Штамм hominis immunodeficiti virus (hiv-1) вич-1/россия/(316ru) для приготовления диагностических, профилактических препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1). Штамм получен от пациента, принимающего специфическую химиотерапию в течение 3-х лет, имеет одну основную и четыре вторичных мутации, которые могут изменять его чувствительность к химиопрепаратам. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации под номером ГКВ №1033. Представленный штамм может быть использован как биотехнологическая природная модель для разработки диагностических и вакцинных препаратов, а также для скрининга различных соединений и испытания лекарственных препаратов. 5 ил., 3 пр.

 

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и касается выделения штамма вируса иммунодефицита человека первого типа.

Создание лечебной и (или) профилактической вакцины против вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) является актуальной проблемой современной вирусологии, так как вакцина служит наиболее эффективным средством в борьбе с вирусными инфекциями. К настоящему времени более 30 препаратов как возможных кандидатов вакцинных препаратов были использованы в клинических испытаниях, но ни один из них не показал эффективного протективного эффекта. Исследования по созданию новых вакцинных препаратов активно продолжаются (1, 2). Они создаются на базе штаммов ВИЧ-1, которые широко используются в научных исследованиях во всем мире.

Другим направлением профилактики ВИЧ-инфекции является создание антиретровирусных препаратов. В настоящее время в клинике применяется около 28 препаратов, действующих на различных стадиях инфекционного цикла вируса. Наиболее многочисленную группу составляют препараты, подавляющие активность обратной транскриптазы и протеазы. Среди них первым с 1987 г.начал применяться азидотимидин (zidovudine, Retrovir) (АЗТ). Его действие направлено против обратной транскриптазы. Несмотря на большие успехи антиретровирусной терапии существует большая проблема, связанная с появлением в процессе лечения вариантов вируса с мутациями, снижающими чувствительность вируса к химиопрепаратам и, как следствие, ухудшение эффективности лечения. Эти мутации называются основными (3). При их появлении необходима смена лекарственной схемы. Кроме мутаций, с которыми связана высокая степень резистентности к определенным химиопрепаратам (основными мутациями), могут существовать варианты вируса с другими фенотипическими мутациями, которые также могут иметь отношение к химиотерапии. Эти мутации называются вторичными и впервые были обнаружены у пациентов в процессе лечения (3). Кроме того, наряду с высокой степенью изменчивости вируса в процессе пасеирования в человеческой популяции под действием факторов иммунной системы, для вируса характерна региональная изменчивость. Эти мутации сами по себе не влияют на эффективность известных в настоящее время антиретровирусных препаратов, но могут усиливать резистентность вируса к некоторым химиопрепаратам при появлении или наличии основной мутации. Характерная особенность российских вариантов вируса заключается в том, что более 50% из них содержат вторичные мутации V77I в Протеазе и/или A62V в Обратной транскриптазе (4,5). В связи с этим использование штаммов, полученных от пациентов, проживающих на территории Российской Федерации, представляется перспективным для создания профилактических и лечебных препаратов, а также для создания более чувствительных диагностических тест-систем. К тому же выделение штаммов ВИЧ-1, имеющих как первичные, так и вторичные мутации, с которыми связана резистентность к различным химиопрепаратам, может быть полезна для скрининга и испытания новых химиопрепаратов и оценки их эффективности против вирусов с различными мутациями.

Задачей настоящего изобретение явилось получение нового оригинального штамма обладающего рядом вирусологических свойств, позволяющих рассматривать его как удобную биотехнологическую природную модель для разработки диагностических и вакцинных препаратов, а также для скрининга различных соединений и испытания лекарственных препаратов.

Новый оригинальный авторский штамм 316RU вируса иммунодефицита человека ВИЧ-1/Россия, который циркулирует на территории России, получен от пациента, принимающего курсами специфическую химиотерапию в течение 3-х лет, имеет одну основную и четыре вторичных мутации, может быть использован для приготовления диагностических тест-систем, моделирования молекулярно-генетических экспериментальных вакцинных препаратов и для изучения антивирусного действия различных соединений, в том числе для оценки противовирусной активности лекарственных препаратов. Штамм депонирован в Государственную коллекцию вирусов, действующую на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России), и имеет регистрационный номер ГКВ-1033.

