNFα, перекрестным сшиванием антитела согласно изобретению со вторым антителом с помощью стандартных химических способов перекрестного сшивания.

В предпочтительной системе рекомбинантной экспрессии антитела или его антигенсвязывающей части согласно изобретению рекомбинантный экспрессионный вектор, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO опосредованной фосфатом кальция трансфекцией. В рекомбинантном экспрессионном векторе каждый из генов тяжелой и легкой цепи антитела оперативно связан с регуляторными элементами CMV энхансером/промотором AdMLP для стимулирования высоких уровней транскрипции генов. Рекомбинантный экспрессионный вектор также несет ген DHFR, который позволяет селекцию клеток CHO, которые были трансфицированы вектором с использованием метотрексатной селекции/амплификации. Выбранные трансформированные клетки-хозяева культивируют для протекания экспрессии тяжелых и легких цепей антитела и интактное антитело извлекают из культуральной среды. Стандартные способы молекулярной биологии используют для получения рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфекции клеток-хозяев, отбора трансформантов, культивирования клеток-хозяев и извлечения антитела из культуральной среды.

Рекомбинантные человеческие антитела согласно изобретению, в дополнение к D2E7 или его антигенсвязывающей части, или родственным D2E7 антителам, раскрытым здесь, могут быть выделены путем скрининга комбинаторной рекомбинантной библиотеки антител, предпочтительно библиотеки фаговых дисплеев scFv, полученной с использованием человеческих кДНК VL и VH, полученных из мРНК, производных из лимфоцитов человека. Методология получения и скрининга подобных библиотек известна из уровня техники. В дополнение к коммерчески доступным наборам для генерации библиотек фаговых дисплеев (например, the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, номер по каталогу 27-9400-01; и Stratagene SurfZAP ^TM phage display kit, номер по каталогу 240612), примеры способов и реактивов, особенно применимых для использования при создании и скрининге библиотек дисплеев антител, могут быть найдены в, например, Ladner и др. патент США № 5223409; Kang и др. PCT номер публикации WO 92/18619; Dower и др. PCT номер публикации WO 91/17271; Winter и др. PCT номер публикации WO 92/20791; Markland и др. PCT номер публикации WO 92/15679; Breitling и др. PCT номер публикации WO 93/01288; McCafferty и др. PCT номер публикации WO 92/01047; Garrard и др. PCT номер публикации WO 92/09690; Fuchs и др. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay и др. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-65; Huse и др. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty и др., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths и др. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins и др. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson и др. (1991) Nature 352:624-628; Gram и др. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard и др. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom и др. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Barbas и др. (1991) PNAS 88:7978-7982.

В предпочтительном варианте осуществления для выделения человеческих антител с высокой аффинностью и низкой константой скорости диссоциации из hTNFα мышиные антитела против hTNFα, имеющие высокую аффинность и низкую константу скорости диссоциации из hTNFα (например, MAK 195, гибридома для которых имеет номер хранения ECACC 87 050801), сначала используют для отбора последовательностей тяжелой и легкой цепи человека, имеющих сходную связывающую активность в отношении hTNFα, с применением способов эпитопного импринтинга, описанных в Hoogenboom и др., PCT номер публикации WO 93/06213. Библиотеки антител, используемые в этом способе представляют собой предпочтительно библиотеки scFv, полученные и исследованные, как описано в McCafferty и др., PCT номер публикации WO 92/01047, McCafferty и др., Nature (1990) 348:552-554; and Griffiths и др., (1993) EMBO J 12:725-734. Библиотеки антител scFv предпочтительно исследуют с применением рекомбинантных человеческих TNFα в качестве антигена.

После выбора исходных сегментов VL и VH для выбора предпочтительных комбинаций пар VL/VH проводят эксперименты по «смешиванию и соответствию», в которых различные пары изначально выбранных сегментов VL и VH проверяют на связывание hTNFα. Дополнительно, для дальнейшего улучшения аффинности и/или понижения константы диссоциации для связывания с hTNFα сегменты VL и VH предпочтительной пары (пар) могут быть случайным образом преобразованы, предпочтительно в CDR3-области VH и/или VL, в процессе, аналогичном процессу соматических мутаций in vivo, ответственном за развитие аффинности антител в процессе естественного иммунного ответа. Такое развитие аффинности in vitro может быть проведено путем амплификации областей VL и VH с использованием праймеров для ПЦР, комплементарных VH CDR3 или VL CDR3 соответственно, причем праймеры были «проколоты» случайной смесью четырех нуклеотидных оснований в определенных положениях таким образом, чтобы полученные ПЦР-продукты кодировали сегменты VL и VH, в которых в области VH и/или VL CDR3 были внесены случайные мутации. Эти случайно мутированные сегменты VH и VL были заново исследованы на связывание с hTNFα и были отобраны последовательности, которые демонстрировали высокую аффинность и низкую скорость диссоциации для связывания с hTNFα.

Вслед за скринингом и выделением антитела против hTNFα согласно изобретению из рекомбинантной иммуноглобулиновой дисплейной библиотеки нуклеиновые кислоты, кодирующие выбранные антитела, могут быть выделены из дисплейного пакета (например, из фагового генома) и субклонированы в другие экспрессионные векторы стандартными способами рекомбинантной ДНК. При желании, нуклеиновые кислоты могут быть дополнительно подвергнуты манипуляциям для получения других форм антитела согласно изобретению (например, связаны с нуклеиновыми кислотами, кодирующими дополнительные домены иммуноглобулина, такие как дополнительные константные области). Для экспрессии рекомбинантного человеческого антитела, выделенного скринингом комбинаторной библиотеки, ДНК, кодирующую антитело, клонировали в рекомбинантный экспрессионный вектор и вводили в клетки-хозяева млекопитающих, как описано более подробно выше.

Способы выделения человеческих антител с высокой аффинностью к hTNFα также описаны в патентах США №№ 6090382, 6258562 и 6509015, каждый из которых включен здесь в виде ссылки.

IV. Спондилоартропатии

TNFα вовлечен в патофизиологию широкого спектра расстройств, включая воспалительные заболевания, такие как спондилоартропатии (см., например, Moeller и др. (1990) Cytokine 2:162; патент США № 5231024; европейскую патентную публикацию № 260610).

Здесь термин «спондилоартропатия» или «спондилоартропатии» используется для указания любой из нескольких болезней, влияющих на суставы позвоночника, причем такие болезни имеют одинаковые клинические, радиологические и гистологические особенности. Большое число спондилоартропатий имеют общие генетические характеристики, то есть они ассоциированы с аллелем HLA-B27. В одном варианте осуществления термин «спондилоартропатия» используют для обозначения любой из нескольких болезней, затрагивающих суставы позвоночника, исключая анкилозирующий спондилит, причем такие болезни имеют одинаковые клинические, радиологические и гистологические особенности. Примеры спондилоартропатий включают в себя анкилозирующий спондилит, псориатический артрит/спондилит, энтеропатический артрит, реактивный артрит или синдром Рейтера и недифференцированные спондилоартропатии. Примеры моделей животных, используемых для изучения спондилоартропатий, включают в себя ank/ank трансгенных мышей, HLA-B27 трансгенных крыс (см. Taurog и др. (1998) The Spondylarthritides. Oxford:Oxford University Press).

