Способ ретроспективного обнаружения ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов


 

G01N33/50 - химический анализ биологических материалов, например крови, мочи; испытания, основанные на способах связывания биоспецифических лигандов; иммунологические испытания (способы измерения или испытания с использованием ферментов или микроорганизмов иные, чем иммунологические, составы или индикаторная бумага для них, способы образования подобных составов, управление режимами микробиологических и ферментативных процессов C12Q)

Владельцы патента RU 2478207:

Федеральное государственное унитарное предприятие "Антидопинговый центр" (RU)

Настоящее изобретение относится к медицине и описывает способ ретроспективного обнаружения ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов, где при опубликовании в списке запрещенных к использованию препаратов нового вещества по его химической формуле вычисляют точную молекулярную массу и далее в массиве результатов предыдущих анализов проб биологической жидкости спортсмена на допинг по соответствующему классу ксенобиотиков на основе вычисленной молекулярной массы проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанному веществу и его метаболитам, и при нахождении указанных аналитических характеристик спортсмена переводят в группу риска и для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС. Способ обеспечивает возможность однозначного выявления ретроспективного применения запрещенных к использованию химических соединений при допинговом контроле. 1 пр., 2 табл.

 

Изобретение относится к хроматографическому анализу различных химических соединений и может быть использовано в медицине, биологии, экологии и, в особенности, при допинговом контроле.

Известны способы анализа различных химических соединений методами газовой или жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией или тандемной масс-спектрометрией. [1-3]

В частности при идентификации неизвестных веществ методом жидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией регистрируют хроматограмму как функцию времени удерживания и регистрируют масс-спектр в период времени, соответствующий выходу вещества из колонки, и сравнивают с масс-спектрами известных веществ, находящимися в базе данных, далее определяют индекс удерживания и сравнивают его с таковыми из базы данных и идентифицируют вещество по двум параметрам - масс-спектру и индексу удерживания. [4]

Недостатком указанного способа является проведение анализа на строго заранее определенные вещества, высокие значения граничных концентраций определяемых веществ, а также определенная вероятность получения недостоверных результатов.

В последнее время разработана методика высокоэффективной жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии высокого разрешения с ионно-орбитальной ловушкой и аппаратурное оформление указанной методики. По указанной методике готовят пробу исследуемого образца, разделяют ее на компоненты пропусканием через монолитную хроматографическую колонку, компоненты исследуемой пробы подвергают химической ионизации в атмосфере азота в присутствии носителя метанол/вода и из ионно-орбитальной ловушки на детектирование последовательно отбирают и подают ионизированные компоненты с разностью масс не менее 10-4 а.е.м. с последующим определением принадлежности каждого иона конкретному веществу на основании его аналитических характеристик. [5].

Указанная методика позволяет с высокой точностью и достоверностью идентифицировать различные химические соединения, в том числе, естественно, и ксенобиотики. Следует особо отметить, что указанная методика определения ксенобиотиков может реализоваться как с привлечением эталонных образцов исследуемых веществ, так и без него.

Техническим результатом, на достижение которого направлено создание данного изобретения, является обеспечение возможности ретроспективного обнаружения ксенобиотиков и их метаболитов за счет высокой точности определения аналитических характеристик исследуемых веществ и соответственно практически полной достоверности определения исследуемых веществ при высокой оперативности определения.

Поставленный технический результат достигается тем, что при опубликовании в списке запрещенных к использованию препаратов нового вещества по его химической формуле вычисляют точную молекулярную массу и далее в массиве результатов предыдущих анализов проб биологической жидкости спортсмена на допинг по соответствующему классу ксенобиотиков на основе вычисленной молекулярной массы проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанному веществу и его метаболитам, и при нахождении указанных аналитических характеристик спортсмена переводят в группу риска, а для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.

Известно, что как атомная масса, так и молекулярная масса веществ выражается не целыми, а дробными числами и, зная по химической формуле органического соединения точную молекулярную массу его, может быть вычислен и элементный состав (программа Molecular Fragment Calculator). С другой стороны, если известна измеренная масса протонированной молекулы (m/z), то по этой массе можно установить брутто-формулу вещества. При этом следует подчеркнуть, что при определении массы с точностью до третьего знака (например 345,253) брутто-формула дает список из трех веществ, одно из которых соответствует станозололу, а при определении массы с точностью до четвертого знака (345,2533) брутто-формула дает только одно вещество - станозолол. Из вышеизложенного вытекает, что чем точнее в процессе проведения анализа определена масса протонированной молекулы, тем выше точность определения искомого вещества, и, что как раз положено в основу заявляемого технического решения, наоборот, чем точнее задана молекулярная масса искомого вещества, тем однозначнее будут результаты ретроспективного анализа.