Штамм обладает высокой репродуктивной активностью для штаммов ВИЧ-1 и легко размножается в неопластических суспензионных Т-лимфоидных клетках человека МТ-4. О продукции вируса можно легко судить по ярко выраженному цитопатическому действию, выражающемуся в цитолизе и гибели через 7-10 дней после заражения инфицированных клеток. Продуктивная активность штамма составляет 4.0 lg ТЦД50. Штамм хорошо хранится при -70°С.

Идентификация штамма ВИЧ-1/Россия/3161RU осуществлена рядом независимых методов, в качестве контроля использовали эталонный культуральный штамм ВИЧ-1/IIIB.

Культуральные свойства.

Штамм вируса выделен из лимфоцитов периферической крови пациента с диагнозом ВИЧ-инфекция. Пациент относится к группе риска лиц, практикующих внутривенное использование наркотических препаратов. Пациент в течение 3-х лет принимал в качестве антиретровирусной терапии АЗТ.

Штамм был получен путем 4-х последовательных сокультиваций мононуклеарных клеток периферической крови пациента с ВИЧ-инфекцией в присутствии интерлейкина-2 человека с первичными культурами мононуклеарных клеток доноров, предварительно стимулированных фитогемагглютинином в течение 3-х дней. В дальнейшем штамм был адаптирован к неопластическим суспензионным Т-клеткам человека МТ-4. Штамм прошел 50 пассажей в клетках МТ-4.

Репродукция.

Штамм вируса реплицируется в мононуклеарных клетках периферической крови, неопластической клеточной культуре Т-клеток человека МТ-4. Репродукция вируса сопровождается характерным цитопатическим действием в виде цитолиза и гибели клеток через 7-10 дней после инфекции.

Штамм ВИЧ-1/Россия/316RU и может поддерживаться длительное время при пассировании в МТ-4 клетках. Через 7-10 дней после инфицирования клеток вируссодержащей культуральной жидкостью инфицированная клеточная взвесь добавляется к свежей клеточной суспензии в соотношении 1:10, или замораживается и хранится при - 70 С длительное время. После размораживания используется для заражения свежей клеточной суспензии в соотношении 1:10.

Инфекционный титр вируса определяли методом конечных разведении и оценивали по 50% тканевой цитопатической дозе вируса на клетках МТ-4 в сравнении с эталонным штаммом ВИЧ-1/IIIВ (Фиг.1).

Антигенные свойства.

Вирус иммунодефицита человека 1-го типа относится к семейству Retro viridae, подсемейство Orthoretrovirinae, род Lentivirus, подгруппа Primat lentivirus. Вирусы этой группы являются оболочечными РНК-содержащими вирусами с размером частиц около 100-150 нм. В составе частиц в мажорных количествах обнаруживают не менее 6 основных структурных антигенов, обладающих в различной степени иммуногенными свойствами, которые и в инфицированных вирусом клетках и вируссодержащей культуральной жидкости могут быть выявлены с помощью различных иммунобиологических методов.

Иммунофлуоресценция.

Исследование методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки пациента с ВИЧ-инфекцией, содержащей антитела к ВИЧ-1, показало наличие в инфицированной клеточной культуре через 6 дней после инфекции наличие ВИЧ-1 антигена в 40-50% инфицированных клетках.

Иммуноблот.

Исследования в иммуноблоте 100-кратного концентрата вируса из культуральной жидкости инфицированных вирусом клеток позволили заключить, что вирус содержит основные структурные антигены, характерные для ВИЧ-1: gp120, p53-55, gp41, p24, р17, р9 (Фиг.2).

Анализ нуклеотидной и белковой последовательности гена ро1.

Исследовали ДНК продукт гена ро1, кодирующего белки Протеазы и Обратной транскриптазы, путем автоматического секвенирования. Для получения ДНК продукта использовали вируссодержащую культуральную жидкость, полученную на 8-ой день после заражения клеток МТ-4. Получение РНК вируса, реакцию обратной транскрипции, полимеразную цепную реакцию и циклическое секвенирование проводили с использованием коммерческой тест-системы ViroSeq V2.1 (Abbott, USA). Секвенирование позволило изучить аминокислотную последовательность всего белка Протеазы - 99 аминокислотных остатков (ако)- и основную часть Обратной транскриптазы - 320 ако. Для определения подтипа гена ро1 вируса была использована база Стендфордского Университета - Stanford University HIV DRAG RESISTANCE DATABASE, а также был проведен фенотипический анализ гена с использованием программ BioEdit и MEGA4 отдельно по генам протеазы и обратной транскриптазы с использованием стандартных референс последовательностей для всех известных в настоящее время подтипов ВИЧ-1. Оба анализа показали, что по генам протеазы и обратной транскриптазы вирус принадлежит к подтипу В. Протеаза содержит вторичные мутации L63P и V77I, Обратная транскриптаза содержит основную мутацию T215F и вторичные мутации D67N и K70R.

