Способ определения фракций липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца
Владельцы патента RU 2439580:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Национальный исследовательский Томский политехнический университет" (RU)
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU)
Государственное учреждение Научно-исследовательский институт кардиологии Томского научного центра (RU)
Областное государственное учреждение здравоохранения "Томский областной центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями" (RU)
Изобретение относится к медицине и касается способа определения фракций липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца. Сущность способа заключается в том, что обрабатывают сыворотку крови пациента в течение 1 ч в темноте при 40°С раствором красителя Судана Б, добавляют раствор агарозы, вносят прогретую до 55°С смесь в лунку геля агарозы объемом 4×20×10 мм, фиксируют электрофореграмму, высушивают и проводят денситометрию, при этом к 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента дополнительно добавляют 0,1 мл 0,1% раствора тритона Х-100 и инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин и проводят дезинтеграцию липопротеинов. Использование способа позволяет выявить максимально возможные интенсивные минорные фракции ЛП крови, что повышает его чувствительность и точность. 3 ил.
Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в кардиологии и терапии.
Известны способы разделения на фракции липопротеинов (ЛП) крови методом аналитического ультрацентрифугирования крови (А.Н.Климова, Н.Г.Никульчева. Липиды, липопротеины и атеросклероз, 1995, Питер, пресс, с.98-102) и разделения на фракции ЛП в полиакриламидном геле (Н.Н.Шацкая. Биохимические исследования в оценке состояния сердечно-сосудистой системы. В кн. "Методы исследований в профпатологии", М., 1988, с.95-97).
Известны также способы разделения на фракции ЛП путем электрофореза в геле агарозы (Фенотипирование гиперлипопротеинемий на основе электрофореза липопротеинов в геле агарозы, Лаб. Дело, 1980, №5, с.287-290); RU 2099693 C1, 20.12.1997. RU 2102767 C1, 20.01.1998. SU 1334087 A1, 30.08.1987. US 5547873 A, 20.08.1996.
Недостатком данных способов является то, что они не позволяют выявить все фракции ЛП крови, включая ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП и ЛП (а), а служат для разделения на фракции ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП от комплекса альбумина с неэтерифицированными жирными кислотами.
Известен также способ определения фракций липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца (RU №2360256 C1, 27.06.2009, Бюл. №18.)
Данный способ является наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату и выбран в качестве прототипа.
Недостатком способа-прототипа является малая точность, так как он не позволяет выявить минорные фракции ЛП. Это связано с тем, что фракция ЛП (а) является наиболее атерогенной и для ранней диагностики заболевания особенно важно выявление минорной фракции ЛП (а), наряду с максимально полным определением фракций других ЛП крови.
Задачей предлагаемого изобретения является повышение точности и чувствительности способа.
Указанная задача решается разделением на фракции липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца (ИБС) электрофорезом в геле агарозы, путем обработки пробы сыворотки крови пациента в течение 1 ч в темноте при 40°С раствором красителя Судана Б, добавления раствора агарозы, внесения прогретой до 55°С смеси в лунку геля агарозы объемом 4×20×10 мм, последующей фиксации электрофореграмм, их высушивания и денситометрирования, при этом предварительно к 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента добавляют 0,1 мл 0,1% раствора тритона Х-100 и инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин и проводят дезинтеграцию липопротеинов.
Новым в предлагаемом изобретении является дополнительная инкубация 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента с 0,1 мл 0,1% раствора детергента тритона Х-100 при 20°С в течение 15 мин, перемешиванием смеси методом встряхивания 120 раз в 1 мин и проведение дезинтеграции липопротеинов, что позволяет выявлять в максимальной концентрации минорные фракции ЛП крови.
Исследование ЛП разных классов при диагностике ишемической болезни сердца (ИБС) рекомендовано Всероссийским научным обществом кардиологов согласно положению рекомендаций Европейского общества по изучению атеросклероза - «Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза» (г.Москва, 2005 г.; Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008 г., с.21-32).