К тому следует отметить, что недобросовестные спортсмены, нарушающие запрет на допинг, практически всегда «опережают» события, а WADA всегда опаздывает. Кроме того, важным фактором, облегчающим обнаружение нового ксенобиотика в пробе на допинг по заявляемому способу, является то, что ксенобиотики сгруппированы по классам, и поэтому новые запрещенные к применению вещества могут и быть и считаться «дженериками» и потому иметь аналитические характеристики, сходные с известными.

Изобретение может быть осуществлено следующим образом.

К исследуемому образцу биологической жидкости добавляют фосфатный буфер и раствор β-глюкуронидазы и подвергают образец ферментативному гидролизу, гидролизат охлаждают, добавляют смесь карбоната калия и гидрокарбоната натрия до рН 9-10, далее образец экстрагируют диэтиловым эфиром с добавлением сульфата натрия. Органический экстракт затем центрифугируют, эфирный слой упаривают досуха, сухой остаток растворяют в метаноле. Приготовленный таким образом для анализа экстракт далее направляют на хромато-масс-спектрометрическое определение, параметры которого будут представлены в примерах конкретного осуществления заявленного технического решения. В ходе анализа регистрируют отношение массы к заряду протонированных молекул определяемых веществ, время удерживания и ионный ток.

На основании этих аналитических характеристик определяют наличие известных как запрещенные ксенобиотиков и их метаболитов. Все данные анализа сохраняют. При опубликовании в списке запрещенных к использованию нового вещества по его известной химической формуле вычисляют точную молекулярную массу и далее на основе вычисленной молекулярной массы в массиве результатов предыдущего анализа пробы биологической жидкости спортсмена на допинг по соответствующему классу ксенобиотиков проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанному веществу и его метаболитам, и при нахождении указанных аналитических характеристик спортсмена переводят в группу риска и для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.

Применение спортсменом нового запрещенного к использованию вещества на момент взятия пробы в ретроспективном плане можно квалифицировать как «преждепользование».

Важным преимуществом заявляемого способа обнаружения ксенобиотиков является то, что он позволяет без проведения дополнительного весьма затратного анализа с вероятностью, близкой к единице, выделить из группы спортсменов подозреваемых в допинге.

Для лучшего понимания изобретение может быть проиллюстрировано, но не исчерпано следующим примером его конкретного осуществления.

Пример 1

Проводят анализ биологической жидкости (моча) спортсмена на допинг (подозрение на применение оксандролона).

Анализ проводят на хромато-масс-спектрометрической системе Surveyor HPLC, совмещенный с ОИЛ-масс-спектрометром (Bremen, Германия) и оснащенный ионным источником для химической ионизации с генератором азота NM30LA (Peak Scientific, США). В качестве ХГК используют Onyx Monolith C18.

Подготовка пробы и анализ исследуемой биологической жидкости

К образцу мочи (5 мл) добавляют 1 мл фосфатного буферного раствора (рН 7,0) и 50 мкл раствора β-глюкуронидазы и подвергают образец ферментативному гидролизу (57°С, 3 часа), гидролизат охлаждают до комнатной температуры, добавляют в него 100 мг смеси карбоната калия и гидрокарбоната натрия (2:1) до рН 9-10, далее образец экстрагируют 5 мл диэтилового эфира с добавлением 500 мг сульфата натрия. Органический экстракт затем центрифугируют в течение 5 минут при 2500 об/мин, эфирный слой упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 50 мкл метанола. Приготовленный таким образом для анализа экстракт далее направляют на хромато-масс-спектрометрическое определение при следующих параметрах: температура фокусирующего капилляра - 280°С, ток через иглу 5 мкА, скорость потока осушающего газа (азот) 20 л/час; скорость сканирования 1 скан/сек; диапазон сканирования 100-500 а.е.м.; точность определения масс ≤2 млн-1; разрешение 60000 (на половине высоты); объем вводимой пробы 10 мкл; подвижная фаза А: метанол-вода 80:20, В: метанол - вода 90:10; градиентное элюирование 0-8 мин: 50% В; 8-12 мин: 100% В; скорость потока 800 мкл/мин. Снимают и регистрируют хроматографические и масс-спектрометрические характеристики пробы.