Способы согласно изобретению могут быть также использованы для лечения субъектов, находящихся под угрозой развития спондилоартропатии. Примеры субъектов, находящихся под угрозой развития спондилоартропатии, включают в себя людей, страдающих от артритов. Спондилоартропатии могут быть ассоциированы с другими формами артритов, включая ревматоидный артрит. В одном варианте осуществления изобретения уровни биомаркера деградации хряща и/или биомаркера синовита у пациента, имеющего спондилоартропатию или находящегося под угрозой развития спондилоартропатии, определяли и использовали для определения того, является ли пациент под угрозой возникновения спондилоартропатии. Примеры спондилоартропатий, которые можно лечить антителами против TNFα и, соответственно, обследовать с применением описанных здесь способов, приведены ниже:

Анкилозирующий спондилит (AS)

Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию анкилозирующего спондилита (AS) (см. Verjans и др. (1991) Arthritis Rheum. 34:486; Verjans и др. (1994) Clin Exp Immunol. 97:45; Kaijtzel и др. (1999) Hum Immunol. 60:140). AS представляет собой воспалительное расстройство, вовлекающее воспаление одного или нескольких позвонков. AS представляет собой хроническое воспалительное заболевание, которое затрагивает осевой скелет и/или периферические суставы, включая суставы между позвонками позвоночника, крестцово-подвздошные суставы и суставы между позвоночником и тазом. AS может в конечном счете приводить к слиянию или срастанию затронутых позвонков. Спондилоартропатии, включая AS, могут быть ассоциированы с псориатическими артритами (PsA) и/или воспалительными заболеваниями кишечника (IBD), включая язвенные колиты и болезнь Крона.

Ранние проявления AS могут быть выявлены радиографическими исследованиями, включая сканирование CT и MRI. Ранние проявления AS часто включают в себя сакроилеит и изменения в крестцово-подвздошных суставах, о чем свидетельствует помутнение кортикальных краев субхондриальной кости с последующими эрозиями и склерозом. Так же как и частый симптом AS, отмечена усталость (Duffy и др. (2002) ACR 66th Annual Scientific Meeting Abstract). Соответственно, способы согласно изобретению могут быть использованы для обеспечения улучшенного лечения AS путем предоставления способа определения эффективности лечения, включающего введение ингибитора TNF.

В одном варианте осуществления способ согласно изобретению используют для определения эффективности введения ингибитора TNF для лечения спондилоартропатии, включая AS, ассоциированный с IBD.

AS часто подвергают лечению нестероидными противовоспалительными лекарственными средствами (NSAID), такими как аспирин или индометацин. Соответственно, способы согласно изобретению могут быть использованы для определения эффективности лечения, включающего в себя введение антитела к TNFα в сочетании с агентами, обычно используемыми для уменьшения воспаления и боли, обычно ассоциированных с анкилозирующим спондилитом.

2. Псориатический артрит

Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию псориатического артрита (PsA) (Partsch и др. (1998) Ann Rheum Dis. 57:691; Ritchlin и др. (1998) J Rheumatol. 25:1544). Как именуется здесь, псориатический артрит или псориаз, ассоциированный с кожей, относится к хроническим воспалительным артритам, которые ассоциированы с псориазом, который является общим хроническим состоянием кожи, вызывающим красные пятна на теле. Приблизительно у 1 из 20 индивидуумов с псориазом будет развиваться артрит наряду с состоянием кожи, и приблизительно в 75% случаев псориаз предшествует артриту. PsA проявляется различными способами, варьируя от умеренных до тяжелых артритов, причем артриты обычно затрагивают пальцы и позвоночник. Когда затронут позвоночник, симптомы сходны с симптомами анкилозирующего спондилита, как описано выше. Соответственно, эффективность антител против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента в лечении PsA может быть определена с использованием способа и композиций согласно изобретению.

Иногда PsA ассоциирован с деформирующим артритом. Термин «деформирующий артрит» относится к расстройству, которое характеризуется чрезмерной эрозией кости, приводящей к грубой, эрозивной деформации, которая уродует сустав. В одном варианте осуществления эффективность антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента в лечении деформирующего артрита может быть определена с использованием способов и композиций согласно изобретению.

3. Реактивный артрит/синдром Рейтера

Фактор некроза опухолей вовлечен в патофизиологию реактивных артритов, которые также называются синдромом Рейтера (Braun и др. (1999) Arthritis Rheum. 42(10):2039). К реактивным артритам (ReA) относят артриты, которые осложняют инфекцию в другом месте организма, часто являясь последствиями кишечных или урогенитальных инфекций. ReA часто характеризуется определенными клиническими симптомами, включая воспаление суставов (артрит), уретрит, конъюнктивит и поражения кожи и слизистых оболочек. В дополнение, ReA может иметь место после заражения заболеваниями, передающимися половым путем или дизентерией, включая хламидии, кампилобактер, сальмонеллу или иерсинию. В одном варианте осуществления эффективность антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента может быть определена способами и композициями по изобретению.

4. Недифференцированные спондилоартропатии

В одном варианте осуществления антитела, полученные с использованием способов согласно изобретению, используют для лечения субъектов, страдающих от недифференцированных спондилоартропатий (см. Zeidler и др. (1992) Rheum Dis Clin North Am. 18:187). Другие термины, используемые для описания недифференцированных спондилоартропатий, включают в себя олигоартриты и недифференцированные олигоартриты. Используемый здесь термин «недифференцированные спондилоартропатии» относится к расстройству, при котором субъект демонстрирует только некоторые симптомы, ассоциированные со спондилоартропатией. Это состояние обычно наблюдается у молодых людей, которые не имеют IBD, псориаза или классических симптомов AS или синдрома Рейтера. В некоторых случаях недифференцированные спондилоартропатии могут быть ранним признаком AS. В одном варианте осуществления эффективность антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента в лечении недифференцированных спондилоартропатий может быть определена способами и композициями по изобретению.

V. Фармацевтические композиции и фармацевтическое введение

А. Композиции и введение

Антитела, части антител и другие ингибиторы TNFα для применения в способах согласно изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Обычно фармацевтическая композиция содержит антитело, часть антитела или другой ингибитор TNFα согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый здесь термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает в себя любой и все растворители, дисперсионную среду, покрытия, противобактериальные и противогрибковые агенты, изотонические или замедляющие абсорбцию агенты и тому подобное, которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают в себя один или несколько компонентов, выбранных из воды, солевого раствора, забуференного фосфатом солевого раствора, декстрозы, глицерина, этанола и тому подобное, так же как и их сочетание. Во многих случаях предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например сахар, полиспирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут дополнительно содержать небольшие количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела, части антитела или другого ингибитора TNFα.

Композиции для использования в способах согласно изобретению могут находиться в разнообразных формах. Они включают в себя, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого режима введения и терапевтического применения. Обычно предпочтительные композиции находятся в форме растворов для инъекций или инфузий, такие как композиции, аналогичные тем, которые используют для пассивной иммунизации людей другими антителами или другими ингибиторами TNFα. Предпочтительным способом введения является парентеральный способ (например, внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, внутримышечный). В предпочтительном варианте осуществления антитело или другой ингибитор TNFα вводят путем внутривенной инфузии или инъекции. В другом варианте осуществления антитело или другой ингибитор TNFα вводят путем внутримышечной или подкожной инъекции.

Терапевтические композиции обычно должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиции могут быть составлены в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высоких концентраций лекарственного средства. Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены включением активного соединения (например, антитела, части антитела или иного ингибитора TNFα) в необходимое количество соответствующего растворителя, состоящего из одного ингредиента или комбинации ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии приготавливают, вводя активное соединение в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые дают на выходе порошок активного ингредиента с добавлением любого дополнительного желаемого ингредиента из его предварительно стерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, использованием покрытия, такого как лецитин, поддерживанием требуемого размера частиц в случае дисперсии и использованием поверхностно-активных веществ. Пролонгированная абсорбция вводимых инъекцией композиций может быть осуществлена включением в композицию агента, замедляющего абсорбцию, например моностеаратных солей и желатина.

Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции. В некоторых вариантах осуществления антитело или часть антитела для использования в способах согласно изобретению составляют вместе и/или вводят вместе с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, включая ингибитор или антагонист AS. Например, антитело против hTNFα или часть антитела согласно изобретению могут быть составлены вместе и/или введены вместе с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связывают другие мишени, имеющие отношение к связанным с TNFα расстройствам (например, антитела, которые связывают другие цитокины или которые связывают молекулы клеточной поверхности), один или несколько цитокинов, растворимый рецептор TNFα (см., например, PCT номер публикации WO 94/06476) и/или один или несколько химических агентов, которые ингибируют продукцию hTNFα или активность (такие как производные циклогексанилидена, как описано в PCT номер публикации WO 93/19751) или любую их комбинацию. Кроме того, одно или несколько антител согласно изобретению могут быть использованы в комбинации с двумя или более вышеупомянутыми терапевтическими агентами. В такой комбинированной терапии можно выгодно использовать меньшие дозы вводимых терапевтических агентов, таким образом, избегая возможных побочных эффектов, затруднений с низким уровнем ответа пациента, ассоциированных с различными видами монотерапии.

В одном варианте осуществления изобретение включает в себя фармацевтические композиции, содержащие эффективное количество ингибитора TNFα и фармацевтически приемлемый носитель, где эффективное количество ингибитора TNFα может быть эффективным в лечении AS. В одном варианте осуществления антитело или часть антитела для использования в способах согласно изобретению включены в фармацевтическую композицию, как описано в PCT/IB03/04502 и U.S. Appln. No. 10/222140, которые включены здесь в виде ссылки. Эта композиция включает в себя концентрацию антитела D2E7 50 мг/мл, причем один предварительно наполненный шприц содержит 40 мг антитела для подкожной инъекции. В другом варианте осуществления композиция согласно изобретению включает в себя D2E7.

Антитела, части антител и другие ингибиторы TNFα согласно представленному изобретению могут быть введены различными способами, известными в данной области, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/режимом введения является подкожная инъекция. В другом варианте осуществления введение осуществляют путем внутривенной инъекции или инфузии. Как будет оценено квалифицированным специалистом, путь и/или режим введения будет изменяться в зависимости от желаемых результатов. В некоторых вариантах осуществления активное соединение может быть получено с использованием носителя, защищающего соединение от быстрого высвобождения, такого как композиция для контролируемого высвобождения, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микрокапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликоевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Многие способы получения таких составов запатентованы или общеизвестны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Robinson, ed., Dekker, Inc., New York, 1978.

Антитела против TNFα, используемые в изобретении, также могут быть введены в форме композиций с белковыми кристаллами, которые включают в себя комбинацию белковых кристаллов, инкапсулированных в полимерный носитель для образования покрытых частиц. Композиции с покрытыми частицами белковых кристаллов могут иметь сферическую структуру и представлять собой микросферы до 500 микрометров в диаметре или могут иметь другое строение и представлять собой микрочастицы. Повышенная концентрация белковых кристаллов позволяет вводить антитело согласно изобретению подкожно. В одном варианте осуществления антитела против TNFα согласно изобретению доставляют с помощью системы доставки белков, когда один или несколько составов или композиций на основе кристаллического белка вводят субъекту со связанным с TNFα расстройством. Композиции и способы получения стабилизированных композиций целых кристаллов антитела или кристаллов фрагмента антитела также описаны в WO 02/072636, включенном здесь в виде ссылки. В одном варианте осуществления композиция, содержащая кристаллизованные фрагменты антитела, описанные в PCT/IB03/04502 и патентной заявке США № 10/222140, включенных здесь в виде ссылки, используют для лечения ревматоидных артритов с применением способов согласно изобретению.

В некоторых вариантах осуществления антитело, часть антитела или другой ингибитор TNFα согласно изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усвояемым съедобным носителем. Соединение (и другие ингредиенты, если требуется) могут также быть заключены в желатиновую капсулу с мягкой или твердой оболочной, спрессованы в таблетки или включены непосредственно в диету субъекта. Для перорального терапевтического введения соединения могут быть включены с эксципиентами и использованы в виде проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, галет и тому подобное. Для введения соединения согласно изобретению способом, отличным от парентерального введения, может быть необходимо покрыть соединение материалом, предотвращающим инактивацию, или вводить соединение совместно с ним.

Фармацевтические композиции согласно изобретению могут включать в себя «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или части антитела согласно изобретению. Термин «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при необходимых дозах и периодах времени для достижения желаемых терапевтических результатов. Терапевтически эффективное количество антитела, части антитела или другого ингибитора TNFα может изменяться в зависимости от факторов, таких как болезненное состояние, возраст, пол и масса индивидуума, способности антитела, части антитела или иного ингибитора TNFα вызывать желаемый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективным количеством является также такое количество, при котором любые токсические или нежелательные эффекты антитела, части антитела или иного ингибитора TNFα перевешиваются терапевтически выгодными эффектами. Термин «профилактически эффективное количество» относится к количеству, эффективному при необходимых дозах и периодах времени для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическую дозу используют у субъектов до начала или на ранних стадиях болезни, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.

Режимы дозирования можно регулировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, может быть введен единичный болюс, несколько разделенных доз могут быть введены с течением времени или доза может быть пропорционально уменьшена или увеличена по показаниям необходимости терапевтической ситуации. Особенно выгодно составлять парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для облегчения введения и однородности доз. Используемый здесь термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, соответствующим однократным дозам для субъектов-млекопитающих, подвергаемых лечению; причем каждая единица содержит заранее определяемое количество активного соединения, вычисленное для получения требуемого терапевтического эффекта в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация стандартных лекарственных форм согласно изобретению обусловлена и напрямую зависит от (a) уникальных характеристик активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического или профилактического эффекта и (b) ограничений, присущих технологии создания лекарственных композиций, таких как активные соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.

В одном варианте осуществления изобретения предложен способ лечения связанных с TNFα расстройств разовой дозой, включающий в себя введение субъекту, нуждающемуся в этом, разовой дозы ингибитора TNFα, такого как человеческое антитело. В одном варианте осуществления ингибитором TNFα является антитело D2E7 против TNFα. Разовая доза ингибитора TNFα может быть терапевтически или профилактически эффективным количеством. В одном варианте осуществления субъекту вводят либо 20 мг, 40 мг, либо 80 мг разовой дозы D2E7. Разовая доза может быть введена любым путем, включая, например, подкожное введение. Режим дозирования раз в две недели может быть использован для лечения расстройств, при которых активность TNFα является определяющей, и описан дополнительно в US Appln. No. 10/163657. Способы лечения или предотвращения многократно-вариабельными дозами также могут быть использованы для лечения расстройств, при которых активность TNFα является определяющей, и дополнительно описаны в PCT appln. no. PCT/US05/12007.

Следует отметить, что значения доз могут изменяться с типом и тяжестью облегчаемого состояния. Далее следует понимать, что для любого конкретного субъекта конкретные режимы дозирования должны быть подобраны со временем в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным суждением человека, назначающего или контролирующего назначение соединений, и интервалы доз, изложенные здесь, являются только иллюстративными и не предполагаются ограничивающими пределы объема или практическое применение заявленной композиции.