В настоящее время перспективными являются методы исследования липидов с детергентами /Тритон Х-100 и др./. В лабораторной практике все больше используются прямые или гомогенные методы определения липопротеинов (ЛП) и их липидов. Такие методы основаны на использовании различных детергентов, способных блокировать или солюбилизировать классы ЛП для специфического выделения ЛПВП, ЛПНП и других фракций ЛП.
При использовании таких методов изоляция других классов ЛП не требует дополнительных операций и концентрацию холестерина (ХС) в классах ЛП можно определить напрямую в сыворотке крови общепринятыми ферментными методами в той же кювете («Клиническая лабораторная диагностика, №10, 2008 г., с.21-32).
В настоящее время особое внимание уделяется исследованию ЛП (а), в связи с чем разрабатываются способы лабораторной диагностики, позволяющие исследовать этот липопротеин крови. Он относится к апо-В-содержащим липопротеинам, богатым холестеролом (ХС). ЛП (а) идентичен "тонущим" пре-β-ЛП (sinking pre-d-Lp), имеющим при электрофорезе подвижность пре-β-ЛП. ЛП (а) содержат 27% белка, 8% углеводов и 65% липидов, из которых ЭХС составляют 59%, НЭХС - 14%, ФЛ - 14%.
Белковым компонентом ЛП (а) является высокогликозилированный полипептид - апо (а), имеющий близкое структурное сродство к плазминогену - одному из факторов системы свертывания-противосвертывания крови. При росте концентрации ЛП (а) в крови нарушаются процессы микроциркуляции в кровеносных артериях с возможным образованием микротромбов.
Благодаря наличию в структуре апо (а) сиаловых кислот, ЛП (а) более отрицательно заряжен по сравнению с β-ЛП в электрическом поле, лучше растворим в воде, может взаимодействовать с ионами металлов (кальция). Этот липопротеин гетерогенен. Все это свидетельствует об особой роли ЛП (а) в атерогенезе.
ЛП (а) могут взаимодействовать с ЛПНП-рецепторами, оказывая слабое влияние на активность ГМК-КоА редуктазы, на этерификацию ХС. Период полураспада ЛП (а) длиннее, чем у ЛПНП, и составляет 3,3 сут. Содержание ЛП (а) в крови в норме не превышает 30 мг/л. При высокой концентрации в крови ЛП (а) выявляется в местах поражения сосудов в области скопления фибриногена. Повышенная концентрация ЛП (а) часто сочетается с IIа, IIб типами гиперлипопротеинемий. Поэтому в клинической практике крайне важно определение ЛП (а), одновременно с определением белков острой фазы воспаления. Установлено, что большинство гиполипидемических препаратов не влияет на повышенный уровень ЛП (а). Мировые популяционные исследования показали, что ЛП (а) представляет собой самостоятельный и независимый фактор риска ИБС - наиболее тяжелого проявления атеросклероза, являясь его предиктором, то есть свидетельствует о генетической предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям, фатальному и нефатальному инфаркту миокарда и ишемическому инсульту.
Фракция ЛП (а) гетерогенна. Установлено, что при электрофорезе ЛП (а) находятся в области β-глобулинов, но до 5% ЛП (а) при этом могут выявляться в области α-глобулинов.
По причине такой выраженной гетерогенности достаточно сложно оценить при электрофорезе всю фракцию ЛП (а), а тем более ее минорные подфракции, которые могут остаться на линии старта, если размер их частиц достаточно велик. Поэтому использование общепринятого в исследованиях последнего пятидесятилетия детергента Тритон Х-100 для обработки сыворотки крови, а именно липопротеинов крови, ведущее к частичной делипидизации ЛП и увеличению их подвижности при электрофорезе, позволяет выявить минорные фракции ЛП (а). Поскольку ЛП (а) наиболее атерогенен, очень важно на ранних стадиях заболевания выявлять максимальное содержание ЛП (а) в крови каждого пациента. Это позволяет диагностировать ИБС еще до стадии значительных изменений других клинико-лабораторных показаний, повышает точность диагностики заболевания. В свою очередь таким пациентам рано назначается патогенетически обоснованная терапия. Не менее важно выявление минорных фракций ЛП (а) для оценки эффективности терапии заболевания и прогнозирования течения ИБС и инсульта.