Результаты анализа представлены в Таблице 1.

Таблица 1
№№ п/п Найденные m/z Найденный ксенобиотик
1 - Оксандролон не обнаружен
2 313,2162 -
3 297,1849 -

В список препаратов, запрещенных к использованию, WADA вносит тетрагидрогестринон и экземестан.

Проверку преждепользования спортсменом указанных ксенобиотиков осуществляют следующим образом. На основании химических формул вычисляют точные теоретические молекулярные массы новых запрещенных ксенобиотиков (313,2167 и 297,1854 соответственно) и далее в зарегистрированных результатах предыдущего (см. Таблицу 1) анализа пробы биологической жидкости спортсмена на допинг проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанным веществам и их метаболитам.

Результаты проверки приведены в Таблице 2.

Таблица 2
№№ п/п Молекул. масса теоретич. Найденные m/z Брутто-формула Найденный ксенобиотик
1 - - -
2 313,2167 313,2162 C21H29O2 тетрагидрогестрион
3 297,1854 297,1849 С20Н24O2 экземестан

Найденные аналитические характеристики тетрагидрогестриона и экземестана подтверждают применение спортсменом новых запрещенных к использованию веществ на момент взятия пробы в ретроспективном плане (принцип преждепользования). В то же время, поскольку этические нормы не позволяют напрямую предъявить спортсмену обвинение в допинге, спортсмена переводят в группу риска и для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.

Сохраненную пробу биологической жидкости спортсмена подвергают анализу по патенту RU 2384846 (Пример 1) с использованием эталонных образцов тетрагидрогестриона и экземестана (получены от фирмы LPG Promochem). Анализ подтвердил наличие в пробе вышеуказанных ксенобиотиков, что дает однозначное толкование как преждепользование спортсменом новых запрещенных ксенобиотиков.

Как видно из описания и примера осуществления способа, заявляемое техническое решение обеспечивает возможность однозначной идентификации ксенобиотиков и их метаболитов в произвольных комбинациях за счет высокой точности определения аналитических характеристик исследуемых веществ и соответственно практически полной достоверности обнаружения исследуемых веществ при высокой оперативности проведения процесса.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки

1. RU 2093822 С1, М.кл. G01N 30/04, опубл. 1997 г.

2. RU 2069363 С1, М.кл. G01N 30/02, опубл. 1996 г.

3. WO 2004/104571, М.кл. G01N 30/00, опубл. 2004 г.

4. RU 2384846 С1, М.кл. G01N 33/493, опубл. 2010 г.

5. J. Mass Spectrom. 2008, 43: 949-957.

Способ ретроспективного обнаружения ксенобиотиков при допинговом контроле спортсменов, отличающийся тем, что при опубликовании в списке запрещенных к использованию препаратов нового вещества, по его химической формуле вычисляют точную молекулярную массу и далее в массиве результатов предыдущих анализов проб биологической жидкости спортсмена на допинг по соответствующему классу ксенобиотиков на основе вычисленной молекулярной массы проводят поиск зарегистрированных аналитических характеристик, отвечающих указанному веществу и его метаболитам, и при нахождении указанных аналитических характеристик спортсмена переводят в группу риска и для подтверждения приема спортсменом указанного нового запрещенного вещества, проводят встречный анализ сохраненной пробы биологической жидкости альтернативным способом, например ВЭЖХ/МС-МС.



 

Похожие патенты:

Изобретение относится к области медицины. .
Изобретение относится к области ветеринарии и охраны среды обитания человека и направлено на получение достоверных данных в прижизненной диагностике хронических микроэлементозов сельскохозяйственных копытных животных различной этиологии.
Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам. .

Изобретение относится к способу обнаружения и подсчета жизнеспособных микроорганизмов вида Legionella pneumophila в образце. .

Изобретение относится к медицине, биологии, гематологии, педиатрии. .
Изобретение относится к медицине, биологии, гематологии, педиатрии. .
Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. .
Изобретение относится к медицине и касается проблемы нарушений психомоторного развития у детей и может быть использовано для оценки прогноза задержки психомоторного развития у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы (ПП ЦНС) гипоксически-ишемического генеза в анамнезе.
Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, и может быть использовано для диагностики некоронарогенного повреждения миокарда у больных туберкулезом легких на фоне туберкулезной интоксикации и проводимой антибактериальной терапии при отсутствии жалоб кардиального характера и динамики электрокардиографических показателей.

