Способ оценки характера межмикробных взаимодействий


 


Владельцы патента RU 2448161:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (RU)

Изобретение относится к биотехнологии, а именно клинической микробиологии, и может быть использовано для уточнения этиологии заболевания. Способ предусматривает следующее. Культуры микроорганизмов выращивают на LB-бульоне с последующей стандартизацией до 0,5 по стандарту МакФарланда. Выращенные культуры микроорганизмов вносят в лунки полистиролового планшета и добавляют LB-бульон для формирования монопленок или вносят другую бульонную культуру для формирования смешанной биопленки. Планшеты выдерживают в термостате при 37°С в течение 48 часов до формирования биопленок. Сформированные биопленки промывают дистиллированной водой и окрашивают 200 мкл 0,1%-ного водного раствора генцианвиолета в течение 45 мин в темноте и тщательно трехкратно отмывают биопленки дистиллированной водой с последующим высушиванием планшета и определением состояния биопленок по их интенсивности окрашивания. Для этого краситель элюируют 96%-ным спиртом и определяют показатель оптической плотности элюата на спектрофотометре, соответствующий уровню пленкообразования, с последующим сравнением усредненных показателей оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур, и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии. При этом сумма показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур не должна превышать 4. Изобретение позволяет оценить характер межмикробного взаимодействия и прогнозировать развитие микст-инфекции.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии.

Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).

Недостатки прототипа: низкая производительность способа при высокой стоимости, связанная с трудоемкостью, продолжительностью во времени, необходимостью подбора оптимальных условий совместного культивирования для микроорганизмов различных таксономических групп.

Технический результат: повышение производительности за счет унификации пробоподготовки, использования 96-луночных полистироловых планшетов и автоматизированного учета результатов, снижение затратности.

Сущность метода заключается в оценке межмикробных взаимоотношений двух микробных штаммов путем сравнительного анализа массивности сформированных ими биопленок. Для этого в стандартных условиях in vitro формируют биопленки каждого штамма по отдельности и после их смешивания затем оценивают результат пленкообразования моно- и смешанными культурами на основе регистрации интенсивности поглощения ими красителя.

Способ осуществляется следующим образом: для формирования биопленок в лунки полистиролового планшета микропипеткой-дозатором вносят по 100 мкл 18-часовых бульонных культур микроорганизмов, выращенных на бульоне Луриа Бертани (LB-бульон), стандартизованных до 0,5 по стандарту МакФарланда, затем добавляют 100 мкл LB-бульона для формирования монопленок или 100 мкл другой тестируемой бульонной культуры для формирования смешанной биопленки. Контролем служат лунки с 200 мкл стерильного LB-бульона. Все эксперименты проводят не менее чем в трех повторностях.

Закрытые планшеты выдерживают в термостате при 37°С в течение 48 часов. Затем сформированные биопленки промывают дистиллированной водой и окрашивают 200 мкл 0,1%-ного водного раствора генцианвиолета в течение 45 минут в темноте. После тщательного трехкратного отмывания биопленок аналогичным образом и высушивания планшета определяют состояние биопленок по интенсивности их окрашивания. Для этого краситель элюируют 96%-ным спиртом и определяют показатель оптической плотности (ОП) элюата, который соответствует уровню пленкообразования (Шагинян, 2007). Количественным выражением степени образования биопленок служат значения ОП580, измеряемые на планшетном спектрофотометре, например планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США), с интервалом измерения оптической плотности от 0,0 до 4,0.

Затем сравнивают усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур. Если наблюдается аддитивный (суммарный) эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОПmix) достоверно не отличается от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП1+ОП2) - регистрируют нейтральный характер в межмикробном взаимодействии; если показатель ОПmix>ОП1+ОП2- - регистрируют синергический характер взаимодействия; если показатель ОПmix<ОП1+ОП2 - регистрируют антагонистический характер взаимодействия. При этом сумма показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур не должна превышать 4. В противном случае, готовят разведение элюата 1:10 и вновь измеряют оптическую плотность.

Пример практического применения.

Пример 1. Оценено взаимное влияние микробных культур Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, изолированных из мокроты больного К. 72 лет, находящегося на ИВЛ, с использованием предлагаемого способа. Для этого изоляты культивировали на LB-бульоне в лунках полистиролового планшета в виде смешанной и монокультур, после чего удаляли планктонные клетки и питательную среду, отмывали. Сформированные биопленки окрашивали 0,1%-ным раствором генцианвиолета, промывали, высушивали и краситель элюировали спиртом. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре, при этом показатель оптический плотности смешанной биопленки 2,209±0,669 превышал большее значение оптической плотности монокультур: 0,864±0,144 для Р.aeruginosa, что указывает на синергидный характер взаимоотношений тестируемых культур.

Способ оценки характера межмикробных взаимодействий путем совместного культивирования, отличающийся тем, что тестируемые моно- и смешанные культуры микроорганизмов культивируют в лунках полистиролового планшета на LB-бульоне до формирования биопленки, осуществляют промывание сформированных биопленок, окрашивание в течение 45 мин в темноте красителем, в качестве которого используют 0,1%-ный раствор генцианвиолета, трехкратное промывание биопленок с последующим высушиванием планшета, краситель элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок сравнивают с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур, и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии и может быть использовано для диагностики инфекций, передающихся половым путем, вызванных условно-патогенной микрофлорой, для профилактики внутриутробных инфекций и не вынашивания беременности.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 4343 гена BRCA1 (rsl799950). .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 6174 гена BRCA2 (6174delT). .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 2579 гена BRCA1 (rs4986850). .

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики вирусных болезней животных, молекулярной биологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 185 гена BRCA1 (185delAG). .

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для определения генотипа человека по полиморфизму в позиции 5382 гена BRCA1 (5382insC). .

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается способа стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий возбудителя пастереллеза птиц (Pasteurella multocida).

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к способам эксплантации и культивирования гранулем in vitro, и может быть использовано при разработке и оценке эффективности средств лечения туберкулеза, а также при разработке новых иммунотропных препаратов.

Изобретение относится к способу производства биомассы, обогащенной витамином К2, применению ее в способе производства молочных продуктов, обогащенных витамином К2, к молочным продуктам, полученными таким способом.
Изобретение относится к области биохимии. .

Изобретение относится к применению отобранных штаммов для получения ферментированных молочных продуктов и молочных продуктов, содержащих штаммы Lactobacillus delbrueckii subsp.

Изобретение относится к применению микроорганизма, принадлежащего к роду Lactobacillus, характеризующегося тем, что он способен к специфическому связыванию с бактерией, принадлежащей к группе mutans Streptococci, при котором специфическое связывание характеризуется: (i) стойкостью к тепловой обработке; и/или (ii) стойкостью к протеолитической обработке; и/или (iii) зависимостью от кальция; и/или (iv) формированием при pH в пределах между 4,5 и 8,5; и/или (v) формированием в присутствии слюны, для изготовления противокариозной композиции для лечения или предупреждения кариеса, вызванного mutans Streptococci, отличных от Streptococcus mutans.

Изобретение относится к области биохимии и касается, в частности, защиты растений от заболеваний, вызываемых фитопатогенными бактериями и фитоплазмами. .

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается способа стандартизации контрольно-производственного штамма бактерий возбудителя пастереллеза птиц (Pasteurella multocida).
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при исследовании микробной загрязненности воздуха. .
Изобретение относится к ветеринарной медицине, касается скрининга (поиска) пробиотических препаратов против кислотоустойчивых микроорганизмов и может быть использовано для скрининга (поиска) пробиотических препаратов против нокардиоформных актиномицетов in vivo
Наверх