Изобретение также относится к упакованным фармацевтическим композициям или наборам для введения антител против TNFα согласно изобретению для лечения AS. В одном варианте осуществления изобретения набор содержит ингибитор TNFα, такой как антитело, вторую фармацевтическую композицию, содержащую дополнительный терапевтический агент, и инструкции по введению для лечения AS. В инструкциях может быть описано, каким образом, например подкожно, и когда, например на неделе 0 и неделе 2, различные дозы ингибитора TNFα и/или дополнительного терапевтического агента должны быть введены субъекту для лечения.

Другой аспект изобретения относится к наборам, содержащим фармацевтическую композицию, содержащую антитело против TNFα и фармацевтически приемлемый носитель, и одну или несколько фармацевтических композиций, каждая из которых содержит лекарственное средство, полезное в лечении связанного с TNFα расстройства, и фармацевтически приемлемый носитель. Альтернативно, набор содержит одну фармацевтическую композицию, содержащую антитело против TNFα, один или несколько лекарственных средств, полезных в лечении связанных с TNFα расстройств, и фармацевтически приемлемый носитель. Наборы содержат инструкции по дозированию фармацевтических композиций для лечения связанных с TNFα расстройств. В одном варианте осуществления он содержит инструкции, касающиеся того, как определить эффективность ингибитора TNFα в лечении AS. Набор может включать в себя любой из следующих компонентов для осуществления способов согласно изобретению: детектируемый агент, который специфично распознает CTX-II и/или MMP-3; инструкции по применению; реагенты для выделения образца из организма пациента.

Альтернативно, упаковка или набор может содержать ингибитор TNFα и его можно пропагандировать для использования или внутри упаковки, или в сопутствующей информации, в отношении применения в лечении расстройств, описанных здесь. Упакованные фармацевтические препараты или наборы дополнительно включают в себя второй агент (как описано здесь), упакованный с инструкциями по применению второго агента с первым агентом или совместно пропагандируемый ими (как описано здесь).

B. Дополнительные терапевтические агенты

Изобретение относится к определению эффективности ингибитора TNF в лечении AS, одного или в комбинации с дополнительным терапевтическим агентом. Комбинация агентов, используемых в способах и фармацевтических композициях, описанных здесь, может обладать терапевтическим аддитивным или синергическим действием на состояние(я) или заболевание(я), намеченное для лечения. Комбинация агентов, используемая в способах или фармацевтических композициях, описанных здесь, также может уменьшить нежелательные эффекты, ассоциированные по меньшей мере с одним из агентов, при введении одного или без другого агента(ов) конкретной фармацевтической композиции. Например, токсический побочный эффект одного агента может быть ослаблен другим агентом композиции, таким образом, делая возможными более высокие дозы, увеличивая переносимость пациентом и улучшая терапевтический результат. Аддитивные или синергические эффекты, выгода и преимущества композиций относятся к классам терапевтических агентов, либо структурным, либо функциональным классам или к самим индивидуальным соединениям.

Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции. В некоторых вариантах осуществления антитело или часть антитела согласно изобретению совместно составлены и/или совместно введены с одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, которые применимы для лечения связанного с TNFα расстройства. Например, антитело против hTNFα, часть антитела или другой ингибитор TNFα согласно изобретению могут быть совместно составлены и/или совместно введены с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связывают другие мишени (например, антитела, которые связывают другие цитокины или которые связывают молекулы клеточной поверхности), одним или несколькими цитокинами, растворимым рецептором TNFα (см., например, PCT номер публикации WO 94/06476) и/или одним или несколькими химическими агентами, которые ингибируют продукцию или активность hTNFα (такими как производные циклогексанилидена, как описано в PCT номер публикации WO 93/19751). Кроме того, одно или несколько антител или других ингибиторов TNFα согласно изобретению могут быть использованы в комбинации с двумя или более вышеупомянутыми терапевтическими агентами. В такой комбинированной терапии можно преимущественно использовать более низкие дозы вводимых терапевтических агентов, таким образом, избегая возможной токсичности или осложнений, ассоциированных с различными видами монотерапии.

Неограничивающие примеры терапевтических агентов, с которыми антитело, часть антитела или другой ингибитор TNFα могут быть комбинированы в способе лечения и оценены в соответствии со способами согласно изобретению, включают в себя следующие: нестероидное противовоспалительное лекарственное средство(а) (NSAID); супрессирующее цитокины противовоспалительное лекарственное средство(а) (CSAID); CDP-571/BAY-10-3356 (гуманизированное антитело против TNFα; Celltech/Bayer); cA2/инфликсимаб (химерное антитело против TNFα; Centocor); 75 kdTNFR-IgG/этанерцепт (слитый белок 75 кД TNF-рецептор-IgG; Immunex;, см., например, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNF-IgG (слитый белок 55 кД TNF-рецептор-IgG; Hoffmann-LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (неистощающее приматизированное антитело против CD4; IDEC/SmithKline; см., например, Arthritis & Rheumatism (1995) Vol. 38, S185); DAB 486-IL-2 и/или DAB 389-IL-2 (слитые белки IL-2; Seragen; см., например, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (гуманизированное анти-IL-2Rα; Protein Design Labs/Roche); IL-4 (противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; рекомбинантный IL-10, противовоспалительный цитокин; DNAX/Schering); агонисты IL-4; IL-10 и/или IL-4 (например, агонистические антитела); IL-1RA (антагонист рецептора IL-1; Synergen/Amgen); анакинра (Kineret®/Amgen); TNF-bp/s-TNF (растворимый TNF-связывающий белок; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol. 268, pp. 37-42); R973401 (ингибитор фосфодиэстеразы IV типа; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); MK-966 (ингибитор COX-2; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S81); илопрост (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S82); метотрексат; талидомид (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282) и связанные с талидомидом лекарственные средства (например, Celgen); лефлуномид (противовоспалительное и ингибитор цитокинов; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S131; Inflammation Research (1996) Vol. 45, pp. 103-107); транексамовая кислота (ингибитор активации плазминогена; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S284); T-614 (ингибитор цитокина; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); простагландин E1 (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S282); тенидап (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство; см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S280); напроксен (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство; см., например, Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); мелоксикам (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); ибупрофен (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); пироксикам (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); диклофенак (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); индометацин (нестероидное противовоспалительное лекарственное средство); сульфасалазин (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); азатиоприн (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S281); ингибитор ICE (ингибитор фермента интерлейкин-1β преобразующего фермента); ингибитор zap-70 и/или lck (ингибитор тирозинкиназы zap-70 или lck); ингибитор VEGF и/или ингибитор VEGF-R (ингибиторы фактора роста васкулярных эндотелиальных клеток или рецептора фактора роста васкулярных эндотелиальных клеток; ингибиторы ангиогенеза); кортикостероидные противовоспалительные лекарственные средства (например, SB203580); ингибиторы TNF-конвертазы; антитела против IL-12; антитела против IL-18; интерлейкин-11 (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S296); интерлейкин-13 (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S308); ингибиторы интерлейкина-17 (см., например, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (supplement), S120); золото; пеницилламин; хлорохин; гидроксихлорохин; хлорамбуцил; циклоспорин; циклофосфамид; общее облучение лимфоидной ткани; противотимоцитный глобулин; антитела против CD4; токсины CD5; пептиды для перорального введения и коллаген; лобензарит динатрия; агенты регуляции цитокина (CRA) HP228 и HP466 (Houghten Pharmaceuticals, Inc.); антисмысловые фосфоротиоатные олигодезоксинуклеотиды ICAM-1 (ISIS 2302; Isis Pharmaceuticals, Inc.); растворимый рецептор комплемента 1 (TP10; T Cell Sciences, Inc.); преднизон; орготеин; полисульфат глюкозаминогликана; миноциклин; антитела против IL2R; морские и растительные липиды (жирные кислоты из рыбы и семян растений; см., например, DeLuca и др. (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21:759-777); ауранофин; фенилбутазон; меклофенамовая кислота; флуфенамовая кислота; внутривенный иммунный глобулин; зилейтон; азарибин; микофенольная кислота (RS-61443); такролимус (FK-506); сиролимус (рапамицин); амиприлоза (терафектин); кладрибин (2-хлордезоксиаденозин); метотрексат; противовирусные препараты; и иммуномодулирующие агенты. Любые из вышеупомянутых агентов могут быть введены в сочетании с антителом против TNFα согласно изобретению для лечения связанных с TNFα расстройств с использованием способов лечения многократно-вариабельными дозами или разовой дозой согласно изобретению.