Изобретение относится к медицине и описывает способ получения тест-объекта для оценки цитотоксичности лекарственных средств, включающий использование роговицы эмбриональных цыплят и клеточной технологии, причем выделяют роговицу эмбрионов цыплят 7-14 дней гестации, которую измельчают и замораживают в парах жидкого азота до -180°С, при оценке цитотоксичности лекарственных средств замороженный материал подвергают медленной разморозке, переносят в центрифужную пробирку и трехкратно отмывают в растворе NaCl 0,9%, а затем измельчают клеточные элементы до получения гомогенной клеточной суспензии, осаждают строму в центрифуге, надосадок, содержащий клетки роговицы, переносят в стерильную пробирку и вновь осаждают клетки, супернатант удаляют, а к осадку, содержащему роговичные клетки, добавляют 1 мл раствора NaCl 0,9% и ресуспендируют, в полученной суспензии считают цитоз и определяют жизнеспособность клеток по окрашиванию их ДНК-флуорохромами на проточном цитофлюориметре, затем раствором NaCl 0,9% суспензию клеток роговицы доводят до концентрации 5,0·105 клеток в 1 мл и переносят в культуральные флаконы и добавляют исследуемые препараты, для контроля в один из флаконов добавляют NaCl 0,9%, дальнейшую инкубацию проводят в культуральных флаконах в СO2 инкубаторе в течение суток, далее суспензии клеток переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют для осаждения клеток и отбирают по 1 мл суспензии каждого опыта для исследования цитотоксичности по окрашиванию клеток ДНК-флуорохромами, цитотоксичность исследуемых веществ оценивают на проточном цитофлюориметре.

Изобретение относится к аналитической химии применительно к экспресс-анализу лекарственных препаратов, преимущественно для обнаружения и количественного определения активнодействующего вещества.

Изобретение относится к области аналитической химии и может быть использовано в контрольно-аналитических, клинических лабораториях для определения концентрации цефалоспориновых антибиотиков.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к исследованию рецептору, сопряженному с G-белком, и может быть использовано в медицине. .

Изобретение относится к фармацевтической химии и может быть использовано для количественного определения антиоксиданта коэнзима Q10 в субстанции. .

Изобретение относится к диагностике, в частности к способу количественного определения цефалоспориновых антибиотиков в жидкости ротовой полости и в цельной крови.

Изобретение относится к аналитической химии и описывает способ кондуктометрического количественного определения гидрохлоридов 5-аминолевулиновой (5-амино-4-оксопентановой) кислоты или ее сложных эфиров, включающий подготовку проб анализируемого вещества, измерение удельной электропроводности растворов, титрование, построение кондуктометрической кривой, определение эквивалентных точек и расчет содержания основного вещества, при этом титрование образцов гидрохлоридов 5-аминолевулиновой кислоты или ее сложных эфиров осуществляют титрованием раствором нитрата серебра, а расчет содержания основного вещества в гидрохлоридах 5-аминолевулиновой кислоты или ее сложных эфиров проводят по формуле.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях для стандартизации и контроля качества лекарственных средств.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано в контрольно-аналитических лабораториях для стандартизации и контроля качества лекарственных средств.

Изобретение относится к медицине и описывает способ определения содержания озона в озонированной перфторуглеродной эмульсии путем фотометрического измерения количества йода, выделяющегося в результате воздействия озона озонированной эмульсии на раствор йодистого калия с крахмалом, где перед проведением определения предварительно готовят реакционный раствор, содержащий йодистый калий и крахмал, из которого приготовляются подготовительный анализируемый и подготовительные калибровочные растворы, содержащие одинаковое количество йодистого калия и крахмала; к подготовительному анализируемому раствору приливается определенный объем озонированного перфторана, а к подготовительным калибровочным растворам последовательно добавляются такой же объем неозонированного перфторана и титрованный раствор йода в йодистом калии в количестве, необходимом для построения калибровочного графика; приготовленные растворы оставляют стоять в защищенном от света месте при температуре 20°С; растворы фотометрируют на фотоколориметре или спектрофотометре на длине волны 610 нм, следя за ходом изменения оптической плотности во времени до момента совпадения хода кривых калибровочных и исследуемого растворов; строят калибровочный график и вычисляют содержание озона в анализируемой эмульсии
Наверх