Способ прогнозирования риска развития многоузловых поражений при лейомиоме матки


 


Владельцы патента RU 2445625:

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородский государственный национальный исследовательский университет" (RU)

Способ прогнозирования развития многоузловых поражений при лейомиоме матки для использования в области медицины. Способ включает выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфизма гена лимфотоксина α и при выявлении гомозиготного генотипа по высокопродуцирующему аллелю (+250GG) Ltα прогноз риска возникновения многоузловых поражений при лейомиоме матки. 2 табл.

 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития многоузловых поражений матки у женщин и особенностей клинического течения заболевания.

Основная задача молекулярно-генетического типирования локусов генов цитокинов - это определение единичных нуклеотидных замен в генах, которые вызывают изменения уровня продукции цитокинов, что может влиять на развитие воспалительного процесса [1].

Лейомиома матки - доброкачественное новообразование, развивающееся из мышечных и соединительных тканей матки [2]. Лейомиома матки, о чем говорят большинство исследований, развивается из незрелых гладкомышечных клеток матки (миометрия). Патогенез лейомиомы матки, несмотря на большое количество исследований [3, 4, 5, 6, 7], остается спорным до сих пор. Лейомиома матки является гормонозависимой опухолью, то есть ее развитие связано с гормональными нарушениями функций организма женщины - нарушается метаболизм, синтез и соотношение половых гормонов. Лейомиома может состоять из нескольких, различных по размеру узлов, расположенных в слое миометрия. В медицинской практике принято оценивать размер лейомиомы матки по аналогии с размерами развивающегося плода неделями. Лейомиома матки в последнее время считается наиболее распространенным гинекологическим заболеванием. По различным источникам среди обследуемых пациенток лейомиома матки выявляется у 10-30%, а в некоторых случаях до 50%. Последние наблюдения показывают, что происходит снижение среднего возраста больных лейомиомой матки - не редкостью становятся случаи заболевания в 20-30-летнем возрасте [8]. Значительно чаще лейомиомой матки болеют городские жительницы в отличие от сельского населения [9]. Рост лейомиомы значительно ускоряется в период беременности, что может приводить к выкидышам или преждевременным родам. Частота выявления лейомиомы матки значительно увеличивается с возрастом, в период, предшествующий менопаузе, то есть в 45-55 лет. Частые факты обнаружения лейомиомы матки при профилактических осмотрах у гинеколога дают основания утверждать, что на начальном этапе лейомиома матки может развиваться бессимптомно. В результате бессимптомного или малосимптомного течения лейомиомы матки может быть упущен период консервативного (без хирургического вмешательства) лечения этого коварного заболевания.

В основе развития лейомиомы матки лежат сложные многоэтапные иммунопатологические механизмы. Одним из ключевых звеньев в реализации каскада этих механизмов являются процессы взаимодействия цитокинов. При этом центральное место в данных взаимодействиях занимают факторы некроза опухоли и, в частности, лимфотоксин α. Согласно данным литературы лимфотоксин α (Lt-α) синтезируется в клетках в виде предшественника, построенного из 247 аминокислотных остатков. Зрелая форма состоит из 171 аминокислоты и имеет молекулярную массу 18,66 кД. Ген Lt-α локализован в 6-й хромосоме (6р21.3) и входит в состав генов главного комплекса гистосовместимости [4]. Lt-α продуцируется активированными Т-лимфоцитами [10]. Lt-α действует как эндогенный опухолевый промотор при различных опухолевых процессах, в частности при раке молочной железы, яичников и др., при этом происходит усиление экспрессии генов, контролирующих клеточный цикл. Показано, что Lt-α индуцирует экспрессию ангиогенных факторов, способствующих инвазии и метастазированию [12, 13].

Задачей настоящего исследования является разработка способа прогнозирования риска развития многоузловых поражений при лейомиоме матки на основе данных о полиморфизме гена лимфотоксина α+250 A/G Ltα.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития многоузловых форм лейомиомы матки, позволяющих в кратчайшие сроки определить клинический прогноз и стратегию терапии данного заболевания.