В одном варианте осуществления изобретение включает в себя изделие или способ обработки для определения эффективности ингибитора TNF в сочетании с одним из следующих агентов для лечения связанных с TNFα расстройств, при которых активность TNFα является определяющей: антитело против IL12 (ABT 874); антитело против IL18 (ABT 325); низкомолекулярный ингибитор LCK; низкомолекулярный ингибитор COT; антитело против IL1; низкомолекулярный ингибитор MK2; антитело против CD19; низкомолекулярный ингибитор CXCR3; низкомолекулярный ингибитор CCR5; низкомолекулярный ингибитор CCR1l антитела против E/L селектина; низкомолекулярный ингибитор P2X7; низкомолекулярный ингибитор IRAK-4; низкомолекулярный агонист рецептора глюкокортикоида; антитело против рецептора C5a; низкомолекулярный ингибитор рецептора C5a; антитело против CD32; и CD32 в качестве терапевтического белка.

В еще одном варианте осуществления изобретение включает в себя изделие или способ обработки для определения эффективности ингибитора TNF в сочетании с антибиотиком или противоинфекционным агентом. Противоинфекционные агенты включают в себя такие агенты, про которые известно в данной области, что они излечивают вирусные, грибковые, паразитические или бактериальные инфекции. Здесь термин «антибиотик» относится к химическому веществу, которое ингибирует рост или убивает микроорганизмы. Этот термин включает в себя как антибиотики, продуцируемые микроорганизмами, так и синтетические антибиотики (например, аналоги), известные в данной области. Антибиотики включают в себя, но не ограничиваются ими, кларитромицин (Biaxin®), ципрофлоксацин (Cipro®) и метронидазол (Flagyl®).

В другом варианте осуществления изобретение включает в себя изделие или способ обработки для определения эффективности ингибитора TNF в сочетании с лекарственным средством, используемым для лечения болезни Крона или связанного с ней расстройства. Примеры терапевтических агентов, которые могут быть использованы для лечения болезни Крона, включают в себя следующие: мезаламин, преднизон, азатиоприн, меркаптопурин, инфликсимаб, будезонид, сульфасалазин, метилпреднизолон sod succ, дифеноксилат/atrop sulf, гидрохлорид лоперамида, метотрексат, омепразол, фолат, ципрофлоксацин/декстрозная вода, битартат гидрокодона, гидрокодон/apap, гидрохлорид тетрациклина, флуоцинонид, метронидазол, тимеросал/борная кислота, сульфат гиосциамина, холестирамин/сахароза, гидрохлорид ципрофлоксацина, гидрохлорид меперидина, гидрохлорид мидазолама, оксикодон hcl/ацетаминофен, гидрохлорид прометазина, фосфат натрия, сульфаметоксазол/триметоприм, целекоксиб, поликарбофил, пропоксифена напсилат, гидрокортизон, мультивитамины, балсалазид динатрия, фосфат кодеина/apap, колесевелам hcl, цианокобаламин, фолиевая кислота, левофлоксацин, натализумаб, метилпреднизолон, интерферон-гамма и сарграмостим (GM-CSF). В одном варианте осуществления метотрексат вводят для лечения болезни Крона в дозе от 2,5 мг до 30 мг в неделю.

Антитело против TNFα может быть введено в комбинации с местными кортикостероидами, аналогами витамина D и местными или пероральными ретиноидами или их комбинацией для лечения псориаза. В дополнение, антитело против TNFα может быть введено в сочетании с одним или несколькими из следующих агентов для лечения псориаза: низкомолекулярный ингибитор KDR (ABT-123), низкомолекулярный ингибитор Tie-2, кальципотриен, пропионат клобетазола, ацетонид триамцинолона, пропионат галобетазола, тазаротен, метотрексат, флуоцинонид, бетаметазон diprop усиленный, флуоцинолон, ацетонид, ацитретин, смоляной шампунь, валерат бетаметазона, фуроат мометазона, кетоконазол, прамоксин/флуоцинолон, валерат гидрокортизона, флурандренолид, мочевина, бетаметазон, пропионат клобетазола /emoll, пропионат флутиказона, азитромицин, гидрокортизон, увлажняющая смесь, фолиевая кислота, дезонид, каменноугольный деготь, дифлоразона диацетат, этанерцепт, фолат, молочная кислота, метоксален, hc/висмут subgal/znox/resor, ацетат метиленпреднизолона, преднизон, солнцезащитный крем, салициловая кислота, галцинонид, антралин, пивалат клокортолона, угольный экстракт, каменноугольный деготь/салициловая кислота, каменноугольный деготь/салициловая кислота/сера, дезоксиметазон, диазепам, смягчающее средство, смягчитель пимекролимус, флуоцинонид/смягчающее средство, минеральное масло/касторовое масло/na lact, минеральное масло/арахисовое масло, нефть/изопропилмиристат, псорален, салициловая кислота, мыло/трибромсалан, тимеросал/борная кислота, целекоксиб, инфликсимаб, алефацепт, эфализумаб, такролимус, пимекролимус, PUVA, UVB и другая фототерапия и сульфасалазин.

В одном варианте осуществления антитело против TNFα согласно изобретению вводят с использованием способа многократно-вариабельной дозы для лечения AS в комбинации с одним из вышеупомянутых агентов для лечения внутреннего расстройства. В другом варианте осуществления вышеупомянутые дополнительные агенты используют в комбинации с антителом против TNFα в способе лечения разовой дозой согласно изобретению. В еще одном варианте осуществления антитело против TNFα вводят в двухнедельном режиме дозирования.

Любой из упомянутых выше терапевтических агентов, по одному или в комбинации с другим, может быть введен субъекту, страдающему от связанных с TNFα расстройств, при которых TNFα является определяющим фактором, в комбинации с антителом против TNFα с использованием режима лечения многократно-вариабельной дозой. В одном варианте осуществления любой из упомянутых выше терапевтических агентов, по одному или в комбинации с другим, может быть введен субъекту, страдающему от внутреннего расстройства, в дополнение к антителу против TNFα для лечения другого связанного с TNFα расстройства, такого как ревматоидный артрит. Следует понимать, что дополнительные терапевтические агенты могут быть использованы в комбинационной терапии, как описано выше, но также могут быть использованы при других показаниях, описанных здесь, где требуется положительный эффект.

Представленное изобретение дополнительно иллюстрируется следующим примером, который не должен быть истолкован как ограничивающий.