Все сказанное свидетельствует о крайней важности разработки способов лабораторной диагностики, позволяющих максимально полно выявлять ЛП (а), включая и минорные фракции ЛП (а).
Существенные признаки, характеризующие изобретение, проявили в заявляемой совокупности новые свойства, явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и не очевидные для специалиста.
Идентичной совокупности признаков не обнаружено при изучении патентной и научно-медицинской литературы.
Данное изобретение может быть использовано в практическом здравоохранении для повышения точности диагностики у больных ИБС.
Таким образом, следует считать данное техническое решение соответствующим условиям патентоспособности: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенных чертежей.
На фиг.1 представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови: а - в группе контроля способом-прототипом, б - в группе контроля предлагаемым способом;
На фиг.2 (а, б, в) представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных ИБС (I группа);
На фиг.3 представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больного ИБС (клинический пример): а - способом-прототипом, б - предлагаемым способом.
Способ осуществляется следующим образом поэтапно:
1) приготовление раствора Судана Б: 400 мг Судана Б растворяют в 20 мг этиленгликоля на кипящей водяной бане в течение 50 минут, фильтруют, хранят в стеклянной посуде;
2) приготовление геля агарозы: 320 мг агарозы А фирмы "Sigma" растворяют в 20 мл воды для кипячения, затем помещают в термостат при 55°С; добавляют 20 мл раствора альбумина (1 г альбумина в 200 мл вероналмединалового буфера, рН 8,6). 3 мл геля агарозы наносят на обезжиренное горизонтально установленное предметное стекло, помещают металлический стальной стержень-брусок 4×20 мм (высотой 10 мм), который после застывания геля убирают магнитом;
3) к 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента добавляют 0,1 мл 0,1% раствора тритона Х-100, инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин и дезинтеграции липопротеинов, добавляют 0,15 мл раствора Судана Б, помещают на 1 час в темный термостат при 40°С, затем добавляют 0,2 мл горячего раствора геля агарозы, смешивают, подогревают при 55°С и подогретым вносят в лунку геля агарозы размером 4×20×10 мм;
4) предметное стекло помещают в камеру для электрофореза слоем агарозы вниз, электрофорез проводят в течение холодильной камере при температуре 4°С при напряжении 100 В и силе тока 40-45 мА;
5) электрофореграмму фиксируют в 5% растворе уксусной кислоты в течение одного часа, затем высушивают между листами фильтровальной бумаги, непрерывно смачивая 96% этиловым спиртом;
6) денситометрию проводят на микрофотометре МФ-4.
Усовершенствование способа касается механического встряхивания пробы с частотой 120 раз в 1 мин на лабораторном встряхивателе для приготовления реактивов фирмы «Immunotech a.s.», Чехия. Более частое или длительное встряхивание ведет к повышению температуры пробы и появлению рекомбинантных форм липопротеинов крови, что препятствует дальнейшему проведению исследования и искажает результат электрофоретического анализа пробы. Менее короткий период встряхивания, равный 30 сек, не позволяет улучшить результат исследования.
Далее сыворотку крови в течение 1 мин обрабатывают дезинтегратором «Microsonic TM» для полной дезинтеграции липопротеинов крови. Дезинтеграцию липопротеинов осуществляют Ultrasonic cell Dismptor производство Heat System YWC, 1938, New York 11735, Model Xh 2005, Serial NO, работающий с характеристикой электрического тока 50 вольт/ампер, мощностью 50 Вт, частотой тока 20 кГц.
В группе контроля в случае использования способа-прототипа n=10 (фиг.1a) и предлагаемого способа n=15 (фиг.16) выявлены ХМ, ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП - это нормальная липидограмма.
Нами обследованы 2 группы больных ИБС: I - группа (n=25) способом-прототипом и II - группа (n=30) предлагаемым способом.
У пациентов I группы выявлены II3 (фиг.2а), IIб (фиг.2б) и IV типы гиперлипопротеинемий (фиг.2в), а также "следовая" фракция ЛП (а).