В соответствии с поставленной задачей был разработан способ оценки риска развития лейомиомы матки, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфизма гена лимфотоксина α;

- прогнозирование риска возникновения многоузловых поражений при лейомиоме матки в случае выявления гомозиготного генотипа по высокопродуцирующему аллелю (+250GG) Ltα.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность определения особенностей характера поражения миоматозными узлами матки по наличию аллелей и генотипов гена лимфотоксина α+250 A/G Ltα.

Способ осуществляют следующим образом.

ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных лейомиомой матки в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10мМ трис-НСl (рН 7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН 8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют.Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) синтеза полиморфного локуса фактора некроза опухоли +250 A/G Ltα выполняется в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-НСl (рН 8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 94°С) проводится 32 цикла амплификации по схеме: денатурация - 30 сек при 94°С; отжиг праймеров - 30 сек при 68°С; элонгация - 42 сек при 74°С. Затем пробы выдерживаются 10 мин при 72°С и охлаждаются.

Таблица 1
Структура праймеров и фермент рестрикции, используемые для генотипирования исследуемого ДНК-маркера
Ген Полиморфизм и его локализация в гене Структура праймеров Фермент рестрикции Литература
Ltα +250A/G F: 5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3' Bsp 19I (Sugiura et al., 2002)
(1 интрон) R: 5'-AGAGGGGTGGATGCTTGGGTTC-3'

Амплификат, наработанный при ПЦР гена фактора некроза опухоли +250 A/G Ltα, подвергают рестрикции (ПДРФ-анализ) путем добавления к 12,5 мкл амплификата 5 ед. активности рестриктазы и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 16 часов. Для анализа полиморфизма гена фактора некроза опухоли +250 A/G Ltα используют эндонуклеазу рестрикции Bsp 191 "СибЭнзим".

После ПДРФ-анализа продукты рестрикции анализировали в 2%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в течение 30 минут при 150 V. В качестве электрофорезного буфера использовали 1xTAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 782 п.н. соответствовали аллелю (+250А) Ltα, 586 и 196 п.н. - аллелю (+250G) Ltα, фрагменты длиной 782, 586 и 196 п.н. наблюдались у гетерозигот (+250AG) Ltα.

Нуклеотидная последовательность гена лимфотоксина α следующая:

1 ccgtgcttcg tgctttggac taccgccccg cagtgtcctg ccctctgcct gggcctcggt

61 ccctcctgca cctgctgcct ggatccccgg cctgcctggg cctgggcctt ggtgggtttg

121 gttttggttt ccttctctgt ctctgactct ccatctgtca gtctcattgt ctctgtcaca

181 cattctctgt ttctgccatg attcctctct gttcccttcc tgtctctctc tgtctccctc

241 tgctcacctt ggggtttctc tgactgcatc ttgtcccctt ctctgtcgat ctctctctcg

301 ggggtcgggg ggtgctgtct cccagggcgg gaggtctgtc ttccgccgcg tgccccgccc

361 cgctcactgt ctctctctct ctctctctct ttctctgcag gttctcccca tgacaccacc

421 tgaacgtctc ttcctcccaa gggtgcgtgg caccacccta cacctcctcc ttctggggct

481 gctgctggtt ctgctgcctg gggcccaggt gaggcagcag gagaatgggg gctgctgggg

541 tggctcagcc aaaccttgag ccctagagcc cccctcaact ctgttctccc ctaggggctc

601 cctggtgttg gcctcacacc ttcagctgcc cagactgccc gtcagcaccc caagatgcat

661 cttgcccaca gcaccctcaa acctgctgct cacctcattg gtaaacatcc acctgacctc

721 ccagacatgt ccccaccagc tctcctccta cccctgcctc aggaacccaa gcatccaccc

781 ctct

Жирным выделен сайт рестрикции ccatgg для рестриктазы Bsp19I. Подчеркиванием выделены праймеры - прямой (F: 5'-CCGTGCTTCGTGCTTTGGACTA-3') и обратный (R: 5'-AGAGGGGTGGATGCTTOGGTTC-3').

Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Сравнивалась степень поражения миоматозными узлами матки у женщин с различными генотипами по анализируемому гену.

В качестве конкретного примера проведен анализ результатов наблюдений 221 женщины с лейомиомой матки. Пациенты включались в группу обследования только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.

Все пациентки в зависимости от наличия или отсутствия в генотипе высокосекреторного аллеля (+250G) Ltα, обуславливающего более высокую продукцию фактора некроза опухоли, были разделены на 3 группы. В 1 группу включены индивидуумы с генотипом (+250GG) Ltα (n=28), 2-я группа сформирована из пациенток, имеющих один высокосекреторный аллель-генотип (+250AG) Ltα (n=73), третья группа сформирована из пациенток, гомозиготных по низкосекреторному аллелю (+250АА) Ltα (n=120).

В результате изучения характера поражения миоматозными узлами матки было установлено (табл.2), что у женщин, в генотипе которых содержится два высокопродуцирующих аллеля (+250GG) Ltα, частота встречаемости многоузловых форм миомы (4 узла и более) составляет 25%, что в 1,5 раза превышает встречаемость данного признака у женщин, имеющих в генотипе один высокосекреторный аллель (+250AG) Ltα (15%) и в 2,5 раза превышает встречаемость многоузловых форм лейомиомы у женщин без высокосекреторного аллеля (генотип +250АА Ltα).

Таблица 2
Зависимость возникновения многоузловых поражений при лейомиоме матки в зависимости от генотипа женщины по гену лимфотоксина α
Генотип Число женщин % встречаемости многоузловых поражений
GG 28 25%
GA 73 15%
АА 120 10%

Применение критерия χ2 позволило выявить достоверные отличия (χ2=6,79; р=0,01, OR=3,0; CI=1,27-7,18) по частоте поражаемости многоузловыми формами лейомиомы матки (4 узла и более) между женщинами, имеющими в генотипе два высокосекреторных аллеля лимфотоксина α и женщинами, обладающими двумя низкосекреторными аллелями лимфотоксина α. Существенно более высокая частота встречаемости многоузловых форм лейомиомы матки (4 узла и более) при носительстве высокопродуктивных аллелей гена лимфотоксина α в гомозиготном состоянии - в 2,5 раза чаще, чем при их отсутствии, свидетельствует о возможной прогностической значимости данного генетического маркера.

Литература.

1. Кулагина Н.В. Иммунные и генетические механизмы роста миомы матки / Кулагина Н.В., Чухловин А.Б., Морозова Е.Б., Сысоев К.А., Зуева Е.Е., Тотолян А.А. // Материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 65-летию кафедры перинатологии, акушерства и гинекологии лечебного факультета «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии». - Красноярск: Изд-во ООО «Версо», 2007. - С.89-97.

2. Егорова О.В. и др. Современные представления о молекулярно-генетических основах миомы матки // Медицинская генетика. - 2007. - Т. 6. - №9. - C.11-16.

3. Ланчинский В.И., Ищенко А.И., Иллариошкин С.Н. Генетика и молекулярная биология миомы матки // Акушерство и гинекология. - 2004. - №2. - С.14-17.

4. Мешкова Р.Я. Руководство по иммунопрофилактике для врачей // Смоленск. - 1998.

5. Тихомиров А.Л., Лубнин Д.М. Миома матки // МИА. - 2006. - 174 с.

6. Glossop J.R., Dawes P.T., Nixon N.B., Matter D.L. Polymorphism in the tumour necrosis factor receptor II gene is associated with circulating levels of soluble tumour necrosis factor receptors in rheumatoid arthritis // Arthritis Res Ther. - 2005. - Vol.7. - P.1227-1234.

7. Willram H., Parcer M.D. Etiology, symptomatology, and diagnosis of uterine myomas // Fertility and sterility.-2007. - Vol.87, №4. - Р.725-736.

8. Kurachi O., Matsuo H., Samoto Т., Maruo T. Tumour necrosis factor - a expression in human uterine leiomyoma and its down-regulation by progesterone // J.Clin. endocrinology and metabolism. - 2001. - Vol.86, №5. - Р.2275-2280.