ПРИМЕР

Пример 1 : Адалимумаб подавляет биомаркеры деградации хряща и синовита при активном анкилозирующем спондилите (AS)

Целью следующего исследования было проанализировать потенциальные биомаркеры разрушения хряща и кости, например маркеры резорбции кости, маркеры деградации коллагена и маркеры синовита, в контролируемом испытании адалимумаба при лечении AS от средней до тяжелой степени. Это исследование также проводится для анализа действия ингибитора TNF, например адалимумаба, на корреляцию маркера резорбции кости, маркера деградации коллагена и маркера синовита с CRP, известным маркером AS, для исследования больных AS.

Методы

Пациенты с активным AS, которые имели недостаточную реакцию по меньшей мере на одно NSAID или DMARD, были пригодны для включения в это исследование. Схема исследования изображена на фигуре 1. Пациентам случайным образом вводили плацебо или 40 мг адалимумаба подкожно (sc) через неделю (eow) во время начального 24-недельного периода двойного слепого введения, с последующим 80-недельным периодом открытого введения. Три биомаркера были проанализированы в начале исследований и после лечения адалимумабом или плацебо на 12 и 24 неделе. Конкретно, были проанализированы маркер резорбции костей, сывороточный N-телопептид коллагена I типа (NTX), биомаркер деградации коллагена, мочевой C-телопептид коллагена II типа (мочевой CTX-II) и биомаркер синовита, сывороточная матриксная металлопротеиназа 3 (MMPS). Таким образом, первичные параметры эффективности включали в критерий рабочей группы оценки AS (ASAS), Bath AS Disease Activity Index (BASDAI) и CRP. С помощью ELISA концентрации мочевого C-телопептида коллагена II типа (мочевой CTX-II), сывороточного N-телопептида коллагена типа I (NTX) и сывороточного MMP3 измеряли для каждого пациента до начала исследований и на 12 и 24 неделе. Определяли разницу в концентрации от основного уровня в каждой группе лечения, так же как и корреляцию между изменениями этих биомаркеров и другие последствия AS.

Критерии включения пациентов включали следующее: пациенты ≥18 лет; активный AS, определяемый выполнением по меньшей мере 2 из следующих 3 критериев: (1) значение BASDAI ≥4, (2) значение общей боли в спине по визуальной аналоговой шкале (VAS) ≥4, утренняя неподвижность ≥1 час; и недостаточная реакция по меньшей мере на одно NSAID.

Критерии исключения пациентов были следующими: полученное ранее лечение против TNF; радиологическое свидетельство полного позвоночного анкилоза (бамбукового позвоночника); использование предыдущего DMARD в течение 4 недель до исходной точки (кроме метотрексата, сульфасалазина или гидроксихлорохина); внутрисуставная инъекция кортикостероидов в течение 4 недель перед исходной точкой; и использование другой биологической или исследовательской терапии в пределах 6 недель перед исходной точкой.

Результаты

Всего было набрано 82 пациента: 44 пациента для плацебо против 38 пациентов для адалимумаба. Из 82 пациентов всего 80 (98%) пациентов завершили 24-недельный период. Два пациента, не завершивших 24-недельный период, были из группы плацебо. Исходные характеристики были сходными в обеих группах лечения. Демография исходного состояния показана в таблице 1 ниже.

Таблица 1 Демография исходного состояния
	Плацебо (N=44)	Адалимумаб 40 мг через неделю (N=38)
Возраст (лет)†	40,0	41,9
Раса (% кавказской)	42 (95,5)	37 (97,4)
Пол (% мужской)	36 (81,8)	29 (76,3)
Масса (кг)†	78,2	76,1
Продолжительность AS (лет)†	12,1	14,5
CRP (мг/100 мл)†	2,3	1,8
NTX (nm/bce)†	9,77	10,5
Концентрация мочевого CTX-II (нг/мл)	388,2	324,8
MMP-3 (нг/мл)†	57,1	25,3

Среди всех пациентов в исследовании уровни CRP в значительной степени коррелировали с уровнями мочевого CTX-II, MMP3 и NTX в исходном состоянии. Корреляция между CRP и уровнями мочевого CTX-II была выше, чем корреляция между CRP и уровнями MMP3 и NTX. Корреляции уровней биомаркера и CRP показаны ниже в таблице 2.

Таблица 2 Корреляции уровней биомаркера и CRP в исходном состоянии
Все пациенты в исходном состоянии	r=значение корреляции (N, p-значение)
Мочевой CTX-II	MMP3	NTX
CRP	0,71 (80, <0,001)	0,45 (81, <0,001)	0,37 (80, 0,001)
Мочевой CTX-II	-	0,27 (79, 0,015)	0,49 (78, <0,001)
r= значение корреляции N= пациенты

Значительное уменьшение концентраций мочевого CTX-II и MMP3 (показанные ниже в таблице 3) происходили у пациентов после адалимумаба по отношению к пациентам после плацебо на 12 и 24 неделе (p<0,001), но для NTX значительной разницы не было.

Таблица 3 Значительное уменьшение концентраций мочевого CTX-II и MMP3
Биомаркер	Посещение	Изменения для адалимумаба(%)	Изменения для плацебо(%)
Мочевой CTX-II	12 неделя	-76,8 (-9,6)	43,8 (22,2)
	24 неделя	-64,7 (3,2)	47,4 (29,8)
MMP3	12 неделя	-3,9 (-12,3)	12,4 (18,9)
	24 неделя	-3,2 (-8,6)	12,5 (20,1)

Как показано на фигуре 2, пациенты после адалимумаба испытывают значительное уменьшение уровней мочевого CTX-II по отношению к плацебо на 12 неделе и 24 неделе. Пациенты после адалимумаба также испытывали статистически значимое уменьшение уровней MMP3 по отношению к пациентам после плацебо на 12 неделе и 24 неделе, как показано на фигуре 3. Уровни CRP были значительно уменьшены у пациентов после адалимумаба по сравнению с пациентами после плацебо на неделе 12 и неделе 24 (см. фигуру 4).

Изменения в уровнях CRP, мочевого CTX-II и MMP3 по отношению к основному уровню к 12 неделе статистически достоверно коррелировали в группе адалимумаба. Значительные корреляции были обнаружены между основным уровнем CRP и 1) мочевым CTX-II (r=0,71), 2) MMP3 (r=0,45) и 3) NTX (r=0,37) (p≤0,001), и между мочевым CTX-II и NTX (r=0,49; p<0,0001). Изменения за двенадцать недель в мочевом CTX-II и MMP3 коррелировали в значительной степени с изменениями в CRP (r=0,40 и 0,43 соответственно) (p≤0,005). В дополнение, 12-недельные изменения в мочевом CTX-II коррелировали в значительной степени с изменениями MMP3 (r=0,41, p<0,0001). В группе адалимумаба корреляционный анализ подтверждает, что улучшение в уровнях CRP связано с уменьшением уровней мочевого CTX-II и MMP3. Корреляции между CRP и изменениями биомаркера относительно основного уровня на 12 неделе показано в таблице (4).

Таблица 4 Корреляции между CRP и изменениями биомаркера относительно основного уровня на 12 неделе*
Плацебо	R=значение корреляции (N, p-значение†)
Мочевой CTX-II	MMP3	NTX
CRP	0,21 (42, 0,172)	0,34 (44, 0,023)	0,08 (43, 0,629)
Мочевой CTX-II	-	0,45 (42, 0,003)	0,27 (41, 0,089)
Адалимумаб	Мочевой CTX-II	MMP3	NTX
CRP	0,41 (38, 0,010)	0,37 (37, 0,024)	0,08 (37, 0,620)
Мочевой CTX-II	-	0,15 (37, 0,375)	0,10 (37, 0,540)

В заключение, у пациентов с AS от средней до тяжелой степени адалимумаб значительно подавляет биомаркеры, которые отражают синовиты и деградацию матрикса хряща. Адалимумаб индуцирует подавление биомаркеров, отражающих синовиты (MMP3) и деградацию матрикса хряща (мочевого CTX-II), означая, что адалимумаб замедляет структурные повреждения, ассоциированные с AS. В дополнение, изменения в уровнях мочевого CTX-II и MMP3 в значительной степени коррелировали с изменениями в CRP.