Штамм имеет следующую аминокислотную последовательность белка Протеазы:

Иммуногенные свойства.

Трехкратная иммунизация кроликов очищенным препаратом вирусных частиц приводит к возникновению у лабораторных животных специфического иммунного ответа. С помощью иммуноблота можно выявить антитела к основным структурным белкам ВИЧ-1: gp120, gp41, p55, P24, p17 (Фиг.3).

Сыворотка крови лабораторных животных способна нейтрализовать другие штаммы ВИЧ-1 субтипа В, например эталонный штамм ВИЧ-1/IIIB (Фиг.4).

Пример 1. Диагностика антител сыворотки крови ВИЧ-инфицированных пациентов методом иммуноблота.

Материал для исследования антител к ВИЧ-1 представлен 10 стандартными сыворотками, содержащими анти-ВИЧ антитела ко всем основным структурным белкам вируса и предварительно охарактеризованными в коммерческой тест-системе фирмы «Био-рад» (Австрия). В качестве антигена использовали штамм ВИЧ-1/Россия/316RU и эталонный штамм ВИЧ-1/IIIВ. Концентрированные и очищенные лизаты антигенов вирусов были получены по стандартной методике. Результаты исследования представлены в табл.2. (Фиг.2). Обнаружено, что антиген ВИЧ-1/Россия/316RU выявляет антитела ко всем основным структурным белкам ВИЧ-1.

Пример 2. Демонстрация использования штамма ВИЧ-1/Россия/ГКВ1033/ 316RU для получения специфических антител, способных нейтрализовать ВИЧ-1. Для сравнения использовали эталонный штамм ВИЧ-1/IIIB.

Трехкратную иммунизацию кроликов очищенными препаратами вирусных частиц проводили внутримышечно с интервалом в 4 недели с использованием полного адьюванта Фрейнда при первой иммунизации. Анализ сывороток проводили с использованием коммерческих тест-систем фирмы «Био-рад» (Австрия). Результаты анализа кроличьих сывороток, полученных после иммунизации представлены в табл.3 (Фиг.3). Выявлено, что препарат антигена, приготовленного из штамма ВИЧ-1/Россия/316RU, обладает иммуногенной активностью, сравнимой с иммуногенной активностью эталонного штамма ВИЧ-1/IIIВ.

Анализ нейтрализующей активности вирусспецифических антител, полученных к штамму ВИЧ-1/Россия/316RU? показал, что они способны нейтрализовать репликацию эталонного штамма ВИЧ-1/IIIВ в клетках МТ-4 (Фиг.4).

Пример 3. Применение штамма ВИЧ-1/Россия/316RU для изучения активности противовирусных препаратов. Для сравнения брали эталонный штамм ВИЧ-1/IIIВ.

Использовали стандартную лабораторную модель и методику исследования, применяемые для скрининга противовирусных препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений. Клетки МТ-4 заражали штаммом ВИЧ-1/Россия/316RU и штаммом ВИЧ-1/IIIB. Зараженные клетки инкубировали в присутствии двух ингибиторов Обратной транскриптазы ВИЧ-1 - азидотимидина и индинавира. Первый относится к нуклеозидным ингибиторам Обратной транскриптазы, второй - к ингибиторам Протеазы. Как показали исследования, чувствительность к азидотимидину у штамма ВИЧ-1/Россия/316RU по сравнению со штаммом ВИЧ-1/IIIB снижена в 12 раз. Чувствительность к индинавиру несущественно снижена (Фиг.5).

Предлагаемый оригинальный штамм вируса ВИЧ-1/Россия/316RU обладает высокой репликативной активностью и адаптирован к чувствительной неопластической клеточной линии МТ-4, характеризуется высокой антигенной активностью. Штамм имеет мутации в обратной транскриптазе (D67N, K70R, T215F) и протеазе (L63P, V77I), которые могут изменять его чувствительность к химиопрепаратам. Приготовленные на его основе препараты могут найти применение в вирусологической практике при разработке и создании противовирусных вакцин и диагностики ВИЧ-инфекции. Штамм может использоваться для испытания противовирусных препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений.