9. Moore A., He H. et al. Transforming growth factor-alfa, epidermal growth factor receptor, and PCNA immunoexpression in uterine leiomyosarcomas and leiomyomas in B6C3F1 mice // Exp. Toxicol. Pathol. - 2000. - Vol.52, №3. - P.195-200.

10. Чухриенко Н.Д. Аллергия и иммунология // Днепропетровск, издат. Б.И. - 2005. - 112 с.

11. Denschlag D., Bettendorf H., Watermann D. et al. Polymorphism of the p53 tumor suppressor gene is associated with susceptibility to uterine leiomyoma // Fertil. Steril. - 2005. - Vol.84. - P.162-166.

12. Осташкин А.С., Маливанова Т.Ф., Юрченко В.А. Полиморфизм в локусе гена фактора некроза опухолей у больных раком молочной железы // Генетика. - 2008. - №9. - С.1275-1280.

13. Sozen I., Arici A. Interactions ofcytokines, growth factors, and the extracellular matrix in the cellular biology of uterine leiomyomata // Fertil. And Steril. - 2002. - Vol.8, №1. - P.1-12.

Способ прогнозирования развития многоузловых поражений при лейомиоме матки, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, отличающийся тем, что проводят анализ полиморфизма гена лимфотоксина α и прогнозируют риск возникновения многоузловых поражений при лейомиоме матки в случае выявления гомозиготного генотипа по высокопродуцирующему аллелю (+250GG) Ltα.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к диагностике, в частности к способу количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в жидкости ротовой полости и в цельной крови.

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии. .

Изобретение относится к медицине, а именно к судебной медицине. .

Изобретение относится к медицине, а именно к судебной медицине, и может быть использовано для определения величины этанолэмии по концентрации этанола в мышечной ткани трупа в случаях его неполной гнилостной биотрансформации и невозможности прямого определения величины этанолэмии, путем применения инструментального исследования (газожидкостная хроматография).

Изобретение относится к области молекулярной биологии, клинической биохимии, медицины, ветеринарии, фармакологии, эндокринологии и онкологии. .
Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням, гепатологии. .

Изобретение относится к анализу биологических материалов и, в частности, сложных биологических смесей. .
Изобретение относится к области медицины, а именно иммунологии, хирургии, реаниматологии

Изобретение относится к биологии и медицине, в частности к биологии соединительных тканей, и касается способа оценки зрелости коллагеновых волокон на основе исследования тинкториальных свойств, где предварительно полученный биологический материал фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина, заливают в парафин, срезы изготавливают на микротоме, после чего их помещают на поверхности предметного стекла с последующей химической очисткой от парафина с помощью ксилола, при этом оценка зрелости коллагеновых волокон проводится по двум независимым параметрам: степени разрешенности поперечной исчерченности (D-периодичности) и жесткости коллагеновых волокон, где степень разрешенности поперечной исчерченности оценивалась как высота шага между щелью и зоной перекрытия отдельных микрофибрилл с помощью Фурье-анализа (Image Analysis 3, NT-MDT) из анализа профилей поперек и вдоль их оси на топографических изображениях, предварительно обработанных нелинейным фильтром высоких частот с помощью программы Image Analysis 3 (NT-MDT), а жесткость биологического материала оценивается как сбой величины фазы колебания кантилевера сканирующего зондового микроскопа, при этом исследования поверхности образца проводятся на воздухе
Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и касается способа прогнозирования клинического течения бактериального конъюнктивита

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к способам эксплантации и культивирования гранулем in vitro, и может быть использовано при разработке и оценке эффективности средств лечения туберкулеза, а также при разработке новых иммунотропных препаратов

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, цитогенетике и гистохимии
Изобретение относится к области медицины, а именно к курортологии
Изобретение относится к медицине, конкретно к психиатрии, и может быть использовано для прогноза риска развития поздней дискинезии в процессе терапии больных шизофренией

Изобретение относится к области микробиологии
Наверх