ЭКВИВАЛЕНТЫ

Специалисты в данной области поймут или смогут установить с использованием обычных экспериментов многие эквиваленты определенных вариантов осуществления описанного здесь изобретения. Такие эквиваленты предполагаются включенными в последующую формулу изобретения. Содержание всех ссылок, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых в данной заявке, включены здесь в виде ссылки.

1. Способ определения эффективности антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), включающий определение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида, с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена, связанным с AS, и известным стандартным уровнем биомаркера синовита, связанным с AS; где снижение уровня биомаркера деградации коллагена и снижение уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у пациента, по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена, связанным с AS, и известным стандартным уровнем биомаркера синовита, связанным с AS, указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

2. Способ по п.1, в котором биомаркер деградации коллагена является С-телопептидом коллагена II типа (СТХ-II).

3. Способ по п.2, в котором биомаркер деградации коллагена является мочевым С-телопептидом коллагена II типа (СТХ-II).

4. Способ по п.1, в котором биомаркер синовита является матриксной металлопротеиназой 3 (ММР3).

5. Способ по п.4, в котором биомаркер синовита является сывороточной металлопротеиназой 3 (ММР3).

6. Способ по п.1, в котором определяется эффективность антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части для улучшения структурного повреждения, связанного с AS.

7. Способ по п.1, дополнительно включающий определение уровня С-реактивного белка (CRP) в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня CRP в образце с известным стандартным уровнем CRP, связанным с AS, где низкий уровень CRP в образце по сравнению с известным стандартным уровнем CRP, связанным с AS, указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения AS у индивида.

8. Способ по любому из пп.1-7, где антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, антитела человека и поливалентного антитела.

9. Способ по п.8, где антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть, представляет собой антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающую часть.

10. Способ по п.9, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNFα человека с Kd порядка 1·10^-8 M или менее и константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, причем обе константы определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть нейтрализует цитотоксичность TNFα человека в стандартном анализе in vitro L929 с IC₅₀ порядка 1·10^-7 M или менее.

11. Способ по п.9, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:
a) диссоциирует из комплекса с TNFα человек с константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;
b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;
c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

12. Способ по п.9, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную единственной заменой аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную единственной заменой аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

13. Способ по п.9, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

14. Способ по п.9, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть представляет собой адалимумаб.

15. Способ определения эффективности антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где указанный способ включает сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида, с базовым уровнем биомаркера деградации коллагена и базовым уровнем биомаркера синовита, где снижение уровня биомаркера деградации коллагена и снижение уровня биомаркера синовита в образце(ах) по сравнению с базовым уровнем биомаркера деградации коллагена и базовым уровнем биомаркера синовита указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

16. Способ по п.15, в котором биомаркером деградации коллагена является С-телопептид коллагена II типа.

17. Способ по п.16, в котором биомаркером деградации коллагена является мочевой С-телопептид коллагена II типа.

18. Способ по п.15, в котором биомаркером синовита является матриксная металлопротеиназа 3 (ММР3).

19. Способ по п.18, в котором биомаркером синовита является сывороточная матриксная металлопротеиназа 3 (ММР3).

20. Способ определения эффективности антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где способ включает определение уровня С-телопептида коллагена II типа (СТХ-II) в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня СТХ-II в образце(ах), полученном у индивида с базовым уровнем СТХ-II, где снижение уровня СТХ-II в образце(ах) по меньшей мере на 9% относительно базового уровня СТХ-II указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

21. Способ по п.20, в котором биомаркером С-телопептид коллагена II типа является мочевой С-телопептид коллагена II типа.

22. Способ по любому из пп.15-21, в котором антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, антитела человека и поливалентного антитела.

23. Способ по п.22, где антитело против TNFα или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающий фрагмент.

24. Способ по п.23, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающий фрагмент диссоциирует из комплекса с TNFα человека с Kd порядка 1·10^-8 M или менее и константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, причем обе константы определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающий фрагмент нейтрализует цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе in vitro L929 с IC₅₀ порядка 1·10^-7 M или менее.

25. Способ по п.23, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:
а) диссоциирует из комплекса с TNFα человека с константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;
b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;
c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

26. Способ по п.23, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

27. Способ по п.23, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

28. Способ по п.23, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть представляет собой адалимумаб.

29. Способ определения эффективности антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего AS, где способ включает определение уровня С-телопептида коллагена II типа (СТХ-II) в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, и сравнение уровня СТХ-II в образце(ах), полученном у индивида, с известным стандартным уровнем СТХ-II, связанным с AS, где снижение уровня СТХ-II в образце(ах) по меньшей мере на 9% относительно известного стандартного уровня СТХ-II указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

30. Способ по п.29, в котором биомаркером деградации коллагена С-телопептид коллагена II типа является мочевой С-телопептид коллагена II типа.

31. Способ по любому из пп.15-21, где антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, антитела человека и поливалентного антитела.

32. Способ по п.22, где антитело против TNFα или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающий фрагмент.

33. Способ по любому из пп.29 или 30, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса TNFα человека с Kd порядка 1·10^-8 M или менее и константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, где обе константы определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и указанное антитело нейтрализует цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе in vitro L929 с IC₅₀ порядка 1·10^-7 M или менее.

34. Способ по любому из пп.29 или 30, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:
a) диссоциирует из комплекса с TNFα человека с константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;
b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;
c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

35. Способ по любому из пп.29 или 30, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

36. Способ по любому из пп.29 или 30, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

37. Способ по любому из пп.29 или 30, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть представляет собой адалимумаб.

38. Способ по любому из пп.1, 15, 20 или 29, где уровень биомаркера определяют путем проведения ELISA.

39. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-19, содержащий: а) детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер деградации коллагена, детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер синовита или детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер деградации коллагена и детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер синовита; b) инструкции по применению; и с) необязательно, реактивы для выделения образца из организма пациента.

40. Набор по п.39, где детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер деградации коллагена, распознает мочевой СТХ-II.

41. Набор по п.39, где детектируемый агент, который специфически распознает биомаркер синовита, распознает сывороточный ММР3.

42. Способ определения эффективности антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где способ включает определение уровня С-телопептида коллагена II типа (СТХ-II) и уровня матричной металлопротеазы 3 (ММР3) в образце(ах), полученном у индивида, страдающего AS, после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части, и сравнение уровня СТХ-II и уровня ММР3 в образце(ах), полученном у индивида, с известным стандартным уровнем СТХ-II, связанным с AS, и известным стандартным уровнем ММРЗ, связанным с AS, где снижение уровня СТХ-II и снижение уровня ММР3 в образце(ах) по сравнению с известным стандартным уровнем СТХ-II и по сравнению с известным стандартным уровнем ММРЗ указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для уменьшения разрушения структуры, связанного с AS, у индивида.

43. Способ по п.42, где уровень СТХ-II снижается в образце(ах), полученном у пациента, не менее чем приблизительно на 9% по сравнению с известным стандартным уровнем СТХ-II, связанным с AS.