У пациентов II группы с наличием гиперхолестеролемии (ГХС) в пределах 6,9-14,2 ммоль/л (среднее значение 9,3±0,9 ммоль/л) кроме фракций ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП выявлялась интенсивная фракция ЛП (а), усиленная присутствием минорных подфракций ЛП (а). Остальные фракции, а именно ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП, были тоже более интенсивными. Следует помнить, что в этой ситуации 5% фракции ЛПВП приходится на минорные фракции ЛП (а).
У пациентов II группы с более низким содержанием ХС в крови 6,0-9,1 ммоль/л (среднее значение 7,5±0,7 ммоль/л) кроме фракций ХМ, ЛПВП, ЛПНП, ЛПОНП, в зоне между ЛПНП и ЛПОНП выявлена менее выраженная фракция ЛП (а).
Клинический пример
Пациент В., 55 лет: история болезни №196. Поступил в отделение ИБС и атеросклероза НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН с жалобами на колющие и сжимающие боли за грудиной и в области сердца, возникающие при физической нагрузке, снимающиеся нитроглицерином, а также с жалобами на боль в подреберье, с иррадиацией в эпигастральную область, одышку при физической нагрузке. АД 180/110 мм рт.ст., пульс в покое 67 удара в минуту.
Диагноз: ишемическая болезнь сердца, стенокардия напряжения ФК II-III; артериальная гипертензия.
Результаты лабораторных исследований: ХС общий - 9,0 ммоль/л, триацилглицерол - 1,8 ммоль/л, ХС ЛПВП - 0,8 ммоль/л. Результаты электрофоретического исследования крови этого пациента по способу-прототипу представлены на (фиг.3а), а по предлагаемому способу представлены на (фиг.3б). Выявлены следы ХМ, ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП, ЛП (а) с присутствием минорных фракций ЛП (а) в составе ЛПВП, а также других минорных фракций ЛП, так как все выявленные фракции стали значительно интенсивнее.
При исследовании ЛП сыворотки крови больного ишемической болезнью сердца (ИБС) по способу-прототипу (клинический пример) выявлены ХМ, β-ЛП (ЛПНП), пре-β-ЛП (ЛПОНП), α-ЛП (ЛПВП) и «следовая фракция» ЛП (а), а при исследовании по предлагаемому способу выявлены интенсивные фракции ЛП в зоне между β- и пре-β-ЛП, также усиленные фракции ЛПНП, ЛПОНП.
Использование предлагаемого способа позволило выявить у больных ИБС с выраженной гиперлипопротеинемией наличие максимально интенсивных минорных фракций ЛП в геле агарозы, так как дальнейшая модификация способа не представляется возможной.
Применение предлагаемого способа разделения на фракции ЛП крови в отличие от способа-прототипа позволяет выявить максимально интенсивные минорные фракции ЛП (а), что повышает чувствительность и точность способа. При этом предлагаемый способ прост в использовании и интерпретации полученных результатов.
Приложение
Фиг.1. Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови: а - в группе контроля способом-прототипом, б - в группе контроля предлагаемым способом;
Фиг.2 (а, б, в). Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больных ИБС (I группа);
Фиг.3. Представлены результаты электрофоретического разделения на фракции ЛП сыворотки крови больного ИБС (клинический пример): а - способом-прототипом, б - предлагаемым способом.
Способ определения фракций липопротеинов крови у больных ишемической болезнью сердца с помощью электрофореза в геле агарозы путем обработки пробы сыворотки крови пациента в течение 1 ч раствором красителя Судана Б в темном термостате при 40°С, прогретую смесь вносят в лунку геля агарозы объемом 4×20×10 мм с последующей фиксацией электрофореграмм, их высушиванием и денситометрией, отличающийся тем, что дополнительно перед обработкой Суданом Б к 0,3 мл пробы сыворотки крови пациента добавляют 0,1 мл 0,1%-ного раствора тритона Х-100 и инкубируют 15 мин при 20°С, перемешивают смесь методом встряхивания 120 раз в 1 мин и проводят дезинтеграцию липопротеинов.