Список литературы

1. С.L.Boutwell, M.M.Rolland, J.Т.Herbeck et al. Viral Evolution and Escape during Acute HIV-1 Infection. J Infect Dis, 2010, 202 (Suppl 2), p.S323-326.

2. M.J.McElrath. Immune Responses to HIV Vaccines and PotentialImpact on Control of Acute HIV-1 Infection. J Infect Dis, 2010, 202 (Suppl 2), p. S323-326.

3. Snanford University. HIV DRUG RESISTANCE DATABASE. http://hivdb6.stanford.edu.

4. Roudinskii N.I., Sukhanova A.L., Kazennova E.V. et al. Diverrsity of human immunodeficiency virus type 1 subtype A and CRF03 AB protease in Eastern Europe: Selection of the V77I variant and its rapid spread in injecting drug user populations. J. Virol. 2004, vol.2, p.11276-11287.

5. Л.М.Селимова, Л.В.Серебровская, Л.А.Иванова и др. Показатели CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов пациентов, инфицированных вариантами вируса иммунодефицита человека 1-го типа подтипа А, несущими мутации V77I и A62V в обратной транскриптазе. Вопросы вирусологии, 2010, 55(2), с.22-26.

Штамм Hominis immunodeficiti virus ВИЧ-1/Россия/316RU подтипа В по гену роl депонированный под номером ГКВ №1033 в Государственную коллекцию вирусов на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, для приготовления диагностических и вакцинных препаратов и для оценки противовирусной активности различных соединений, содержащий следующую аминокислотную последовательность, соответствующую с 1-й по 419-ю позиции белков гена pol:
Протеаза -
PQITLWQRPLVTIRIGGQLKEALLDTGADDTVLEEMNLPGRWKPKMIGG IGGFIKVRQYDQIPIEICGHKAIGTVLIGPTPVNIIGRNLLTQLGCTLNF -
Обратная транскриптаза -
PISPIETVPVKLKPGMDGPRVKQWPLTEEKIKALVEICTEMEKEGKISKIGPENPYNTPVFAIKKKNSTRWRKLVDFRELNKRTQDFWEVQLGIPHPAGLKKRKSVTVLDVGDAYFSVPLDKDFRKYTAFTIPSINNETPGIRYQYNVLPQGWKGSPAIFQCSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYVGSDLEIGQHRTKIEELRQHLLRWGFFTPDKKHQKEPPFLWMGYELHPDKWTVQPIVLPEKDSWTVNDIQKLVGKLNWASQIYPGIQVRQLCKLLRGTKALTEVIPLTEEAELELAENREILKEPVHGVYYDP.



 

Похожие патенты:
Изобретение относится к области медицинской микробиологии и касается штамма Pseudomonas aeruginosa. .
Изобретение относится к области вирусологии и касается аттенуированного штамма вируса африканской чумы свиней (АЧС) 2-го серотипа. .

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и ветеринарии. .

Изобретение относится к штаммам вируса гриппа субтипа H1N1 и может быть использовано в медицинской вирусологии при изучении биологии вируса гриппа, а также при исследовании эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа.

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии и ветеринарии. .

Изобретение относится к области биотехнологии, генной инженерии и вирусологии. .

Изобретение относится к таким иммуногенным и вакцинным композициям, которые пригодны для использования у различных животных (мишеневых или хозяев) видов, восприимчивых к заболеванию, вызванному BTV, включая, но не ограничиваясь, млекопитающих, рептилий, птиц, в особенности людей, парных млекопитающих или животных, таких как, но не ограничиваясь, собак, кошек, лошадей, млекопитающих из зоопарков или животных, таких как морские млекопитающие, напр., тюлени, кошки, лошади, зоопарковые рептилии, такие как змеи, крокодилы, аллигаторы, и птичьи виды.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения комбинированной бивалентной, культуральной, инактивированной, концентрированной, очищенной вакцины для профилактики геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС).

Изобретение относится к области ветеринарии и касается термообработанных бактеринов и эмульсионных вакцин, полученных из таких термообработанных бактеринов. .

Изобретение относится к области вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса иммунодефицита человека первого типа

Наверх