44. Способ по п.42, где СТХ-II представляет собой мочевой СТХ-II.

45. Способ по п.42, где уровень СТХ-II и/или уровень ММР3 определяют путем проведения ELISA.

46. Способ по п.42, в котором антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть выбрано из группы, состоящей из химерного антитела, гуманизированного антитела, человеческого антитела и поливалентного антитела.

47. Способ по п.42, в котором антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть выбрано из группы, состоящей из инфликсимаба, голимумаба или адалимумаба.

48. Способ по п.46, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNFα человека с Kd порядка 1·10^-8 М или менее и константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, причем обе константы определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и указанное антитело нейтрализует цитотоксичность TNFα человека в стандартном анализе in vitro L929 с IC₅₀ порядка 1·10^-7 М или менее.

49. Способ по п.46, в котором антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:
a) диссоциирует из комплекса с TNFα человека с константой скорости K_off порядка 1·10³ с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;
b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;
с) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти из консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

50. Способ по п.46, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

51. Способ по любому из пп.20 или 29, дополнительно включающий определение уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у пациента, после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента; и сравнение уровня биомаркера синовита в образце(ах) с известным стандартным уровнем биомаркера синовита, связанным с AS, где уменьшение уровня биомаркера синовита в образце(ах) по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера синовита указывает на то, что антитело против TNFα эффективно для лечения индивида, страдающего AS.

52. Способ по п.51, где биомаркер синовита представляет собой ММР-3.

53. Способ по любому из пп.42-52, где уровень биомаркера определяют путем проведения ELISA.

54. Набор для осуществления способа по любому из пп.42-52, содержащий а) детектируемый агент, который специфически распознает СТХ-II; b) инструкции по применению; и с) необязательно, реактивы для выделения образца из организма пациента.

55. Набор по п.54, дополнительно содержащий детектируемый агент, который специфически распознает ММР-3.

56. Способ определения эффективности антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где способ включает определение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученного у индивида после введения антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученного у индивида, с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена, связанным с AS, и известным стандартным уровнем биомаркера синовита, связанным с AS; где снижение уровня биомаркера деградации коллагена и снижение уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученного у пациента, по сравнению с известным стандартным уровнем биомаркера деградации коллагена, связанным с AS, и известным стандартным уровнем биомаркера синовита, связанным с AS, указывает на то, что антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть являются эффективными для лечения индивида, страдающего AS.

57. Способ определения эффективности антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где указанный способ включает сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня биомаркера деградации коллагена и уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида, с базовым уровнем биомаркера деградации коллагена и базовым уровнем биомаркера синовита, где снижение уровня биомаркера деградации коллагена и снижение уровня биомаркера синовита в образце(ах) по сравнению с базовым уровнем биомаркера деградации коллагена и базовым уровнем биомаркера синовита указывает на то, что антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

58. Способ определения эффективности антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где способ включает определение уровня С-телопептида коллагена II типа (СТХ-II) в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части, и сравнение уровня СТХ-II в образце(ах), полученном у индивида с базовым уровнем СТХ-II, где снижение уровня СТХ-II в образце(ах) по меньшей мере на 9% относительно базового уровня СТХ-II указывает на то, что антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

59. Способ определения эффективности антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где способ включает определение уровня С-телопептида коллагена II типа (СТХ-II) в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части, и сравнение уровня СТХ-II в образце(ах), полученном у индивида с известным стандартным уровнем СТХ-II, где снижение уровня СТХ-II в образце(ах) по меньшей мере на 9% относительно известного стандартного уровня СТХ-II указывает на то, что антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

60. Способ определения эффективности антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части для лечения индивида, страдающего анкилозирующим спондилитом (AS), где способ включает определение уровня С-телопептида коллагена II типа (СТХ-II) и уровня матричной металлопротеазы 3 (ММР3) в образце(ах), полученном у индивида, страдающего AS, после введения антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части, и сравнение уровня СТХ-II и уровня ММР3 в образце(ах), полученном у индивида, с известным стандартным уровнем СТХ-II, связанным с AS, и известным стандартным уровнем ММР3, связанным с AS, где снижение уровня СТХ-II и снижение уровня ММР3 в образце(ах) по сравнению с известным стандартным уровнем СТХ-II и по сравнению с известным стандартным уровнем ММРЗ указывает на то, что антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть является эффективным для уменьшения разрушения структуры, связанного с AS, у индивида.

61. Способ по любому из пп.56 или 57, где маркер деградации коллагена представляет собой С-телопептид коллагена II типа (СТХ-II).

62. Способ по п.61, где маркер деградации коллагена является мочевым С-телопептидом коллагена II типа (СТХ-II).

63. Способ по п.56 или 57, где биомаркер синовита является матриксной металлопротеазой 3 (ММР3).

64. Способ по п.63, в котором биомаркер синовита является сывороточной металлопротеиназой 3 (ММР3).

65. Способ по любому из пп.56-60, в котором определяется эффективность антитела против TNFα человека или его антигенсвязывающей части для улучшения структурного повреждения, связанного с AS.

66. Способ по любому из пп.56-60, дополнительно включающий определение уровня С-реактивного белка (CRP) в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающей части; и сравнение уровня CRP в образце с известным стандартным уровнем CRP, связанным с AS, где низкий уровень CRP в образце по сравнению с известным стандартным уровнем CRP, связанным с AS, указывает на то, что антитело против TNFα или его антигенсвязывающая часть является эффективным для лечения AS у индивида.

67. Способ по любому из пп.56-60, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть диссоциирует из комплекса с TNFα человека с Kd порядка 1·10^-8 M или менее и константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, причем обе константы определены с помощью поверхностного плазмонного резонанса, и где указанное антитело нейтрализует цитотоксичность человеческого TNFα в стандартном анализе in vitro L929 с IC₅₀ порядка 1·10^-7 M или менее.

68. Способ по любому из пп.56-60, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть имеет следующие характеристики:
a) диссоциирует из комплекса с TNFα человека с константой скорости K_off порядка 1·10^-3 с^-1 или менее, определяемой с помощью поверхностного плазмонного резонанса;
b) имеет домен CDR3 легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 1, 3, 4, 6, 7, 8 и/или 9;
c) имеет домен CDR3 тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную путем единственной замены аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11 или путем одной-пяти консервативных аминокислотных замен в положениях 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 и/или 12.

69. Способ по любому из пп.56-60, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3 или последовательность SEQ ID NO:3, модифицированную единственной заменой аланина в положении 1, 4, 5, 7 или 8, и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR) с доменом CDR3, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4 или последовательность SEQ ID NO:4, модифицированную единственной заменой аланина в положении 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 или 11.

70. Способ по любому из пп.56-60, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.

71. Способ по любому из пп.56-60, где антитело против TNFα человека или его антигенсвязывающая часть представляет собой адалимумаб.

72. Способ по п.57 или 58, где уровень биомаркера определяют путем проведения ELISA.

73. Способ по любому из пп.58 или 59, дополнительно включающий определение уровня биомаркера синовита в образце(ах), полученном у индивида после введения антитела против TNFα или его антигенсвязывающего фрагмента; и сравнение уровня биомаркера синовита в образце(ах) с известным стандартным уровнем биомаркера синовита, связанного с AS, где низкий уровень биомаркера синовита в образце(ах) относительно известного стандартного уровня биомаркера синовита указывает на то, что антитело против TNFα человека является эффективным для лечения индивида, страдающего AS.

74. Способ по п.73, где биомаркер синовита является ММР3.